Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T13:16:58Z No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T13:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas. Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H. capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos corporais. Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados, entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos. A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e interações com os anticorpos. Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no diagnóstico da histoplasmose. / Histoplasmosis is caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Infection with this organism is often diagnosed by determining the presence of antibody to the immunodominant M antigen, but the role of the M antigen in the pathogenesis of histoplasmosis has previously not been elucidated. The function of the M protein is not known, but genetically it is homologous to fungal catalases. In our work, we sought to determine immunodominant regions of the M antigen, create a monoclonal antibodies panel, characterize them, use them for epitope mapping, show that the M antigen was located on the cell surface of H. capsulatum yeasts, demonstrate the catalase activity of the protein and developed an immunoassay to detect antibodies against this protein and another one to detect the circulating M antigen in body fluids. We could determine the peptides that have the most antigenic activity and their localization on the molecule, and characterize according to biochemical properties. We generated three fragments containing these peptides and used to evaluate the monoclonal antibodies binding and recognition to each fragment. We could see that one fragment, the F3, showed more binding to the mAbs than the other two, but additional studies have to be done to complete the epitope mapping. To evaluate the role of the M antigen on the pathognesis of histoplasmosis, using Western blot analysis of a detergent extract of cell walls and cell membranes (CW/M) from yeast cells, we found that mAbs generated to recombinant M antigen reacted with the CW/M preparations. Immunofluorescence studies also revealed that the mAbs to the M antigen labeled the yeast cell surface. Also, we assayed the catalase activity using different cell extract fractions for the localization of the enzyme and confirmed that the major activity was present in extracts including fungal surface antigens. The ability of the M antigen to function as a catalase suggests that this enzyme is probably involved in protecting the yeast cells against the oxidative stress within the phagolisossome and escaping of the fungicidal mechanisms in the macrophages. Localization of the M antigen to the cell surface of Hc has important implications for the antigenicity of the protein since it demonstrates that it is accessible to host immune cells and for antibody interactions. Also, the ELISA for antibody detection using purified and treated histoplasmin (ptHMIN) showed a sensitivity of 92% and a specificity of 96%, while the ELISA for antigen detection showed a sensitivity of 80% and a specificity of 91%, proving that these two methodologies could be used in the diagnosis of histoplasmosis.

Strangles is considered the main respiratory disease in horses. The etiologic agent is the bacterium Streptococcus equi subsp. equi (S. equi), responsible for approximately 30% of horse diseases worldwide notifications. The clinical signs of strangles are fever, nasal secretion and lymph node enlargement. The last one occurs due the incomplete phagocytosis of S. equi by defense cells because bacterial hyaluronic acid capsule and M protein (SeM). The epidemiology, the risk factors and the strangles control are poorly understood. The 5' end of the seM gene sequence has been used for isolate differentiation by characterization of the alleles. Therefore, this thesis aimed to study the prevalence of Streptococcus equi subsp. equi (S. equi) in healthy horses, the alleles frequency and the risk factors involved on equine adenitis. One thousand and ten nasal swabs were obtained from healthy horses from 341 farms. Twenty four horses were positive for S. equi, confirmed by PCR and DNA sequencing. The prevalence of S. equi per equine was 2.37%, and 20 farms were positive (5.86%). Risk factor analysis showed by confirming and quantifying statistically that: the number of agglomeration events that horses participate (RR: 1.6), the situation with food container shared (RR: 3.74) and the positive diagnosis for adenitis (RR: 3.20) are significant risk factors for Strangles. These results provide important epidemiological contribution to the equine industry and can give support for the disease control. In addition, the 5 'end of the gene seM was amplified by PCR and sequenced and allele characterized. It was found the same allele (SEM-61) in all the samples. These results support the hypothesis of natural selection of alleles apparently more suited to survive, persist and perpetuate in the population studied. / A adenite equina é uma doença infecto-contagiosa que acomete o trato respiratório superior, sendo uma das principais doenças respiratórias de equinos. O agente etiológico dessa enfermidade é o Streptococcus equi subespécie equi (S. equi), responsável por aproximadamente 30% das notificações em todo o mundo. Os principais sinais clínicos da adenite são febre, secreção nasal e enfartamento de linfonodos, que ocorre pela dificuldade de fagocitose do S. equi por células de defesa devido a presença da cápsula de ácido hialurônico e proteína M. O entendimento sobre a epidemiologia, a análise de fatores de risco para adenite equina e o controle dessa enfermidade ainda são limitados. Estudos moleculares demonstram diferenças na extremidade 5 da sequência do gene (seM) codificador da proteína M de S. equi. Esta região do gene já foi utilizada na diferenciação de isolados por meio da caracterização de diferentes alelos. Por tudo isso, essa tese objetivou obter resultados de prevalência, e também análise de fatores de risco para adenite equina através de um desenho experimental para coleta de suabes nasais. Foram obtidos 1.010 suabes nasais de equinos sadios em 341 fazendas, de onde foram identificados 24 equinos positivos para S. equi em isolamento, que posteriormente foram confirmados por PCR e sequenciamento de DNA. A prevalência estimada por equino foi de 2.37%, e 20 fazendas foram consideradas positivas (5.86%). Na análise de fatores de risco, foi comprovado e quantificado estatisticamente que: número de eventos de aglomeração que os equinos participam (RR:1.06), o ato de compartilhar recipiente de alimento (RR:3.74) e ter tido diagnóstico positivo para adenite (RR:3.20) são fatores de risco relevantes para adenite equina. Estes resultados oferecem contribuições epidemiológicas importantes para a indústria de equinos e pode apoiar o controle da doença. Em paralelo, a região 5 terminal do gene seM das 24 amostras positivas foi amplificada por PCR e sequenciada para caracterização de alelos, sendo identificado o mesmo alelo (seM-61) em todas as amostras. Esses resultados evidenciam a hipótese de seleção natural de alelos aparentemente mais adaptados a sobreviver, persistir e se perpetuar na população estudada.

Strangles is an equine infectious disease that affects the upper respiratory tract, being considered the main respiratory disease in horses. The etiologic agent is Streptococcus equi subsp. equi (S. equi), responsible for approximately 30% of horse diseases worldwide notifications. The clinical signs of strangles are fever, nasal secretion and lymph node enlargement. The last one occurs due the incomplete phagocytosis of S. equi by defense cells because the presence of hyaluronic acid capsule and M protein (SeM) on the bacteria. The understanding of strangles epidemiology and its control is still limited. Molecular studies demonstrate differences in the gene sequence that codify the N-terminal region of the M protein (SeM) of S. equi. This gene region was already used in the differentiation of isolates by characterization of different alleles. This thesis aims to analyze and differentiate 47 S. equi isolates from equine clinical specimens from southern Brazil (15 Thoroughbred horses, 29 animals from the Crioula breed and three Brasileiro de Hipismo) through phylogenetic analysis and differentiation of alleles based on sequencing of the N-terminal region of the SeM protein. Samples were obtained from 31 outbreaks in 20 premises. Fifteen alleles were identified being only one (allele 9), with 7 isolates (14.9%), was already available in the PubMLST-SeM database (allele 61). Among the new identified alleles, the number 1 was the most prevalent with 13 isolates (27.7%), followed by allele 3 with 10 isolates (21.3%). The results demonstrate the great diversity of the amino acid sequence among the S. equi isolates from the studied equine population. Therefore the N-terminal sequence of SeM gene of the S. equi isolates is a useful tool in epidemiological investigation to differentiate isolates in strangles outbreaks with the identification of alleles in horses population, and may represent an alternative for to control the illness with guidance in selecting strains for production of commercial and autogenous vaccines. / A adenite equina é uma doença infecto-contagiosa que acomete o trato respiratório superior, sendo uma das principais doenças respiratórias de equinos. O agente etiológico dessa enfermidade é o Streptococcus equi subespécie equi (S. equi), responsável por aproximadamente 30% das notificações em todo o mundo. Os principais sinais clínicos da adenite são febre, secreção nasal e enfartamento de linfonodos, que ocorre pela dificuldade de fagocitose do S. equi por células de defesa devido a presença da cápsula de ácido hialurônico e proteína M. Somado a isso, o entendimento sobre a epidemiologia e o controle da adenite equina ainda é limitado. Estudos moleculares demonstram diferenças na região N-terminal na sequência do gene codificador da proteína M (SeM) de S. equi. Esta região do gene já foi utilizada na diferenciação de isolados por meio da caracterização de diferentes alelos. Esta dissertação objetivou analisar e diferenciar 47 isolados bacterianos de S. equi provenientes de amostras clínicas de equinos da região sul do Brasil, oriundas de 15 animais Puro Sangue de Corrida (PSC), 29 da raça Crioula e três da raça Brasileiro de Hipismo (BH), por meio de análise filogenética e diferenciação de alelos, com base no sequenciamento da região Nterminal do gene SeM. As amostras foram oriundas de 31 surtos em 20 estabelecimentos de criação. Foram encontrados 15 alelos de SeM, dentre os quais apenas um (alelo 9) já disponível no banco de dados PubMLST-SeM, como alelo 61, com sete isolados (14,9%). Entre os novos alelos identificados, o alelo 1 foi o mais prevalente com 13 isolados (27,7%), seguido pelo alelo 3 com 10 isolados (21,3%). Os resultados demonstram a grande diversidade da proteína M entre os isolados de S. equi na população equina estudada. Portanto, o sequenciamento parcial do gene da proteína M do S. equi é uma ferramenta útil na investigação epidemiológica para a diferenciação de isolados em surtos de adenite equina, com a identificação de alelos em populações de equinos. Além disso, pode representar uma perspectiva para o controle da enfermidade com a orientação na escolha de cepas para confecção de vacinas comerciais e autógenas.