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Respostas bioquímicas comparativas de genótipos suscetíveis e resistentes de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (l.) Walp.] desafiados com o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV) / Comparative biochemical responses of resistant and susceptible cowpea ([Vigna unguiculata [L.] Walp.) genotypes challenged with cowpea severe mosaic virus (CPSMV)

Bezerra, Emanuel Alves January 2016 (has links)
BEZERRA, Emanuel Alves. Respostas bioquímicas comparativas de genótipos suscetíveis e resistentes de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (l.) Walp.] desafiados com o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV). 2016. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T21:04:59Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) WalP.] has great socioeconomic importance in the North and Northeast Brazil, other countries of South and Latin America, Africa, and Asia. Although its rusticity and high natural resistance to most diseases, cowpea severe mosaic virus (CPSMV), which belongs to the family Comoviridae, has great importance because its severity and extensive damage and loss it causes in cowpea. Although there are resistant genotypes to CPSMV, it is not well understood the mechanisms involved in defense. This comparative study was conducted with two resistant and two susceptible cowpea genotypes to shed light on the mechanisms of susceptibility and resistance to CPSMV. Thus, differences in the enzyme activities related to the oxidative stress involving superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase ascorbate (APX), in addition to enzymes of the phenol metabolism as phenylalanine ammonia-lyase (PAL), guaiacol peroxidase (POX), and polyphenol oxidase (PPO) were analyzed. Quantitative differences in phenolic compounds, superoxide ion (O2-) and hydrogen peroxide (H2O2) were also evaluated. After inoculation with CPSMV, or only with the abrasive carborundum (controls), the secondary leaves of each genotype were collected at 0, 6, 24, 48, and 72 hours after inoculation (HAI) and the biochemical analyzes performed. In addition, the transcript levels of SOD, CAT, and APX were evaluated at 6 HAI, by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). In CPSMV infected resistant cowpea plants compared to the respective controls higher POX, PPO, PAL, SOD, but low CAT and APX activities were observed. Moreover, O2-, H2O2 and phenolic compounds showed higher contents than those of the respective controls at some time points after inoculation of the resistant cowpea genotypes with CPSMV. Opposite responses regarding to these above biochemical parameters were observed for the susceptible genotypes. Expression of the CAT transcript was in agreement with the CAT activity at 6 HAI. However, for only some cowpea genotypes the APX transcript synthesis at 6 HAI was in agreement with the enzyme activity. Nevertheless, the results suggest participation of SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associated with phenolic compound, O2-, and H2O2 levels in the mechanisms of resistance/susceptibility of the cowpea to CPSMV infection. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] tem grande importância socioeconômica no Norte e Nordeste brasileiro e em vários outros países da America do Sul e Latina, África e Ásia. Apesar de sua rusticidade e elevada resistência natural a muitas doenças, o Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV), pertencente à família Comoviridae, apresenta grande destaque por ser a virose que mais acomete essa cultura no país. Embora existam genótipos resistentes ao vírus, não se sabe quais os mecanismos de defesa envolvidos. Nesse projeto, um estudo comparativo entre genótipos de feijão-de-corda, resistentes e suscetíveis ao CPSMV, foi conduzido, tendo como abordagem experimental a avaliação de atividades de enzimas relacionadas aos mecanismos de defesa de plantas, com a finalidade de fornecer informações bioquímicas que ajudem a explicar por que há genótipos de feijão-de-corda resistentes e suscetíveis ao CPSMV. Assim, diferenças nas atividades de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo, como dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidase do ascorbato (APX), e as enzimas fenilalanina amônia liase (PAL), peroxidase de fenóis (POX) e polifenol oxidase (PPO), envolvidas com o metabolismo de fenóis, foram analisadas. Diferenças quantitativas de compostos fenólicos, íon superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram, também, avaliados. Após as folhas secundárias terem sido inoculadas com o CPSMV, ou apenas injuriadas com o abrasivo carborundum (controles), elas foram coletadas nos tempos 0, 6, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (HAI) e as análises bioquímicas realizadas nos extratos proteicos obtidos. Além disso, a síntese de transcritos relativos à SOD, CAT e APX foi avaliada 6 HAI por meio da reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR), comparando-as com as atividades registradas dessas enzimas. Nas plantas infectadas com o CPSMV em relação as não infectadas (controles), os genótipos resistentes demonstraram maiores atividades da POX, PPO, PAL, SOD e baixas atividades da CAT e APX. O conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos apresentaram-se elevados em alguns tempos durante a infecção nos genótipos resistentes, sendo observado o contrário nas atividades enzimáticas e conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos dos genótipos suscetíveis. A expressão dos transcritos da CAT acompanhou a atividade da catalase. No entanto, apenas em alguns genótipos os transcritos da SOD e APX acompanharam a atividade de suas enzimas. Os resultados sugerem a participação da SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associados com os teores de superóxido, peróxido de hidrogênio e compostos fenólicos nos mecanismos de resistência/susceptibilidade do feijão-de-corda à infecção pelo CPSMV.
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Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos / Histological analysis of tissues cultured in vitro laticíferas plants, soluble protein profile and action against plant pathogens

Silva, Rayanne Farias da January 2015 (has links)
SILVA, Rayanne Farias da. Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos. 2015. 121 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T21:33:34Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticíferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasn’t any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. / Plantas laticíferas têm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal em seu látex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteínas e atividades descritas para o látex de duas espécies laticíferas. Tecidos de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos através de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à análise histológica para caracterização de laticíferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas análises. Não foi detectada qualquer estrutura laticífera em calos ou raízes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticíferos se formam nas raízes. Proteínas solúveis foram extraídas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimáticos, técnicas bioquímicas, imunológicas e espectrometria de massas. A presença de atividade contra fungos fitopatogênicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os látex das espécies estudadas. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos. Os percentuais de inibição do crescimento vegetativo de hifas na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram qualquer efeito inibitório sobre o crescimento de hifas ou germinação de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescência, foi possível demonstrar que as proteínas extraídas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteúdo citoplasmático, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos esteja relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática. Também foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera através da produção de peróxido de hidrogênio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticíferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer ação contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Proteases antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não foram encontradas nos tecidos sem formação laticífera.

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