Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338959.pdf: 2630801 bytes, checksum: 1fe313f811f3f373047ae5985be6a34f (MD5) Previous issue date: 2015 / As abelhas são conhecidas por suas ferroadas e produção melífera, mas raramente são reconhecidas por uma determinada proteína benevolente em seu veneno chamada melitina. A melitina é um peptídeo hemolítico antimicrobiano amplamente conhecido pelos seus efeitos terapêuticos. O interesse nas propriedades medicinais, especialmente na propriedade anticancerígena da melitina, tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Porém, visto que alguns dos constituintes do veneno de abelha podem apresentar ação deletéria, decorrente do seu potencial alergênico, faz-se necessária a obtenção de melitina com elevado grau de pureza para eficiente aplicação na área farmacêutica. O presente trabalho teve o objetivo principal de desenvolver um processo para obtenção de melitina em escala analítica visando a aplicação deste peptídeo em formulações farmacêuticas, produzindo, desta forma, produtos com elevada tecnologia e valor agregado. A utilização de técnicas robustas, como ultracentrifugação e filtração, permitiu eliminar a maioria dos componentes presentes no veneno, contendo, ao final, somente biomoléculas com propriedades físico-químicas semelhantes à melitina. A utilização destas técnicas, em conjunto com RP-HPLC, permitiu obter melitina com um alto grau de pureza em escala analítica. Dessa forma, foi elaborado um protocolo de purificação da melitina, alcançando-se uma pureza estimada maior que 85 %. A análise econômica do processo de purificação da melitina demonstrou a viabilidade econômica na implantação desta tecnologia. O menor custo específico ocorre com a ampliação da escala a partir de 100 vezes a escala analítica, no qual o custo encontrado, nas condições operacionais propostas, é inferior ao aplicado atualmente. Ainda, é possível otimizar o processo visando melhor rendimento. A elaboração de um sistema de entrega controlada da melitina a partir de nanopartículas lipídicas sólidas foi proposta neste trabalho. Os resultados obtidos até o momento mostram que é possível obter NLSs estáveis de ácido esteárico com potencial aplicabilidade para encapsulação de melitina. Para a comprovação de eficiência farmacológica desse sistema proposto, uma avaliação adequada é necessária.<br> / Abstract : Honeybees are famous for their stings and sugary residues, yet seldom do they gain recognition for a certain benevolent protein in their venom called melittin. Melittin is an antimicrobial hemolytic peptide widely known for its therapeutic remedies. Interest in the medicinal properties, especially the anticancer property of melittin, has increased tremendously in recent years. However, since some of bee venom constituents can have deleterious effects, because of its allergenic potential, it is necessary to obtain melittin with high purity for its effective application in the pharmaceutical field. This study had the main objective to develop a process for obtaining melittin in analytical scale aiming the pharmaceutical application of this peptide, producing thus products with high technology and added value. The use of robust techniques such as ultracentrifugation and filtration allowed to eliminate most of the components present in the venom, remaining in the sample after these steps, only biomolecules with similar features to melittin. The use of these techniques in conjunction with RP-HPLC allowed obtaining melittin with a high degree of purity on an analytical scale. Thus, we designed a purification protocol for melittin, achieving an estimated purity greater than 85 %. The economic analysis of the melittin purification process showed the economic viability of the implementation of this technology. The lower specific costs occur with the scale-up from 100 times the analytical scale, in which the costs found within the operating conditions proposed are lower than those currently marketed. It is still possible to optimize the process to better performance. The development of a delivery vehicle of melittin based on solid lipid nanoparticles was proposed in this paper. The results obtained so far show that it is possible to obtain stable NLSs of stearic acid with potential applicability for encapsulation of melittin. For demonstrating pharmacological effectiveness of this proposed system, more tests are needed.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:52:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015 / Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.<br> / Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-31T04:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339614.pdf: 2590718 bytes, checksum: 1167194006e4630cfa0a4984aba90e64 (MD5) Previous issue date: 2015 / As proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina/treonina cinases ativadas por fosforilação em resposta a sinais extracelulares que incluem ERK 1/2, JNK p54/p46 e p38MAPK. No sistema nervoso central (SNC) estas enzimas medeiam eventos associados ao desenvolvimento e neuroplasticidade. No período inicial do desenvolvimento pós-natal ocorrem alterações significativas na estrutura do cérebro e sinalização intracelular. No hipocampo de roedores as MAPKs têm sido apontadas como proteínas fundamentais na modulação do desenvolvimento neural e plasticidade sináptica. Apesar dessas evidências a ontogenia pós-natal das MAPKs em estruturas específicas, bem como o seu papel, em determinadas fases do desenvolvimento, para o estabelecimento de funções motoras e cognitivas no adulto tem sido pouco caracterizada. A compreensão do padrão de ativação das MAPKs durante o neurodesenvolvimento é essencial, uma vez que pequenas alterações na atividade dessas proteínas em janelas específicas do desenvolvimento podem implicar em alterações funcionais tardias. No presente estudo foi determinado, em uma primeira etapa, o perfil ontogenético da fosforilação e conteúdo total das MAPKs no hipocampo de ratos Wistar machos durante o período pós-natal (PN) 1-60. Para isso a fosforilação e o conteúdo total das MAPKs foram avaliados por western blotting nas idades: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 e PN60. Os resultados foram expressos como percentual relativo à PN1 e demonstraram: (1) aumento significativo na fosforilação de p38MAPK de forma bimodal em PN4 e PN10-60; (2) aumento na fosforilação de ERK1 (PN4) e ERK2 (PN14) dependente da idade; (3) variação do conteúdo total de JNKp54 com perfil similar ao da ativação de p38MAPK; 4) ausência de variação na taxa de fosforilação de JNK p54/p46 nas idades analisadas. Em uma segunda etapa foi determinado o papel da atividade de ERK 1/2 durante o desenvolvimento em relação às alterações comportamentais, da estrutura sináptica e na proliferação celular hipocampal na vida adulta do animal. Para isso, foi utilizado um protocolo de inibição de MEK/ERK com U0126 (5 mg/kg; i.p.) durante um período crítico de sinaptogênese (PN7-14). Os resultados mostraram que o tratamento com o U0126 foi efetivo, pois foi observado inibição significativa da fosforilação de ERK 1, avaliada no hipocampo em PN7 e 6 h após a administração do inibidor. Adicionalmente, demonstraram que o tratamento com U0126 em PN7-14, quando comparado ao controle (DMSO 1%), tem consequências relevantes na vida adulta dos animais que incluem: (i) modificações na estrutura sináptica no hipocampo em PN30, com diminuição do diâmetro da densidade pós-sináptica e no número de vesículas no terminal pré-sináptico; (ii) danos permanentes na memória de curta duração; (iii) diminuição na proliferação celular analisado pela quantidade de células positivas para Ki-67 no giro denteado do hipocampo; e (iv) aumento na expressão de GFAP no hipocampo dos ratos quando comparado ao grupo controle (DMSO 1%). Em conjunto os resultados mostram a existência de um perfil específico de atividade das MAPKs durante o desenvolvimento pós-natal de ratos e sugerem que alteração da atividade dessas enzimas, por fatores ambientais diversos, podem acarretar alterações funcionais e estruturais permanentes do SNC.<br> / Abstract : The mitogen-activated protein kinases (MAPK) represent a family of serine/threonine kinases activated by phosphorylation in response to extracellular signals that includes ERK 1/2, JNK p54/p46 and p38MAPK. In the central nervous system (CNS), these enzymes mediate events associated with development and neuroplasticity. The early postnatal development is characterized by significant changes in brain structure, and intracellular signaling. In the hippocampus of rodents MAPKs have been identified as key proteins in the modulation of neural development and synaptic plasticity. Despite these evidences, studies characterizing the postnatal ontogeny of MAPKs in specific structures in the early periods of postnatal development in rodents are scarce. Thus, understanding the pattern of MAPK activation during brain development is critical, since minor changes in the activity of these proteins in specific developmental windows can result in later functional disorders. Accordingly, our study initially determined the profile of phosphorylation and total content of MAPKs in the hippocampus of male Wistar rats during the postnatal period (PN) 1-60. In order to target this aim MAPKs were evaluated by western blotting at ages: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 and PN60. The results were expressed as percentage related to PN1 and demonstrated: (1) significant increment in phosphorylation of p38MAPK displayed in two peaks one PN4 and a second at PN10-60; (2) age dependent increase in the phosphorylation of ERK1 (PN4) and ERK2 (PN14); (3) change in the total content JNKp54 with similar profile to that of p38MAPK activation; (4) no variation in the content of JNKp46 nether in the rate of phosphorylation of JNK p54/p46 in the ages analyzed. In a second stage we determined the role of ERK 1/2 activity during development regarding changes in synaptic structure, behavioral and cellular proliferation in the adult life. For this, rats were treated in the developmental period PN7-14 with the MEK/ERK inhibitor U0126 (5 mg/kg; ip). The results showed that the treatment with U0126 was effective, since it was detected a significant inhibition of ERK 1 phosphorylation, evaluated at PN7 and 6 h after the administration of the inhibitor. Moreover, the results demonstrated that the treatment with U0126 at PN7-14, as compared to the control (DMSO 1%), bring consequences for adulthood that include: (i) changes in hippocampal synaptic structure at PN30, decreasing the diameter of postsynaptic density and the number of vesicles in the presynaptic terminal; (ii) permanent damage in short term memory; (iii) a decrease in cell proliferation assessed by the number of cells positive for Ki-67 in the dentate gyrus of the hippocampus); and (iv) increased expression of GFAP in the hippocampus of rats compared with the control group (1% DMSO). Taken together the results show a specific profile of MAPKs activity during the postnatal development of rats and suggest that alteration of the activity of these enzymes by environmental factors may cause permanent functional changes in the CNS.