Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) pertencem à superfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores transcricionais. Eles exercem um papel fundamental em processos que envolvem, principalmente, o metabolismo lipídico, em resposta à ativação por ligantes naturais e sintéticos como os ácidos graxos e os fibratos, respectivamente. A crescente descoberta de importantes funções fisiológicas, coordenadas pelos PPARs, e a necessidade de se conhecer como os agonistas, atualmente disponíveis, atuam nesses receptores, têm incitado pesquisas que vislumbram sua melhor exploração nos tratamentos de doenças metabólicas e inflamatórias, minimizando os efeitos adversos de ativações suprafisiológicas. Nesse cenário, o presente trabalho buscou compreender melhor as bases estruturais envolvidas nas funções atribuídas aos PPARs e explicar como as interações com seus ligantes ocorrem. Para isso, foram realizadas a subclonagem do domínio de ligação ao ligante do PPARα, sua expressão e purificação, seguidas de ensaios cristalográficos e biofísicos, além da abordagem de testes funcionais. Uma vez que a formação de oligômeros está relacionada à funcionalidade desses receptores, foram abordados estudos de oligomerização dos PPARs α e γ, compreendendo tanto o processo de homo- quanto o de heterodimerização. Os ensaios de cristalização do hPPARα LBD complexado a ligantes naturais e sintéticos, resultaram em estruturas cristalográficas que permitiram a identificação dos resíduos envolvidos no reconhecimento dos ligantes e a caracterização de sítios de ligação nunca antes descritos. A presença de ligantes nessas regiões afeta a conformação da proteína e, consequentemente, a modulação de sua função e o recrutamento da maquinaria transcricional. Adicionalmente, as estruturas cristalográficas da proteína complexada a ácidos graxos auxiliaram na compreensão de como essa importante classe de ligantes naturais possui efeitos farmacológicos similares aos de ligantes sintéticos. Esses resultados têm imediato impacto na procura racional de agonistas para esses receptores e se inserem em uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de endocrinologia molecular. / The peroxisome proliferation-activated receptors (PPARs) belong to the nuclear receptors superfamily, acting as transcriptional factors. They play a key role in processes involving essentially lipid metabolism in response to activation by natural and synthetic ligands such as fatty acids and fibrates, respectively. The rising discovery of important physiological functions coordinated by PPARs and the necessity to know how the currently available agonists act on these receptors, have encouraged researches envisioning a better receptor exploration in the treatment of metabolic and inflammatory diseases, minimizing the adverse effects of supraphysiological activations. In this scenario, the present study aimed to better understand the structural basis involved in PPARs functions and elucidates how the interactions with their ligands takes place. For this, the ligand-binding domain of PPARα was subjected to subcloning, expression and purification steps, followed by crystallographical and biophysical assays, in addition to functional testing approaches. Since the degree of oligomerization is related to the functionality of these receptors, oligomeric studies of PPARs α and γ oligomerization were also achieved, comprising both homo- and hetero-dimerization. The co-crystallization assays of hPPARα LBD complexed with natural and synthetic ligands resulted in crystallographic structures that allowed the identification of residues involved in ligand recognition and the characterization of novel binding sites. The presence of ligands in these regions affects the conformation of the protein and thereby modulates their function and transcriptional machinery recruitment. Additionally, the crystallographic structures of the protein complexed to fatty acids were valuable for the understanding of how this important class of natural ligands has similar pharmacological effects to those of synthetic ligands. These results have direct impact on rational agonists design to these receptors and are inserted in a perspective of scientifical promotion and technological development in the field of molecular endocrinology.

PINTO, Clidia Eduarda Moreira. Biossegurança alimentar da proteína antifúngica Mo-CBP3 de sementes de Moringa oleifera Lam: uma candidata para o desenvolvimento de plantas transgênicas, Fortaleza - CE, 2014. 119 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-20T12:05:40Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-05-20T12:37:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T12:37:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) Previous issue date: 2014 / Mo-CBP3 is a chitin binding protein purified from Moringa oleifera seeds which has an apparent molecular mass of 18.0 kDa and consists of multiple heterodimeric isoforms. Mo-CBP3 is a highly stable protein that has a broad spectrum of activity against phytopathogenic fungi and maintains its secondary structure and antifungal activity at extreme temperatures and different pH values. Thus, the Mo-CBP3 protein presents itself as a promising tool for the development of transgenic plants resistant to fungi attack. For such purpose, the Mo-CBP3 protein was subjected to food safety tests to ensure the safety of its expression in plants, minimizing the risk to non-target animals, which include human beings. The food safety assessment of the protein followed the two-tiered approach, based on weight of evidences, proposed by International Life Sciences Institute (ILSI). The research evidenced the long history of safe use, supported by scientific literature, of the M. oleifera species, source of Mo-CBP3 protein. In silico analysis did not reveal any identity of Mo-CBP3 with allergenic, toxic and/or antinutritional proteins. Additionally, were not found in the protein potential epitopes able to lead to cross reaction and unleash an allergic response. Identity with allergenic proteins was found only when a window of 80 amino acids was used. Potential sites of N-glycosylation were not found in the mature protein. The protein showed resistance to thermal treatment and digestibility by simulated gastric fluid, but was completely susceptible to digestion in simulated intestinal fluid. In addition, Mo-CBP3 caused no relevant adverse effects to mice subjected to high oral doses from 5 to 2000 mg/kg, showing its innocuous nature. Based on the food safety approach proposed by ILSI is not expected any risk associated to use of Mo-CBP3 protein for humans and other monogastric animals. / Mo¬-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 18,0 kDa, consistindo de múltiplas isoformas heterodiméricas. Mo-CBP3 é uma proteína altamente estável, que possui amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos e mantém sua estrutura secundária e atividade antifúngica em extremos de temperaturas e diferentes valores de pH. Dessa forma, a proteína Mo-CBP3 se apresenta como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque de fungos. Para tanto, Mo-CBP3 foi submetida a testes de biossegurança alimentar, visando garantir sua utilização através da expressão em plantas, minimizando, assim, os riscos para animais não alvo, incluindo o homem. A avaliação de biossegurança alimentar da proteína seguiu o teste de duas etapas, baseado em pesos de evidência, proposto pelo Instituto Internacional de Ciências da Vida (ILSI). A pesquisa evidenciou o longo histórico de uso seguro, fundamentado em dados científicos, da espécie M. oleifera, fonte da proteína Mo-CBP3. Análises in silico mostraram que Mo-CBP3 não possui qualquer identidade com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais. Adicionalmente, não foram encontrados na proteína epítopos potencialmente capazes de promover reação cruzada e desencadear uma resposta alergênica. Identidade com proteínas alergênicas (> 35%) foi encontrada apenas quando uma janela de 80 aminoácidos foi utilizada. Sítios potenciais de N-glicosilação não foram encontrados na proteína madura. A proteína mostrou resistência ao tratamento térmico e à digestibilidade por fluido gástrico simulado, mas foi completamente susceptível à digestão em fluido intestinal simulado. Em adição, Mo-CBP3 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos submetidos a doses elevadas de 5 a 2000 mg/kg, via oral, evidenciando seu caráter inócuo. A partir da avaliação de biossegurança alimentar proposta pelo ILSI não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Mo-CBP3 pelo homem e demais animais monogástricos.

FREIRE, José Ednésio da Cruz. Análise in silico da sequência deduzida de Mo-CBP3, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera LAM. 2013. 116 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-30T12:44:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Moringa oleifera is a tree belonging to the Moringaceae family. This plant is native from India where it is named as drumstick tree. In Brazil M. oleifera was introduced in the 1950’s decade and it is known as moringa. Approximately 40% of the fresh weight of these seeds is formed by proteins, some of which were isolated and characterized as flocculants and antinutritional proteins. In addition, the chitin binding proteins have been identified and isolated, especially among which is the Mo-CBP3, a thermostable glycoprotein of apparent molecular mass of around 14.3 kDa, with potent inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In order to characterize the deduced sequence of Mo-CBP3, moringa fruits were collected 65 days after anthesis and their seeds subjected to extraction of total RNA. cDNA synthesis was directed by ‘5’ RACE’-PCR. The PCR products were subcloned into appropriate vectors (pGEM-T Easy) and then introduced into Escherichia coli cloning host TOP10F'. The recombinant plasmids were purified from transformed bacterial cell and subjected to DNA sequencing. The computational analysis of the deduced protein sequence of Mo-CBP3 showed that this protein has an apparent molecular mass of 12.85 kDa and it is unstable in cytoplasmic conditions. It has derived signal sequences, one for the signal peptide with 30 amino acids, and a sequence at the C-terminus of this protein, related to the anchorage to the plasma membrane as well as the endoplasmic reticulum. Moreover, probable sites of O-glycosylation and phosphorylation were identified. One domain related to the lipid transfer functions, reserve and trypsin inhibitors and alpha-amylase was identified following Mo-CBP3, thereby contributing to the understanding of its potent action against phytopathogenic fungi. / A Moringa oleifera é uma planta pertencente à família Moringaceae. Esta planta é nativa da Índia, sendo lá conhecida como drumstick (baqueta ou bastão de tambor). No Brasil, a M. oleifera foi introduzida na década de 1950, e é conhecida como moringa. Aproximadamente 40% do peso fresco das sementes é composto por proteínas, das quais algumas foram isoladas e caracterizadas como sendo floculantes e proteínas antinutricionais. Em adição, proteínas ligantes à quitina têm sido identificadas e isoladas, destacando-se dentre estas a Mo-CBP3, uma glicoproteína termoestável de massa molecular aparente em torno de 14,3 kDa, com potente atividade inibitória contra fungos fitopatogênicos. A fim caracterizar a sequência deduzida da Mo-CBP3, frutos de moringa foram coletados após 65 dias da antese e suas sementes submetidas à extração de RNA total. A síntese de cDNA foi dirigida por meio da técnica PCR-RACE 5'. Os produtos de PCR foram subclonados em vetores apropriados (pGEM-T Easy) e, em seguida, introduzido em hospedeiro de clonagem Escherichia coli TOP10F'. Os plasmídeos recombinantes foram purificados de células bacterianas transformadas e submetidos ao sequenciamento de DNA. A análise computacional da sequência deduzida da proteína Mo-CBP3 mostrou que esta é uma proteína de massa molecular aparente em torno de 12,85 kDa e, em condições citoplasmáticas apresenta-se instável. Possui sequências sinais deduzidas, sendo uma para peptídeo sinal, com 30 aminoácidos, e uma sequência na região C-terminal relacionada à ancoragem desta proteína à membrana plasmática, bem como ao retículo endoplasmático. Ademais, prováveis sítios de O-glicosilação e de fosforilação foram identificados. Um domínio relacionado às funções de transferência de lipídeos, de reserva e de inibidores de tripsina e de alfa-amilase foi identificado na sequência de Mo-CBP3, contribuindo, desse modo, para o entendimento de sua potente ação contra fungos fitopatogênicos.

Melanoma cutâneo ainda constitui a principal causa de morte por câncer de pele nos países desenvolvidos. A variabilidade do comportamento clínico dessa neoplasia tem sido apenas parcialmente explicada pelos aspectos clínicos e histológicos, e a identificação de variáveis biológicas pode vir a ser importante na determinação de grupos de risco específicos. Foram estudados 69 pacientes com melanoma cutâneo primário de diversos graus de gravidade, tratados entre 1990 e 2007, com o intuito de verificar aspectos clínicos e epidemiológicos, preparar Tissue microarray (TMA) para estudo dos melanomas cutâneos primários com espessura maior que 1,0 mm, avaliar por análise imuno-histoquímica a expressão das proteínas da apoptose celular Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas em nevos-controle e em melanomas primários com espessuras menores e maiores que 1mm, e correlacionar a expressão dessas proteínas da apoptose com a evolução de melanomas cutâneos primários. Os resultados ratificaram tanto dados epidemiológicos já publicados em relação a sexo, idade e local da lesão, quanto a correlação entre a evolução da doença e os índices de Breslow. A análise dos escores compostos relativos à expressão das proteínas da apoptose revelou que o perfil imuno-histoquímico dessas proteínas parece não ter significado prognóstico, uma vez que não houve diferenças de expressão entre pacientes com e sem doença disseminada. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas da apoptose estudadas que pudessem sugerir o seu envolvimento tanto na gênese quanto na progressão de melanoma primário. O perfil imuno-histoquímico com tendência pró-apoptótica parece indicar que outros fatores seriam responsáveis pelo crescimento e disseminação da neoplasia / Cutaneous melanoma still constitutes the main cause of skin cancer death in developed world. Clinical behavior variability of this neoplasia has been only partially explained by clinical and histological aspects, and identification of biological variables can be important for determining specific risk groups. Sixty nine (69) patients with mild to severe primary cutaneous melanoma treated in 1990-2007 were studied aiming at (a) verifying clinical epidemiological aspects, (b) generating a Tissue microarray (TMA) for characterizing proteins expression of cutaneous melanoma > 1.0 mm, (c) analyzing the immunohistochemical expression of the apoptosis proteins Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas in 10 control nevi and in primary melanomas with thickness 1mm, (d) and correlating these proteins expression with the disease prognosis. Results have ratified known epidemiological date on gender, age and lesion localization as well as the correlation between the disease prognosis and the Breslow\'s indexes. Analysis of the composite scores relating to apoptosis proteins has revealed that their immunohistochemical profile seems to be not significant for determining the disease prognosis, since no differences in proteins expression were found when compared patients with and without disease dissemination. Alterations in proteins expression suggesting their role in the genesis as well as in the prognosis of primary melanoma were not evidenced. Immunohistochemical profile with pro-apoptosis trend seems to indicate other factor as responsible for the neoplasia growth and dissemination

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) pertencem à superfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores transcricionais. Eles exercem um papel fundamental em processos que envolvem, principalmente, o metabolismo lipídico, em resposta à ativação por ligantes naturais e sintéticos como os ácidos graxos e os fibratos, respectivamente. A crescente descoberta de importantes funções fisiológicas, coordenadas pelos PPARs, e a necessidade de se conhecer como os agonistas, atualmente disponíveis, atuam nesses receptores, têm incitado pesquisas que vislumbram sua melhor exploração nos tratamentos de doenças metabólicas e inflamatórias, minimizando os efeitos adversos de ativações suprafisiológicas. Nesse cenário, o presente trabalho buscou compreender melhor as bases estruturais envolvidas nas funções atribuídas aos PPARs e explicar como as interações com seus ligantes ocorrem. Para isso, foram realizadas a subclonagem do domínio de ligação ao ligante do PPARα, sua expressão e purificação, seguidas de ensaios cristalográficos e biofísicos, além da abordagem de testes funcionais. Uma vez que a formação de oligômeros está relacionada à funcionalidade desses receptores, foram abordados estudos de oligomerização dos PPARs α e γ, compreendendo tanto o processo de homo- quanto o de heterodimerização. Os ensaios de cristalização do hPPARα LBD complexado a ligantes naturais e sintéticos, resultaram em estruturas cristalográficas que permitiram a identificação dos resíduos envolvidos no reconhecimento dos ligantes e a caracterização de sítios de ligação nunca antes descritos. A presença de ligantes nessas regiões afeta a conformação da proteína e, consequentemente, a modulação de sua função e o recrutamento da maquinaria transcricional. Adicionalmente, as estruturas cristalográficas da proteína complexada a ácidos graxos auxiliaram na compreensão de como essa importante classe de ligantes naturais possui efeitos farmacológicos similares aos de ligantes sintéticos. Esses resultados têm imediato impacto na procura racional de agonistas para esses receptores e se inserem em uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de endocrinologia molecular. / The peroxisome proliferation-activated receptors (PPARs) belong to the nuclear receptors superfamily, acting as transcriptional factors. They play a key role in processes involving essentially lipid metabolism in response to activation by natural and synthetic ligands such as fatty acids and fibrates, respectively. The rising discovery of important physiological functions coordinated by PPARs and the necessity to know how the currently available agonists act on these receptors, have encouraged researches envisioning a better receptor exploration in the treatment of metabolic and inflammatory diseases, minimizing the adverse effects of supraphysiological activations. In this scenario, the present study aimed to better understand the structural basis involved in PPARs functions and elucidates how the interactions with their ligands takes place. For this, the ligand-binding domain of PPARα was subjected to subcloning, expression and purification steps, followed by crystallographical and biophysical assays, in addition to functional testing approaches. Since the degree of oligomerization is related to the functionality of these receptors, oligomeric studies of PPARs α and γ oligomerization were also achieved, comprising both homo- and hetero-dimerization. The co-crystallization assays of hPPARα LBD complexed with natural and synthetic ligands resulted in crystallographic structures that allowed the identification of residues involved in ligand recognition and the characterization of novel binding sites. The presence of ligands in these regions affects the conformation of the protein and thereby modulates their function and transcriptional machinery recruitment. Additionally, the crystallographic structures of the protein complexed to fatty acids were valuable for the understanding of how this important class of natural ligands has similar pharmacological effects to those of synthetic ligands. These results have direct impact on rational agonists design to these receptors and are inserted in a perspective of scientifical promotion and technological development in the field of molecular endocrinology.

Simulações moleculares podem fornecer informações e detalhes mecanísticos que são difíceis de obter de experimentos. No entanto, fenômenos bioquímicos como formação de complexos proteína-ligante e desenovelamento de proteína são lentos e difíceis de amostrar na escala de tempo geralmente atingida por simulações de dinâmica molecular (MD) convencionais. Esses fenômenos moleculares foram estudados aqui pela combinação de simulações de MD com diversos métodos e aproximações para aumentar a amostragem configuracional: método de energia de interação linear (LIE), a aproximação de ensemble ponderado (WE) e dinâmica molecular dirigida (SMD). Uma equação foi parametrizada para prever afinidades entre pequenas moléculas e proteínas baseada na aproximação LIE, que foca a amostragem computacional nos estados complexado e não-complexado do ligante. A flexibilidade proteica foi introduzida usando ensembles de configurações obtidos de simulações de MD. Diferentes esquemas de média foram testados para obter afinidades totais de complexos proteína-ligante, revelando que muitas configurações de complexo contribuem para as afinidades de proteínas flexíveis, enquanto as afinidades de proteínas rígidas são dominadas por uma configuração de complexo. O mutante L99A da lisozima T4 (T4L) é provavelmente a proteína mais frequentemente usada para estudar complexação de ligantes. Estruturas cristalográficas mostram que a cavidade de ligação artificial criada pela mutação é pouco acessível, portanto movimentos proteicos ou uma respiração conformacional são necessários para permitir a entrada e saída de ligantes. Simulações de MD foram combinadas aqui com a aproximação de WE para aumentar a amostragem de eventos infrequentes de saída do benzeno de T4L. Quatro possíveis caminhos foram encontrados e movimentações de alfa-hélices e cadeias laterais envolvidas na saída do ligante foram caracterizadas. Os quatro caminhos correspondem a túneis da proteína previamente observados em simulações de MD longas de T4L apo, sugerindo que a heterogeneidade de caminhos ao longo de túneis intrínsecos é explorada por pequenas moléculas para sair de cavidades de ligação enterradas em proteínas. Experimentos de microscopia de força atômica revelaram informações detalhadas do desenovelamento forçado e da estabilidade mecânica da rubredoxina, uma proteína ferro-enxofre simples. O desenovelamento completo da rubredoxina envolve a ruptura de ligações covalentes. Portanto, o processo de desenovelamento foi simulado aqui por simulações de SMD acopladas a uma descrição clássica da dissociação de ligações. A amostragem de eventos de desenovelamento forçado foi aumentada pelo uso de velocidades rápidas de esticamento. Os resultados foram analisados usando um modelo teórico válido para regimes de desenovelamento forçado lentos e rápidos. As simulações revelaram que mudanças no ponto de aplicação de força ao longo da sequência da rubredoxina levam a diferentes mecanismos de desenovelamento, caracterizados por variáveis graus de rompimento de ligações de hidrogênio e estrutura secundária da proteína. / Molecular simulations may provide information and mechanistic insights that are difficult to obtain from experiments. However, biochemical phenomena such as ligand-protein binding and protein unfolding are slow and hard to sample on the timescales usually reached by conventional molecular dynamics (MD) simulations. These molecular phenomena were studied here by combining MD simulations with several methods or approximations to enhance configurational sampling: linear interaction energy (LIE) method, weighted ensemble (WE) approach and steered molecular dynamics (SMD). An equation was parametrized to predict affinities between small molecules and proteins based on the LIE approximation, which focus computational sampling in ligand bound and unbound states. Protein flexibility was introduced by using ensembles of configurations obtained from MD simulations. Different averaging schemes were tested to obtain overall affinities for ligand-protein complexes, revealing that many bound configurations contribute to affinities for flexible proteins, while affinities for rigid proteins are dominated by one bound configuration. T4 lysozyme (T4L) L99A mutant is probably the protein most often used to study ligand binding. Crystal structures show the artificial binding cavity created by the mutation has low accessibility, so protein movements or conformational breathing are necessary to allow the entry and egress of ligands. MD simulations were combined here with the WE approach to enhance sampling of infrequent benzene unbinding events from T4L. Four possible pathways were found and motions on alpha-helices and side chains involved in ligand egress were characterized. The four pathways correspond to protein tunnels previously observed in long MD simulations of apo T4L, suggesting that pathway heterogeneity along intrinsic tunnels is explored by small molecules to egress from binding cavities buried in proteins. Previous atomic force microscopy experiments revealed detailed information on the forced unfolding and mechanical stability of rubredoxin, a simple iron-sulfur protein. Complete unfolding of rubredoxin involves rupture of covalent bonds. Thus, the unfolding process was simulated here by SMD simulations coupled to a classical description of bond dissociation. Sampling of forced unfolding events was increased by using fast pulling velocities. Results were analyzed using a theoretical model valid for both slow and fast forced unfolding regimes. Simulations revealed that changing the points of force application along the rubredoxin sequence leads to different unfolding mechanisms, characterized by variable degrees of disruption of hydrogen bonds and secondary protein structure.

S100A12 porcina é um membro da família das proteínas S100, um grupo de pequenas proteínas ligantes de cálcio caracterizado pela presença de dois motivos “EF-hand". Estas proteínas estão envolvidas em diversos eventos celulares, como a regulação da fosforilação protéica, atividade enzimática, tamponamento de Ca+2, processos inflamatórios e a polimerização de filamentos intermediários. Adicionalmente, algumas dessas proteínas podem ligar Zn+2, o qual pode afetar a ligação do íon Ca+2, particularmente para as proteínas S100. Neste trabalho, a seqüência gênica que codifica a proteína S100A12 porcina foi obtida por meio da construção de um gene sintético usando códons preferenciais para E.coli, permitindo a produção recombinante de grandes quantidades da proteína. Um estudo termodinâmico da estabilidade estrutural foi realizado, assim como a interação da proteína recombinante com íons divalentes usando técnicas de dicroísmo circular (CD) e fluorescência extrínseca. A desnaturação e renaturação induzidas por uréia ou temperatura indicam que se trata de um processo reversível e que a ligação dos íons Zn+2 e ou Ca+2 à rS100A12 aumenta sua estabilidade. A interação da sonda ANS com a proteína na presença de seus ligantes expõe superfícies hidrofóbicas podendo assim facilitar sua interação com macromoléculas alvo. Analisados em conjunto, os resultados obtidos indicam que S100A12 porcina é capaz de assumir diferentes conformações as quais podem estar correlacionadas com sua função fisiológica. / Porcine S100A12 is a member of S100 family, a small acidic calcium-binding proteins group characterized by the presence of two EF-hand motifs. These proteins are involved in many cellular events as the regulation of protein phosphorylation, enzymatic activity, Ca+2 homeostasis, inflammatory processes and intermediate filament polymerization. In addition, some of these proteins can bind Zn+2, which can affect the binding of Ca+2 particularly to S100 proteins. In this study, the gene sequence encoding S100A12 was obtained by the synthetic gene approach using E. coli codon bias allowing the recombinant production of large amounts of the protein. We report here a thermodynamic study on the structural stability of this recombinant protein and its interaction with divalent ions using circular dichroism and extrinsic fluorescence. The folding/unfolding induced by urea or temperature indicated a reversible process and the binding of Zn+2 or Zn+2 and Ca+2 to S100A12 increasing its stability. The interaction of the ANS probe with the protein in the ligant presence can lead to exposition of hydrofobic regions allowing its interaction with target macromolecules. Taken together, the results indicated that porcine S100A12 may assume different conformations that could be correlated to its physiological function.

S100A12 porcina é um membro da família das proteínas S100, um grupo de pequenas proteínas ligantes de cálcio caracterizado pela presença de dois motivos “EF-hand”. Estas proteínas estão envolvidas em diversos eventos celulares, como a regulação da fosforilação protéica, atividade enzimática, tamponamento de Ca+2, processos inflamatórios e a polimerização de filamentos intermediários. Adicionalmente, algumas dessas proteínas podem ligar Zn+2, o qual pode afetar a ligação do íon Ca+2, particularmente para as proteínas S100. Neste trabalho, a seqüência gênica que codifica a proteína S100A12 porcina foi obtida por meio da construção de um gene sintético usando códons preferenciais para E.coli, permitindo a produção recombinante de grandes quantidades da proteína. Um estudo termodinâmico da estabilidade estrutural foi realizado, assim como a interação da proteína recombinante com íons divalentes usando técnicas de dicroísmo circular (CD) e fluorescência extrínseca. A desnaturação e renaturação induzidas por uréia ou temperatura indicam que se trata de um processo reversível e que a ligação dos íons Zn+2 e ou Ca+2 à rS100A12 aumenta sua estabilidade. A interação da sonda ANS com a proteína na presença de seus ligantes expõe superfícies hidrofóbicas podendo assim facilitar sua interação com macromoléculas alvo. Analisados em conjunto, os resultados obtidos indicam que S100A12 porcina é capaz de assumir diferentes conformações as quais podem estar correlacionadas com sua função fisiológica. / Porcine S100A12 is a member of S100 family, a small acidic calcium-binding proteins group characterized by the presence of two EF-hand motifs. These proteins are involved in many cellular events as the regulation of protein phosphorylation, enzymatic activity, Ca+2 homeostasis, inflammatory processes and intermediate filament polymerization. In addition, some of these proteins can bind Zn+2, which can affect the binding of Ca+2 particularly to S100 proteins. In this study, the gene sequence encoding S100A12 was obtained by the synthetic gene approach using E. coli codon bias allowing the recombinant production of large amounts of the protein. We report here a thermodynamic study on the structural stability of this recombinant protein and its interaction with divalent ions using circular dichroism and extrinsic fluorescence. The folding/unfolding induced by urea or temperature indicated a reversible process and the binding of Zn+2 or Zn+2 and Ca+2 to S100A12 increasing its stability. The interaction of the ANS probe with the protein in the ligant presence can lead to exposition of hydrofobic regions allowing its interaction with target macromolecules. Taken together, the results indicated that porcine S100A12 may assume different conformations that could be correlated to its physiological function.