Orientadores : Tomomasa Yano, Maria Sumiko Arita Matsuura / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T22:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amorim_ClaudioRobertoNobrega_D.pdf: 4855224 bytes, checksum: 09ea3f25bce591997cc5ee4f3000559b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Colibacilose enterotoxigênica ocorre em leitões recém-nascidos e porcos no pósdesmame. Um dos fatores de virulência de E. coli é a presença de antígenos de aderência, muitas vezes estruturas do tipo fimbria, que permite a ligação da bactéria às células do hospedeiro. Em 1986, Yano et ai. descreveram uma nova adesina, chamada de F42. Este trabalho tem por objetivo a caracterização bioquímica desta fimbria a nível molecular e comparar sua estrutura primária com a da fimbria F41, a fim de diferenciá-Ias. Assim, a fimbria F42 foi extraída e purificada através de cromatografia em coluna de gel filtração Sepharose CL 4B, equilibrada com tampão Tris-HCI O,O25M com NaCI O,15M, pH 7,4; apresentando massa molecular aparente de 16 kDa. Foi feita a análise da composição de aminoácidos da proteína, demonstrando a presença de aproximadamente 145 resíduos em uma única cadeia e mostrando diferenças com a fimbria F41. Fez-se, também, sua redução e carboximetilação, digestão com brometo de cianogênio, separação dos peptídeos através de cromatografia em coluna de fase reversa Cs e obtenção de peptídeos menores com a fimbria submetida à ação de tripsina tratada com N-tosil-Lfenilalanilclorometil cetona (TPCK). Os peptídeos resultantes da digestão foram separados através de cromatografia em coluna de fase reversa CIs. Foi feita nova digestão com CNBr e os peptídeos separados e purificados em coluna Superdex Peptide e foi feita a análise da composição de aminoácidos dos peptídeos. Foi feita a extração do DNA plasmidiano e PCR da amostra padrão. Foram feitas, também, digestões com Tripsina e Endoproteinase Asp-N, separação em cromatografia de fase reversa, análise da composição de aminoácidos de alguns peptídeos e sequenciamento de aminoácidos destes peptídeos e da porção Nterminal até o 32° resíduo, com o seguinte resultado: aswtegqpgdiiiggeitspsvkwlwktgegl Tentou-se, ainda, o sequenciamento da porção C-terminal com carboxipeptidase Y / Abstract: Enterotoxigenic colibacillosis occurs in newborn piglets and weaned pigs. One of the factors of virulence of E. coli is the presence of antigens of adherence, often fimbria type structure, that allow the connection of the bacteria to the cells of the host. In 1986, Yano et al. described a new adesin, denominated of F42. This work aims the biochemical characterization of this fimbria at molecular level and to compare their primary structure to the fimbria F41, in order to distinguish them. Thus, the fimbria F42 was extracted and purified through chromatography of gel filtration in Sepharose CL 4B equilibrated with lid Tris-HCI O,O25M with NaCI O,15M, pH 7,4, presented a molecular mass apparent of 16kDa. It was performed the analysis of the amino acids composition of the protein, and was demonstrated the presence of 145 residues e showing differences with F41 fimbria. It was made their reduction, carboximetilation, cianogen bromide digestion, separation of the peptides through of reverse phase chromatography Cs and obtaining of smaller peptides with the fimbria subject to the action of tripsin treated with N-tosil-L-phenylalanilc1orometil ketone (TPCK). The resulting peptides of the digestion were separate through reverse phase chromatography CIs. It was undergone digestion with CNBr and the separate peptides and purified in Superdex Peptide column and it was made the analysis of the composition of amino acids of the peptides. They were made the extraction of the plasmidial DNA and PCR of the sample standard. They were done, also, digestions with Tripsin and Endoproteinase Asp-N, separation in reverse phase chromatography, analysis of the composition of amino acids of some peptides and sequencing of amino acids of these peptides and of the portion N-terminal to the 32nd residue, presenting these results: aswtegqpgdiiiggeitspsvkwlwktgeg. The sequencing of the portion C-terminal was tried with carboxipeptidase Y / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LucielenOliveirados_M.pdf: 943021 bytes, checksum: 7237d5c1a050d0bfae7083ba9026d36f (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As bacteriocinas são substâncias protéicas produzidas por bactérias, com atividade bactericida e bacteriostática contra bactérias sensíveis. Estes compostos são produzidos por microrganismos gram-positivos e gram-negativos, incluindo as bactérias láticas. Estas bactérias são extensamente usadas no processamento de alimentos devido a sua contribuição na vida de prateleira, textura e propriedades organolépticas. Algumas cepas de enterococos podem produzir bacteriocinas ativas contra bactérias patogênicas, tal como a Listeria monocytogenes. As bacteriocinas produzidas por Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis são peptídeos pequenos, hidrofóbicos e termoestáveis. Dentro deste contexto este trabalho teve como objetivo estudar a produção de enterocina por E. faecium e E. faecalis. Inicialmente, as fermentações foram feitas em frascos Erlenmeyers, incubados a 37°C por 24h, para determinar as melhores condições de fonte de carbono (glicose, sacarose comercial ou açúcar mascavo), pHinicial (4,0; 6,0; 8,0 ou 10,0) e agitação (0 ou 200rpm). O meio basal modificado sem glicose foi usado como meio base sendo complementado com diferentes fontes de carbono. Em um segundo estágio, os experimentos foram conduzidos em fermentador de bancada por 24h. Durante as fermentações foram coletadas amostras em intervalos de 24h ou 1h, para a determinação da atividade de enterocina, massa celular seca, pH e conteúdo de açúcar. Os resultados obtidos a partir dos testes em frascos Erlenmeyers indicam que usando o E. faecium para produção de enterocina as melhores condições de cultivo foram pHinicial 10,0, sacarose e sem agitação. A máxima produção de enterocina foi 2,81UE. Os resultados indicaram que as melhores condições para produção de enterocina usando E. faecalis foram pHinicial 10,0, 200rpm e açúcar mascavo, com atividade de enterocina de 1,68UE. No fermentador, a maior atividade de enterocina foi 2,94UE após 21h de fermentação no experimento com pHinicial 10,0, 200rpm, sacarose e E. faecium. A atividade de enterocina foi de 1,30UE após 12h de incubação no experimento com pHinicial 10,0, 200rpm, açúcar mascavo e E. faecalis. A L. monocytogenes Scott A foi utilizada como microrganismo teste e foi inibida pelas enterocinas produzidas por E. faecium e por E. faecalis / Abstract: Bacteriocins are protein substances produced by bacteria that are bactericidal or bacteriostatic against sensitive bacterial species. Both gram-negative and gram-positive organisms, including the lactic acid bacteria, produce these compounds. These bacteria are extensively used in food processing, for their contribution to shelf life, texture and organoleptic properties. Some strains of entecococci can produce bacteriocins active against pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes. Bacteriocins produced by Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis are small, hydrophobic and termostable peptides. The aim of this work was the study of enterocin production by E. faecium and E. faecalis. Initially, fermentations assays were carried out in Erlenmeyers flasks for determining the best conditions of carbon sources (glucose, sucrose and brown sugar), pHinitial (4,0; 6,0; 8,0 or 10,0) and agitation (0 or 200rpm). The modified basal medium without glucose was used as base medium and the different carbon employed. The flasks incubated at 37°C for 24h. In a second stage, the experiments were carried out in laboratory scale fermentor for 24h. During the fermentations samples were collected at intervals of 24 h or 1h, for determination of enterocin activity, biomass (cell dry mass), pH and sugar contents. The first phase in Erlenmeyers flasks indicated that using E. faecium for enterocin production the best culture conditions were pHinitial 10,0, sucrose and without agitation. The maximum enterocin production was 2,81UE. The results indicated that the best conditions for enterocin production using E. faecalis were pHinitial 10,0, 200rpm and brown sugar, with enterocin activity of 1,68UE. In fermentor the highest enterocin activity was 2,94UE after 21h of fermentation in experiment using pHinitial 10,0, 200rpm, sucrose and E. faecium. The enterocin activity was 1,30UE after 12h of incubation in experiment with pHinitial 10,0, 200rpm, brown sugar and E. faecalis. When it was used L. monocytogenes Scott A as microorganism test occurred its inhibition by enterocin of E. faecium and E. faecalis / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2016-06-21T13:43:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 830.pdf: 984013 bytes, checksum: 404aa18d3e40dad94e177518d24b5c02 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 3 830.pdf.txt: 186951 bytes, checksum: c158594d1dae991c3436229e07b6cb30 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 830.pdf: 984013 bytes, checksum: 404aa18d3e40dad94e177518d24b5c02 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O principal fator larvicida do Bacillus sphaericus (Bsp) para culicídeos é a protoxina Bin, produzida sob a forma de um cristal, durante a esporulação. Quando ingerido pelas larvas o cristal é processado e a toxina Bin reconhece e liga-se a receptores específicos do epitélio intestinal. O receptor em Culex quinquefasciatus é uma alfa-glicosidase de 60 kDa, ligada à membrana intestinal por uma âncora GPI, denominado Cqm1. Larvas de Aedes aegypti são consideradas refratárias ao Bsp, pois a toxina Bin não reconhece receptores no microvilli intestinal. No entanto, a análise do genoma do Ae. aegypti, revelou a presença do gene aam1, que codificaria uma proteína ortóloga e com 83 por cento de similaridade ao receptor Cqm1. O principal objetivo deste estudo foi elucidar a base molecular da refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp, determinada pela ausência de ligação da toxina Bin ao epitélio intestinal das larvas. Para tal, foi feita uma investigação da expressão da proteína Aam1 e do perfil de alfa-glicosidases de Ae. aegypti, tendo como referência o receptor Cqm1. Os resultados mostraram que larvas e adultos de Ae. aegypti expressam uma ?-glicosidase de membrana de 70 kDa, reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, e que provavelmente trata-se da proteína Aam1. Tal proteína é expressa no microvilli intestinal das larvas em níveis superiores à Cqm1, no entanto, não apresenta capacidade de ligação à toxina Bin. Em uma segunda etapa, a avaliação de proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes, produzidas em lisado de reticulócitos de coelho, mostrou que ambas não foram capazes de se ligar específicamente à toxina Bin. A falha na ligação da proteína Cqm1 à toxina Bin pode ser decorrente da ausência do processamento pós-traducional adequado neste sistema de expressão, indicando que certas modificações podem ser críticas para a sua funcionalidade. O tratamento da proteína Cqm1 nativa à temperatura de 100 °C aboliu a sua capacidade de ligação à toxina Bin, indicando que a conformação da proteína pode ser essencial para a sua funcionalidade. Os resultados obtidos demonstram que, apesar dos altos níveis de expressão da Aam1 nas larvas de Ae. aegypti, a proteína não é capaz de ligar-se à toxina Bin. Tal fato estar relacionado a outros fatores críticos para sua funcionalidade, tais como diferenças conformacionais e/ou modificações pós-traducionais que determinem o status de refratariedade do Ae. aegypti