Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-13T13:03:08Z No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti de Arruda Coutinho.pdf: 4647135 bytes, checksum: a250b87f919a5205eb093e027264fbce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T13:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti de Arruda Coutinho.pdf: 4647135 bytes, checksum: a250b87f919a5205eb093e027264fbce (MD5) Previous issue date: 2014-06-11 / Equine infectious anemia (EIA ) is a difficult control disease, characterized by a wide variety of clinical signs that appear in recurring and dynamic cycles. According with Brazilian law, positive animals in the agar gel immunodiffusion (AGID) must be sacrificed, therefore, there is a dependency relationship between diagnosis and disease control. For reasons related with peculiar characteristics of the infection and immune response EIA, this test may not be able to detect newly infected animals. Considering that the IDGA has a decisive role in the fate of the animal tested, we study the possibility of complementing the diagnostic with the ELISA. In this context, in a previous study, we developed the recombinant protein p26 (rp26) from VAIE, produced in yeast Pichia pastoris, aiming their use as antigens in immunoassays . The purpose of the current study was to test this antigen in AGID, ELISA and Western blot, standardize an indirect ELISA (iELISA) using the rp26 protein from equine infectious anemia virus (EIAV) as antigen, and also compare it with the pattern test. In all these immunoassays was identified the functionality of the RP26 antigen. After analyzing 101 AGID - positive sera from animals and 704 AGID - negative at the new iELISA, was observed excellent concordance (kappa=0,9) between tests. The cutoff point (15%) was selected by observing the distribution of the relative values of the optical densities of the samples IDGA -positive and negative. The relative sensitivity and specificity were 97 % and 97,9 %, respectively. The excellent results using the rp26 as antigen in iELISA enables the consideration of a new alternative diagnostic for EIA. / A anemia infecciosa equina (AIE) é uma doença de difícil controle, caracterizada por uma ampla variedade de sinais clínicos que surgem em ciclos recorrentes e dinâmicos. De acordo com a legislação brasileira, animais positivos no exame sorológico Imunodifusão em gel de ágar (IDGA) devem ser sacrificados, existindo, portanto, uma relação de dependência entre o diagnóstico e o controle da doença. Por questões relacionadas às características da infecção e resposta imunológica peculiar à AIE, este teste pode não ser capaz de detectar animais recém-infectados. Tendo em vista que o IDGA tem papel decisivo no destino do animal testado, estuda-se a possibilidade de complementação do diagnóstico com ELISA. Diante deste cenário, em um estudo anterior, foi desenvolvida a proteína p26 recombinante (rp26) do VAIE, produzida na levedura Pichia pastoris, vislumbrando seu uso como antígeno em imunoensaios. A finalidade do atual estudo foi testar o antígeno produzido no IDGA, ELISA e Western blot bem como padronizar um ELISA indireto (iELISA) utilizando a proteína rp26 do vírus da anemia infecciosa equina (VAIE) como antígeno, e ainda compará-lo com o teste padrão IDGA. Em todos os imunoensaios referidos foi possível identificar a funcionalidade da rp26 como antígeno. Após a análise de 101 soros de animais IDGA-positivos e 704 IDGA-negativos no novo iELISA, foi observada uma excelente concordância (kappa=0,9) entre os testes. O ponto de corte (15%) foi selecionado pela observação da distribuição dos valores relativos das densidades ópticas das amostras IDGA-positivas e IDGA-negativas. A sensibilidade e especificidade relativas foram de 97% e 97,9%, respectivamente. Os ótimos resultados encontrados com o uso da rp26 como antígeno no iELISA possibilita a consideração de uma nova alternativa de diagnóstico para AIE.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-13Bitstream added on 2014-06-13T20:35:43Z : No. of bitstreams: 1 pereira_acb_me_sjrp.pdf: 828257 bytes, checksum: de1b44b38dfac1b95be8ef5a683e7543 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O lenho estriado de rupestris ou cascudo (Rupestris stem pitting – RSP), um dos componentes do Complexo do lenho rugoso (“Rugose wood” - RW), é considerado uma das doenças de videira transmitidas por enxertia de grande relevância econômica para a viticultura. O Rupestris stem pitting associated virus – RSPaV foi associado com a doença do lenho estriado ou cascudo, sendo classificado como espécie do gênero Foveavirus, pertencente a família Flexiviridae. No presente trabalho, descrevem-se o sequenciamento do gene da proteína capsidial (CP) de um isolado brasileiro do RSPaV (RSPaV-SP), sua expressão em Escherichia coli, purificação da proteína capsidial recombinante e a produção de anti-soro policlonal em coelho. O sequenciamento do gene resultou em uma seqüência de 780 nucleotídeos e 259 aminoácidos deduzidos com massa molecular estimada de 28 kDa. A análise filogenética, entre a seqüência correspondente à CP do RSPaV-SP e outras variantes do mesmo vírus, evidenciou a formação de 4 grupos distintos, sendo o isolado brasileiro incluído no grupo da variante BS do RSPaV. A proteína capsidial recombinante foi purificada em coluna de afinidade e apresentou massa molecular estimada de 32kDa (4kDa da seqüência do vetor e 28kD da CP do RSPaV-SP). O anti-soro produzido apresentou-se específico na detecção da proteína capsidial recombinante purificada por “Western-blot”, sem reação com proteína heteróloga a partir da diluição 1:4000. Nesta diluição, o anti-soro foi efetivo na detecção do vírus em extratos de plantas infectadas, sendo que nenhuma reação foi observada com extratos de plantas sadias. Considerando-se que este vírus apresenta variações de concentração na planta durante as estações do ano, e que, os testes sorológicos foram realizados durante a estação de baixa concentração do vírus, os resultados... / Rupestris stem pitting (RSP), a component of the rugose wood (RW) complex, is one of the most graft-transmissible grapevine virus diseases with great economic importance for viticulture . Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), genus Foveavirus within the family Flexiviridae, has been associated with this disease. This work reports the sequencing of the coat protein (CP) gene of a brazilian an isolate of RSPaV (RSPaV-SP), its expression in Escherichia coli, purification of the recombinant coat protein and production of a polyclonal antiserum in rabbit. CP gene was found to be 780nt long, with a 256 deduced amino acid sequence encoding a predicted protein of 28 kDa. In filogenetic analysis, with RSPaV-SP and other variants of the virus, four groups were found and the sequence of RSPaV-SP showed the highest identity with the variant RSPaV-BS. The recombinant coat protein was purified by affinity chromatography and showed a molecular weight of 32kDa (4 kDa from a small vector sequence plus 28 kDa for the CP of RSPaV-SP). The antiserum proved specific for detection of the recombinant protein by Western Blot, and did not react with heterologous proteins starting at a dilution of 1:4000. At this dilution, the antiserum was effective in the virus detection of leaf extracts of infected plants and no reaction was observed with extracts from healthy grapevines. Considering that the virus is found at low concentrations in the plants during the seasons of the year, the results obtained so far were highly satisfactory for RSPaV detection. Serological methods have advantages over the biological indexing method, since they are cheaper and can be used in large-scale tests such as ELISA. Experiments using the ELISA technique were not successful. Purification of the native recombinant protein would be an alternative more efective to detect the virus using these technique.