Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-30T13:02:59Z No. of bitstreams: 1 cp108652.pdf: 3211869 bytes, checksum: 99fdf86f3617cb57359337d87c540797 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-30T13:03:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp108652.pdf: 3211869 bytes, checksum: 99fdf86f3617cb57359337d87c540797 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T13:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp108652.pdf: 3211869 bytes, checksum: 99fdf86f3617cb57359337d87c540797 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / FAPESP: 04/14434-3

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

Os micro-organismos podem infectar seu hospedeiro por diferentes vias, sendo a principal o trato respiratório. O reconhecimento pela mucosa dessas vias pode desencadear inibição da proliferação e bloqueio da entrada microbiana, assim como estimular resposta direcionada a memória imunológica para prevenir posteriores infecções. Alguns micro-organismo, como as bactérias Neisseria meningitidis e Neisseria lactamica, são capazes de modular a resposta imune de mucosa diretamente, ou por meio das células epiteliais respiratórias. Este trabalho propôs, então, a avaliação das porinas B provenientes destas bactérias como moduladoras da produção de IL-8 nas linhagens BEAS-2B e Detroit 562. Também foi avaliada a dependência deste estímulo ao receptor TLR2. Ambas as porinas se ligaram a TLR2 e por este receptor estimularam a produção de IL-8. O perfil de produção foi dependente da expressão de TLR2 pelas células. A porina lactâmica induziu menos IL-8 por regular negativamente a expressão de TLR2, mas sua afinidade pelo receptor se mostrou maior que a da porina meningocócica. As porinas são então moduladoras das células de mucosa, fato que somado a atividade adjuvante destas proteínas por via parenteral estimulou a avaliação destas como adjuvantes de mucosa. O modelo escolhido para a avaliação foi o de inoculação intranasal de camundongos, utilizando como antígeno o lipopolissacarídio pouco imunogênico de Franciscella tularensis atenuada (Ft-LPS). A análise foi baseada no título de anticorpos IgG e IgM séricos. A porina meningocócica se mostrou a mais imunogênica, mas por ser originária de patógeno acarreta maior risco biológico em sua produção. Para viabilizar a porina meningocócica como adjuvante, a mesma foi substituída por porina homóloga produzida de modo recombinante em Escherichia coli não patogênica. A porina recombinante foi avaliada pelo mesmo sistema in vivo e comparada a adjuvantes experimentais de ação conhecida (rCTB, QS-21 e ODN 1826). A porina apresentou o melhor desempenho entre todos os adjuvantes, principalmente dois meses após o fim do esquema vacinal. O mesmo adjuvante foi adicionado ao vírus da raiva para caracterizar a amplitude de antígenos para sua aplicação e o efeito biológico dos anticorpos induzidos. Os resultados obtidos por via intranasal com antígeno da raiva confirmaram a propriedade de adjuvante de mucosa da porina recombinante, aumentando os títulos de IgG séricos. O ensaio biológico dos anticorpos por RFFIT comprovaram a funcionalidade dos anticorpos gerados, neutralizando a infectividade viral em células BHK-21. O uso da porina por via subcutânea não aumentou o nível de anticorpos neutralizantes, mas aumentou o de IgG. Não foi detectada imunidade celular específica de linfócitos do baço ao vírus da raiva nos parâmetros avaliados, independente da adição de adjuvantes. Em resumo, as porinas foram caracterizadas como relevantes na imunomodulação de células da mucosa respiratória por infecção meningocócica. A modulação também foi relevante para o aumento de resposta humoral frente a diferentes antígenos, por diferentes vias de administração, o que demonstra a eficiência e versatilidade da porina recombinante como adjuvante imunológico. / Microorganisms can invade the host through many routes, specially the respiratory tract. The respiratory mucosa is responsible for recognition, inhibition, proliferation and entry blockade of microorganisms, besides incitation of immunological memory to prevent further infections. Some microorganisms, such as Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica, can modulate the mucosa immune response directly or through stimulation of respiratory epithelial cells. The present work proposed the evaluation of porin B proteins, derived from these microorganisms, as modulators of IL-8 production on respiratory epithelial cell strains BEAS-2B and Detroit 562. TLR2 receptor dependency for the modulation was also evaluated. Both porins bounded to TLR2 and through this receptor were able to stimulate IL-8 production, whereas this profile was correlated with TLR2 expression. Lactamica porin (Nlac PorB) induced less IL-8 and TLR2 expression, also for a shorter period of time. The effect caused by Nlac PorB was attributed to TLR2 down regulated expression, since its binding affinity to the receptor is greater than meningococcal porin (Nmen PorB). Porins were therefore able to immune modulate mucosal cells, fact that allied with their parenteral adjuvant activity incited evaluation of porins as potential mucosal adjuvants. The model chosen for the evaluation was intranasal immunization of mice, using as the antigen a low immunogenic lipopolysaccharide extracted from attenuated Franciscella tularensis (Ft-LPS). The evaluation was based on IgG and IgM serum titers. After the immunization scheme, Nmen PorB induced higher IgG and IgM titers than Nlac PorB. Although Nmen PorB was more efficient, it comes from a pathogen. To overcome the risk of its production, it was replaced by recombinant porin (rPorB) produced by Escherichia coli. rPorB was evaluated by the same model and compared with well known experimental adjuvants (rCTB, QS-21 e ODN 1826). rPoB had the highest IgM and IgG titers among all adjuvants tested, specially two months after vaccination. The same adjuvant was also combined with a viral antigen to characterize its application wideness and biological function of incited antibodies. Results obtained with rabies antigen by intranasal route confirmed the mucosal adjuvant properties of rPorB, increasing IgG titers induced by the antigen. These antibodies were also capable of virus neutralization, as demonstrated in RFFIT assays. rPoB didn´t raise neutralizing antibody titers by subcutaneous route, but increased IgG titers. Cellular immunity was undetectable in spleen lymphocytes with the screening method used, regardless of adjuvant addition. In conclusion, porins were characterized as revelant for immunomodulation of the respiratory mucosal cells, caused by infection with meningococcus. The immunomodulation was also revelant for increase of humoral reponse to different antigens and by different routes, pointing out recombinant porin B as an efficient and versatile immunological adjuvant.

Os micro-organismos podem infectar seu hospedeiro por diferentes vias, sendo a principal o trato respiratório. O reconhecimento pela mucosa dessas vias pode desencadear inibição da proliferação e bloqueio da entrada microbiana, assim como estimular resposta direcionada a memória imunológica para prevenir posteriores infecções. Alguns micro-organismo, como as bactérias Neisseria meningitidis e Neisseria lactamica, são capazes de modular a resposta imune de mucosa diretamente, ou por meio das células epiteliais respiratórias. Este trabalho propôs, então, a avaliação das porinas B provenientes destas bactérias como moduladoras da produção de IL-8 nas linhagens BEAS-2B e Detroit 562. Também foi avaliada a dependência deste estímulo ao receptor TLR2. Ambas as porinas se ligaram a TLR2 e por este receptor estimularam a produção de IL-8. O perfil de produção foi dependente da expressão de TLR2 pelas células. A porina lactâmica induziu menos IL-8 por regular negativamente a expressão de TLR2, mas sua afinidade pelo receptor se mostrou maior que a da porina meningocócica. As porinas são então moduladoras das células de mucosa, fato que somado a atividade adjuvante destas proteínas por via parenteral estimulou a avaliação destas como adjuvantes de mucosa. O modelo escolhido para a avaliação foi o de inoculação intranasal de camundongos, utilizando como antígeno o lipopolissacarídio pouco imunogênico de Franciscella tularensis atenuada (Ft-LPS). A análise foi baseada no título de anticorpos IgG e IgM séricos. A porina meningocócica se mostrou a mais imunogênica, mas por ser originária de patógeno acarreta maior risco biológico em sua produção. Para viabilizar a porina meningocócica como adjuvante, a mesma foi substituída por porina homóloga produzida de modo recombinante em Escherichia coli não patogênica. A porina recombinante foi avaliada pelo mesmo sistema in vivo e comparada a adjuvantes experimentais de ação conhecida (rCTB, QS-21 e ODN 1826). A porina apresentou o melhor desempenho entre todos os adjuvantes, principalmente dois meses após o fim do esquema vacinal. O mesmo adjuvante foi adicionado ao vírus da raiva para caracterizar a amplitude de antígenos para sua aplicação e o efeito biológico dos anticorpos induzidos. Os resultados obtidos por via intranasal com antígeno da raiva confirmaram a propriedade de adjuvante de mucosa da porina recombinante, aumentando os títulos de IgG séricos. O ensaio biológico dos anticorpos por RFFIT comprovaram a funcionalidade dos anticorpos gerados, neutralizando a infectividade viral em células BHK-21. O uso da porina por via subcutânea não aumentou o nível de anticorpos neutralizantes, mas aumentou o de IgG. Não foi detectada imunidade celular específica de linfócitos do baço ao vírus da raiva nos parâmetros avaliados, independente da adição de adjuvantes. Em resumo, as porinas foram caracterizadas como relevantes na imunomodulação de células da mucosa respiratória por infecção meningocócica. A modulação também foi relevante para o aumento de resposta humoral frente a diferentes antígenos, por diferentes vias de administração, o que demonstra a eficiência e versatilidade da porina recombinante como adjuvante imunológico. / Microorganisms can invade the host through many routes, specially the respiratory tract. The respiratory mucosa is responsible for recognition, inhibition, proliferation and entry blockade of microorganisms, besides incitation of immunological memory to prevent further infections. Some microorganisms, such as Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica, can modulate the mucosa immune response directly or through stimulation of respiratory epithelial cells. The present work proposed the evaluation of porin B proteins, derived from these microorganisms, as modulators of IL-8 production on respiratory epithelial cell strains BEAS-2B and Detroit 562. TLR2 receptor dependency for the modulation was also evaluated. Both porins bounded to TLR2 and through this receptor were able to stimulate IL-8 production, whereas this profile was correlated with TLR2 expression. Lactamica porin (Nlac PorB) induced less IL-8 and TLR2 expression, also for a shorter period of time. The effect caused by Nlac PorB was attributed to TLR2 down regulated expression, since its binding affinity to the receptor is greater than meningococcal porin (Nmen PorB). Porins were therefore able to immune modulate mucosal cells, fact that allied with their parenteral adjuvant activity incited evaluation of porins as potential mucosal adjuvants. The model chosen for the evaluation was intranasal immunization of mice, using as the antigen a low immunogenic lipopolysaccharide extracted from attenuated Franciscella tularensis (Ft-LPS). The evaluation was based on IgG and IgM serum titers. After the immunization scheme, Nmen PorB induced higher IgG and IgM titers than Nlac PorB. Although Nmen PorB was more efficient, it comes from a pathogen. To overcome the risk of its production, it was replaced by recombinant porin (rPorB) produced by Escherichia coli. rPorB was evaluated by the same model and compared with well known experimental adjuvants (rCTB, QS-21 e ODN 1826). rPoB had the highest IgM and IgG titers among all adjuvants tested, specially two months after vaccination. The same adjuvant was also combined with a viral antigen to characterize its application wideness and biological function of incited antibodies. Results obtained with rabies antigen by intranasal route confirmed the mucosal adjuvant properties of rPorB, increasing IgG titers induced by the antigen. These antibodies were also capable of virus neutralization, as demonstrated in RFFIT assays. rPoB didn´t raise neutralizing antibody titers by subcutaneous route, but increased IgG titers. Cellular immunity was undetectable in spleen lymphocytes with the screening method used, regardless of adjuvant addition. In conclusion, porins were characterized as revelant for immunomodulation of the respiratory mucosal cells, caused by infection with meningococcus. The immunomodulation was also revelant for increase of humoral reponse to different antigens and by different routes, pointing out recombinant porin B as an efficient and versatile immunological adjuvant.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-04T14:54:05Z No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As bactérias Gram-negativas não fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, estão amplamente disseminadas no ambiente e estão cada vez mais associados a infecções nosocomiais graves. O uso extensivo e indiscriminado de antibióticos tem contribuído para um aumento do número de infecções causadas por A. baumannii e P. aeruginosa resistentes a uma grande variedade de agentes antimicrobianos, incluindo β-lactâmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar características fisiológicas e moleculares da resistência aos carbapenêmicos em P. aeruginosa e A. baumannii isolados em um hospital terciário. A partir de estudos com amostras clínicas de pacientes admitidos num hospital terciário foram isolados, em 2012, A. baumannii (n=44) e P. aeruginosa (n=28) resistentes aos carbapenêmicos e em 2013, P. aeruginosa (n=19) e A. baumannii (n=44) com igual fenótipo. As amostras bacterianas recuperadas em 2012 foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 e blaOXA-143 foram testados por PCR. A partir das linhagens isoladas no estudo de 2013, testes fisiológicos foram realizados para avaliar a atividade hemolítica, estresse oxidativo, tolerância aos biocidas, formação de biofilme e determinação da resistência aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA e blaNDM-1), sistemas de efluxo (adeB, mexB, mexD, mexF e mexY) e perda de porina (oprD) foram pesquisados por PCR. Foram analisados dados epidemiológicos de todos os pacientes avaliados. No estudo de 2012, a polimixina B foi a única droga eficaz para todos os isolados. Os marcadores genéticos foram observados apenas em isolados de Acinetobacter. O genótipo mais frequente observado foi blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), seguido por blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). Os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 não foram detectados. Uma elevada taxa de mortalidade foi observada (> 70%) entre os pacientes. No estudo de 2013, idade avançada, predomínio de indivíduos internados em UTI, uso de dispositivos médicos invasivos, como cateter venoso, tratamento anterior com fluoroquinolonas ou ß-lactâmicos em combinação com um inibidor da β-lactamase e estadia prolongada no hospital foram fatores predisponentes para infecção por estes microrganismos. Colistina demonstrou atividade, in vitro, contra todas as amostras bacterianas avaliadas. Tigeciclina foi também efetiva para linhagens de A. baumannii. P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos não foi capaz de produzir hemolisinas. Essas linhagens foram menos tolerantes ao estresse oxidativo e alguns biocidas, mas mostraram um aumento da capacidade de formação de biofilme em relação aos isolados sensíveis. Os principais mecanismos de resistência presentes em linhagens de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foi síntese de oxacilinases (OXA-23, OXA-51 e OXA-143), ausência de oprD e presença de bomba de efluxo (AdeABC). Em P. aeruginosa foram encontrados genes para bombas de efluxo (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM), blaSPM-1, além de ausência de oprD. Estes resultados confirmam a dificuldade de manejo terapêutico de pacientes com infecções associadas a microrganismos multirresistentes, com impacto direto na mortalidade e controle epidemiológico dessas linhagens nos centros de saúde. / The non-fermenting Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are widespread in the environment and are increasingly associated with severe nosocomial infections. Extensive and indiscriminate use of antibiotics has contributed to an increased number of infections caused by A. baumannii and P. aeruginosa that are resistant to a wide variety of antimicrobials, including β-lactams. This study aimed to evaluate physiological and molecular characteristics of carbapenem resistance in P. aeruginosa and A. baumannii. From studies with clinical samples from patients admitted to a tertiary hospital, were isolated in 2012 A. baumannii (n=44) and P. aeruginosa (n=28) resistant to carbapenems and in 2013, P. aeruginosa (n=19) and A. baumannii (n=44) with similar phenotype. The bacterial samples recovered in 2012 were submitted to antibiotic susceptibility testing. Genetic markers related to β-lactamases synthesis blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 and blaOXA-143 were screened by PCR. From strains recovered in the 2013 study, physiological tests were performed to evaluate hemolytic activity, oxidative stress, biocides tolerance and biofilm formation, besides determination of antimicrobial resistance patterns. Genetic markers related to β-lactamases synthesis (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA and blaNDM-1), efflux systems (adeB, mexB, mexD, mexF and mexY) and loss of porin (oprD) were screened by PCR. Epidemiological data about all of these patients were analyzed. In the 2012 study, polymyxin B was the only effective drug for all isolates. Genetic markers were observed only in Acinetobacter isolates. The most frequent genotype observed was blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), followed by blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). The genes blaOXA-24 and blaOXA-58 were not detected. High mortality rate (> 70%) between the pacients was observed. In a prospective study, advanced age, predominance of individuals hospitalized in ICU, use of invasive medical devices, such as venous catheter, previous treatment with fluoroquinolones or β-lactams in combination with β-lactamase inhibitor and prolonged stay in hospital were predisposing factors for infection by these microorganisms. Colistin has shown activity, in vitro, against all assessed bacterial samples. Tigecycline was also effective for strains of A. baumannii. Carbapenem-resistant P. aeruginosa was not able to produce hemolysin. These strains were less tolerant to oxidative stress and some biocides, but they showed increased ability of biofilm formation in relation to susceptible isolates. The major mechanisms of carbapenems resistance present in A. baumannii strains was oxacilinases synthesis (OXA-23, OXA-51 and OXA-143), oprD absence and efflux pump presence (AdeABC). In P. aeruginosa was found genes encoding efflux pumps (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM) and blaSPM-1; besides oprD absence. These results confirm the difficulty of therapeutic management of patients with infections associated with multidrug resistant microorganisms, with direct impact on mortality and epidemiological control of multidrug-resistant strains in health centers.

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.