GIFONI, Juliana Menezes. Propriedades Bioquímicas e Funcionais de uma Proteína Ligante à Quitina Purificada de Sementes de Moringa oleifera Lamarck. 2009. 140 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T16:03:34Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_jmgifoni.pdf: 8760660 bytes, checksum: 354beec73eaacf40d4940af6fcbd173a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T18:20:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_jmgifoni.pdf: 8760660 bytes, checksum: 354beec73eaacf40d4940af6fcbd173a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T18:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_jmgifoni.pdf: 8760660 bytes, checksum: 354beec73eaacf40d4940af6fcbd173a (MD5) Previous issue date: 2009 / Moringa oleifera Lam. is native from Northwest India, well adapted to tropical regions. From its seeds it was isolated a new chitin binding protein, Mo-CBP3, which has coagulant properties and antifungal activity against the phytopathogen Fusarium solani. Proteins were extracted from defatted seeds flour by 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl. The average protein content of the flour was 216.44 mgP/gF. The crude extract was fractionated in albumins and globulins by dialysis and centrifugation. Albumins were concentrated by 90% ammonium sulfate saturation. This fraction was applied into a chitin column, previously equilibrated with the same buffer. An unadsorbed and two adsorbed peaks were obtained. The first adsorbed peak was eluted with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine (PNAG), and the second one, with 0.05 M acetic acid, pH 3.0 (PAC). PNAG was applied into a cation exchange column, Resource S, equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2. The third peak corresponded to Mo-CBP3 – eluted with 0.5 M NaCl in equilibrium buffer. The protein content of Mo- CBP3 was 1.17 mgP/gF. It represents a final yield of 0.54% of crude extract proteins. Apparent molecular mass by SDS-PAGE was 18.0 kDa in the absence of β-ME, and 9.0 kDa, in its presence. Results suggest that Mo-CBP3 is a dimeric protein, made of identical subunits, linked by disulfide bonds. By molecular exclusion chromatography, calculated molecular mass was 14.34 kDa, pI 10.8. Mo-CBP3 is a glycoprotein with 2.5% of carbohydrates, which has not hemagglutinating or chitinase activities. Its NH2- terminal sequence was CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, with 22 amino acids, conffirming its basic character. Mo-CBP3 was as efficient as AlK(SO4)2 in the capacity of coagulating suspended material in water. Mo-CBP3 (0.1 mg/mL) was fungicide to Fusarium solani spores. Heat treatment of the protein at 98 °C, du ring 1 h, and pre incubation with N-acetyl-D-glucosamine, did not reverse its action. Mo-CBP3 was able to retard the mycelial growth of the fungus even at the lowest tested dose of 0.05 mg/mL. Mo-CBP3 was inactive against the oomycete Pythium oligandrum, which has cellulose in spite of chitin in cell wall. Protein was also able to inhibit about 80% of medium acidification, induced by glucose, by F. solani spores, that suggests the influence of Mo-CBP3 over the proton pumps (H+ATPases) present in cellular membranes of F. solani spores. / Moringa oleifera Lam. é uma planta originária do Noroeste da Índia, bem adaptada às regiões tropicais. De suas sementes foi isolada uma nova proteína ligante à quitina, a Mo-CBP3, com propriedades coagulantes e atividade antifúngica contra o fitopatógeno Fusarium solani. As proteínas foram extraídas da farinha delipidada de sementes com o tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M. O teor médio de proteína da farinha correspondeu a 216,44 mgP/gF. O extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas por diálise contra água seguida de centrifugação. As albuminas foram concentradas com sulfato de amônio a 90% de saturação. A F0-90% foi submetida à cromatografia de afinidade em coluna de quitina, previamente equilibrada com o tampão de extração. Foram obtidos um pico não retido e dois picos retidos, correspondentes às proteínas ligantes à quitina (CBP). O primeiro destes foi eluído com solução de N-acetil-D-glucosamina 0,1 M (PNAG), e o segundo, com ácido acético 0,05 M, pH 3,0 (PAC). PNAG foi aplicado em coluna de troca catiônica, Resource S, acoplada a um sistema de FPLC, equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. Dos picos obtidos, o terceiro correspondeu à proteína Mo-CBP3 - eluída com 0,5 M de NaCl no tampão de equilíbrio. O teor protéico médio calculado para a proteína purificada Mo-CBP3 foi de 1,17 mgP/gF, representando um rendimento final de 0,54% das proteínas do extrato total. A massa molecular aparente por SDS-PAGE foi de 18,0 kDa sem o agente redutor e, de 9,0 kDa, na presença deste. O resultado sugere que Mo-CBP3 seja uma proteína dimérica formada de subunidades idênticas, unidas por pontes dissulfeto. A massa molecular de Mo-CBP3, por cromatografia de exclusão molecular, foi de 14,34 kDa, e o pI de 10,8. Trata-se de uma glicoproteína com 2,5% de carboidratos, que não apresenta atividade hemaglutinante ou quitinásica. Sua seqüência NH2-Terminal obtida foi CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, com 22 aminoácidos, confirmando sua característica básica. Mo-CBP3 mostrou-se tão eficiente quanto o AlK(SO4)2 na capacidade de coagular matéria em suspensão na água. Mo-CBP3 foi fungicida para esporos de Fusarium solani a 0,1 mg/mL. O aquecimento da proteína a 98 °C, por 1 h, e a pré-incubação com o açúcar N-acetil-D-glucosamina, não reverteram sua ação. Mo-CBP3 mostrou-se capaz de retardar o crescimento micelial do fungo ainda na menor dose testada, 0,05 mg/mL. Mo-CBP3 é inativa contra o oomiceto Pythium oligandrum, que apresenta celulose no lugar da quitina na parede celular. A proteína foi, ainda, capaz de inibir cerca de 80% da acidificação do meio, por esporos de F. solani, induzida por glicose, o que sugere a influência de Mo-CBP3 sobre as bombas de prótons (H+ATPases) presentes na membrana celular dos esporos deste fungo.

PEREIRA, Mirella Leite. Identificação de uma proteína ligante à quitina em sementes de Moringa oleifera Lamarck com atividades antinociceptiva e anti-inflamatória. 2010. 148 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-22T12:58:11Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:02:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:02:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site / Moringa oleifera Lam. é uma árvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacológicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade científica. Dentre as atividades farmacológicas, destacam-se àquelas relacionadas a processos inflamatórios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de uma proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliação de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatória. As proteínas foram extraídas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fração albumínica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fração ligante à quitina eluída com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iônica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protéicos. O material eluído com tampão acetato de sódio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo – Moringa oleifera; “CBP – “chitin binding protein”), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protéicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condições não-redutoras, e de 9,8 kDa em condições redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteína revelou a presença de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelétrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteína com 2,85% de carboidratos, não apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tão eficiente quanto o sulfato de alumínio e potássio na capacidade de coagular material em suspensão na água. A proteína em questão foi resistente à proteólise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorções abdominais induzidas pela injeção de ácido acético 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteína, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorções de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibição na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 também apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibição de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeção de ácido acético. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migração leucocitária (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sítio de interação ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatória mostrou um decréscimo quando a região de ligação ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteína ligante à quitina, Mo-CBP4, está associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório das sementes

PAULA, Silvia Maria Alves de. Avaliação da biossegurança alimentar de genótipos de feijão caupi (Vigna unguiculata L. WALP) suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus (FABR. 1775 ). 2008. 162 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T13:52:46Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_smapaula.pdf: 1435245 bytes, checksum: 8706d641a20843b4c4cd627f6208a22c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:56:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_smapaula.pdf: 1435245 bytes, checksum: 8706d641a20843b4c4cd627f6208a22c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:56:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_smapaula.pdf: 1435245 bytes, checksum: 8706d641a20843b4c4cd627f6208a22c (MD5) Previous issue date: 2008 / Brazil is one of the largest producers of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.], a very important legume for human dietary protein and carbohydrate supply. Nevertheless, there are some factors which limit its productivity and utilization. The insect Callosobuchus maculatus (cowpea weevil) is considered the principal pest that attacks stored grains. In the Northeast of Brazil, breeding efforts involving cowpea have been directed towards the selection of high yielding varieties associated with traits of resistance to diseases and pests. However, studies on the nutritional quality of these improved genotypes are scanty. In this study, the research was conducted with two cowpea genotypes, BR9 Longá e IT81D 1053, susceptible and resistant to cowpea weevil, respectively, to evaluate whether the probable factors related to the resistance would interfere with the nutritional value. Proximate composition showed that both genotypes are good sources of proteins (23.45 and 26.61 g/100 g dry matter), carbohydrates (61.62 and 62.94 g/100 g dry matter) and crude fiber (4.32 and 5.20 g/100 g dry matter), presenting low contents of oil (3.30 and 3.89 g/100 g dry matter). Polyacrylamide gel electrophoresis of the seed flours showed similar patterns for both genotypes, except for the presence of a very prominent 29 kDa band in the resistant genotype. The presence of antinutritional factors such as lectin, urease and trypsin inhibitor was detected in both cowpea genotypes. Lectin (0.10 UH/mgF) and urease (25.13 and 25.41 U/gF) amounts were similar in the susceptible and resistant genotypes. The resistant genotype presented a higher content of trypsin inhibitor (18.55 mg trypsin inhibited/gF) than the susceptible one (12.57 mg trypsin inhibited/gF). Feeding trial conducted with rats fed the experimental diets containing seed flour of BR9 Longá and IT81D 1053 as the sole protein source, at 10% level, were not sufficient to promote animal growth compared to the animals fed the high quality diet containing egg white. However, when compared the treatments containing susceptible and resistant cowpea genotypes most of parameters analyzed were similar. Diets containing the chitin binding proteins (CBP), purified from susceptible and resistant cowpea genotypes and complemented. / O Brasil é um dos grandes produtores de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], uma importante leguminosa para consumo humano por ser boa fonte proteínas e carboidratos. Todavia, há vários fatores que limitam a produtividade e utilização dessa cultura, destacando-se o ataque pelo inseto Callosobruchus maculatus (gorgulho), conhecido como uma das principais pragas de armazenamento. No Nordeste do Brasil, genótipos de feijão caupi foram criados através de melhoramento genético, visando aumento da produtividade e resistência a doenças e pragas. Porém, é detectada a escassez de informações relacionando resistência e valor nutricional. Assim sendo, no presente estudo, dois genótipos melhorados geneticamente, BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao gorgulho, respectivamente, foram selecionados, para verificar se as alterações promovidas pelo melhoramento afetariam sua qualidade nutricional. Os dados de composição centesimal mostraram que ambos os genótipos constituem-se em boa fonte de proteínas (23,45 e 26,61 g/100 g de matéria seca), carboidratos (61,62 e 62,94 g/100 g de matéria seca) e fibra bruta (4,32 e 5,20 g/100 g de matéria seca), apresentando baixos conteúdos de lipídios (3,30 e 3,89 g/100 g de matéria seca). Os perfis eletroforéticos da farinha de sementes dos dois genótipos mostraram-se muito semelhantes entre si, exceto a existência de uma banda mais proeminente na região de 29 kDa verificada no genótipo resistente. Fatores antinutricionais tais como lectina, urease e inibidor de tripsina foram verificados nos dois genótipos de feijão caupi avaliados. Os teores de lectina (0,10 UH/mgF) e de urease (25,13 e 25,41 U/gF) se mostraram bem similares nos genótipos suscetível e resistente. Já os conteúdos de inibidor de tripsina foram diferentes, tendo o genótipo resistente apresentado maior atividade (18,55 mg de tripsina inibida/gF) em comparação ao suscetível (12,57 mg de tripsina inibida/gF). Farinhas dos genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, quando incluídas em dietas para ratos como única fonte protéica, a 10%, não foram capazes de promover o crescimento dos animais de forma similar à albumina da clara do ovo (proteína padrão). Todavia, quando comparado o tratamento Avaliação da Biossegurança Alimentar de Genótipos... contendo farinha do genótipo suscetível com aquele contendo o genótipo resistente, para a maioria dos parâmetros analisados, as respostas foram bem parecidas. Dietas contendo proteínas ligantes à quitina (PLQ), purificadas do genótipo suscetível e do resistente, complementadas com albumina da clara do ovo, apresentaram valor nutricional igual ou superior ao padrão (somente clara do ovo). Diante dos parâmetros analisados, os resultados permitem concluir que o melhoramento genético do feijão caupi, o qual conferiu resistência ao Callosobruchus maculatus, não foi capaz de alterar a qualidade nutricional dessa leguminosa. Além disso, diferentemente ao verificado com o Callosobruchus maculatus, não foram observados efeitos antinutricionais, tóxicos e/ou alergênicos para os animais testados (ratos e camundongos), associados ao consumo das PLQ provenientes do genótipo suscetível ou do resistente.