BEZERRA, Emanuel Alves. Respostas bioquímicas comparativas de genótipos suscetíveis e resistentes de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (l.) Walp.] desafiados com o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV). 2016. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T21:04:59Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) WalP.] has great socioeconomic importance in the North and Northeast Brazil, other countries of South and Latin America, Africa, and Asia. Although its rusticity and high natural resistance to most diseases, cowpea severe mosaic virus (CPSMV), which belongs to the family Comoviridae, has great importance because its severity and extensive damage and loss it causes in cowpea. Although there are resistant genotypes to CPSMV, it is not well understood the mechanisms involved in defense. This comparative study was conducted with two resistant and two susceptible cowpea genotypes to shed light on the mechanisms of susceptibility and resistance to CPSMV. Thus, differences in the enzyme activities related to the oxidative stress involving superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase ascorbate (APX), in addition to enzymes of the phenol metabolism as phenylalanine ammonia-lyase (PAL), guaiacol peroxidase (POX), and polyphenol oxidase (PPO) were analyzed. Quantitative differences in phenolic compounds, superoxide ion (O2-) and hydrogen peroxide (H2O2) were also evaluated. After inoculation with CPSMV, or only with the abrasive carborundum (controls), the secondary leaves of each genotype were collected at 0, 6, 24, 48, and 72 hours after inoculation (HAI) and the biochemical analyzes performed. In addition, the transcript levels of SOD, CAT, and APX were evaluated at 6 HAI, by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). In CPSMV infected resistant cowpea plants compared to the respective controls higher POX, PPO, PAL, SOD, but low CAT and APX activities were observed. Moreover, O2-, H2O2 and phenolic compounds showed higher contents than those of the respective controls at some time points after inoculation of the resistant cowpea genotypes with CPSMV. Opposite responses regarding to these above biochemical parameters were observed for the susceptible genotypes. Expression of the CAT transcript was in agreement with the CAT activity at 6 HAI. However, for only some cowpea genotypes the APX transcript synthesis at 6 HAI was in agreement with the enzyme activity. Nevertheless, the results suggest participation of SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associated with phenolic compound, O2-, and H2O2 levels in the mechanisms of resistance/susceptibility of the cowpea to CPSMV infection. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] tem grande importância socioeconômica no Norte e Nordeste brasileiro e em vários outros países da America do Sul e Latina, África e Ásia. Apesar de sua rusticidade e elevada resistência natural a muitas doenças, o Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV), pertencente à família Comoviridae, apresenta grande destaque por ser a virose que mais acomete essa cultura no país. Embora existam genótipos resistentes ao vírus, não se sabe quais os mecanismos de defesa envolvidos. Nesse projeto, um estudo comparativo entre genótipos de feijão-de-corda, resistentes e suscetíveis ao CPSMV, foi conduzido, tendo como abordagem experimental a avaliação de atividades de enzimas relacionadas aos mecanismos de defesa de plantas, com a finalidade de fornecer informações bioquímicas que ajudem a explicar por que há genótipos de feijão-de-corda resistentes e suscetíveis ao CPSMV. Assim, diferenças nas atividades de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo, como dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidase do ascorbato (APX), e as enzimas fenilalanina amônia liase (PAL), peroxidase de fenóis (POX) e polifenol oxidase (PPO), envolvidas com o metabolismo de fenóis, foram analisadas. Diferenças quantitativas de compostos fenólicos, íon superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram, também, avaliados. Após as folhas secundárias terem sido inoculadas com o CPSMV, ou apenas injuriadas com o abrasivo carborundum (controles), elas foram coletadas nos tempos 0, 6, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (HAI) e as análises bioquímicas realizadas nos extratos proteicos obtidos. Além disso, a síntese de transcritos relativos à SOD, CAT e APX foi avaliada 6 HAI por meio da reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR), comparando-as com as atividades registradas dessas enzimas. Nas plantas infectadas com o CPSMV em relação as não infectadas (controles), os genótipos resistentes demonstraram maiores atividades da POX, PPO, PAL, SOD e baixas atividades da CAT e APX. O conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos apresentaram-se elevados em alguns tempos durante a infecção nos genótipos resistentes, sendo observado o contrário nas atividades enzimáticas e conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos dos genótipos suscetíveis. A expressão dos transcritos da CAT acompanhou a atividade da catalase. No entanto, apenas em alguns genótipos os transcritos da SOD e APX acompanharam a atividade de suas enzimas. Os resultados sugerem a participação da SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associados com os teores de superóxido, peróxido de hidrogênio e compostos fenólicos nos mecanismos de resistência/susceptibilidade do feijão-de-corda à infecção pelo CPSMV.

Submitted by MARINA MORTATI DIAS null (marina.mortati@gmail.com) on 2016-08-07T23:35:50Z No. of bitstreams: 1 Tese_Marina Mortati Dias.pdf: 1708247 bytes, checksum: 534b59570229fd27eb89d883f8e64df7 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-08-10T13:49:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dias_mm_dr_jabo.pdf: 1708247 bytes, checksum: 534b59570229fd27eb89d883f8e64df7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-10T13:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dias_mm_dr_jabo.pdf: 1708247 bytes, checksum: 534b59570229fd27eb89d883f8e64df7 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Características reprodutivas, como a idade à puberdade, são economicamente relevantes para sistemas de produção de carne. A ocorrência de prenhez precoce aos 16 meses (OPP) é considerada um indicador da idade à puberdade e pode ser utilizada como critério de seleção. A busca por mutações potencialmente causais em genes candidatos pode ajudar a melhorar a acurácia de predição genômica se forem inseridas em painéis de marcadores genéticos. O objetivo desse estudo foi identificar polimorfismos potencialmente causais em genes candidatos associados a características reprodutivas em novilhas, por meio de dois ensaios. No primeiro, foram sequenciadas regiões dos genes PPP3CA e FABP4 em 380 amostras de DNA provenientes de novilhas Nelore, por meio de equipamento MiSeq® (Illumina, Inc). Nestas sequências foram detectadas duas mutações na região do gene PPP3CA e 13 no gene FABP4. Dentre elas, 14 eram SNP e uma era deleção, sendo esta última homozigota em todas as amostras sequenciadas, o que nos leva a acreditar que possa ser uma mutação fixada na raça Nelore. Um haplótipo constituído por quatro SNP no gene FABP4 não teve efeito significativo ao nível de p<0,05 sobre a característica OPP. Todos os SNP que passaram pelo controle de qualidade também foram analisados, porém nenhum teve efeito significativo sobre a característica OPP (p>0,05). No segundo ensaio, foram analisadas sequências de amostras de RNA de novilhas Brangus com o objetivo de identificar polimorfismos nas regiões de 62 genes candidatos associados a características reprodutivas. Detectou-se 1157 SNP nas regiões de 46 daqueles genes. Esses SNP foram comparados com SNP detectados a partir de sequências de amostras de RNA de outras quatro raças (Angus, Brahman, Nelore e Holandês). Cento e setenta e dois SNP foram coincidentes em todas as raças. A partir de sequências de RNA de Brangus também foram detectados 160 novos transcritos na região de 42 dos genes candidatos e cinco genes não anotados que sobrepõem a região de genes candidatos. A detecção de novos transcritos e genes é fundamental para enriquecer a anotação do genoma bovino. As mutações detectadas podem ser utilizadas para a customização de painéis de marcadores, e aplicações de seleção genômica. / Fertility traits such as age at puberty are economically important for meat production system. Occurrence of early pregnancy (OPP) is considered a good indicator of age at puberty and can be used as selection criteria. The search for causal mutations in candidate genes can helpful to improve the accuracy of genomic prediction if used to design low-density chips. The objective of this study was to identify polymorphism in candidate genes associated with puberty in heifers. DNA sequences were obtained from 380 Nellore heifers from exons sequencing of PPP3CA and FABP4 genes through MiSeq® equipment (Illumina, Inc.). From these sequences were found two SNP in the region of PPP3CA gene and 13 variations in the gene FABP4. Among these 15 variations 12 were SNP and one was a deletion, and this deletion was detected in all samples sequenced, which leads us to conclude that this may be a variation between Nellore and Hereford. One haplotype consisting of four SNP located in the FABP4 and nine SNP, that were analyzed separately, had not a significant effect at the p <0.05 on OPP characteristic. Also were analyzed RNA sequences from Brangus heifers in 62 candidate genes associated with puberty with the aim to discovery SNP in these regions. Were detected 1157 SNP in the region of 46 gene. These SNP were compared with SNP detected from RNA sequences from four breeds, Angus, Brahma, Nellore and Holstein. One hundred and seventy-two SNP were matched in all breeds. From Brangus RNA sequences were also detected 160 new transcripts in the region of 42 candidate genes and five genes not annotated that overlap the region of candidate genes. Detection of new transcripts and genes is essential to enrich the bovine genome annotation. The mutations detected can be used for the customization of low density chips and future genomics selection strategies.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-16T11:19:46Z No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-16T11:29:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-16T11:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A maturação in vitro de oócitos é um processo importante para a produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da interação do soro e tensão de oxigênio na maturação in vitro, sobre a maturação nuclear, viabilidade das células do cumulus, abundância de transcritos oocitários, desenvolvimento pré-implantacional e apoptose embrionária. Foram utilizados quatro grupos experimentais: G1 (10% soro de vaca no cio [SVC] em 20% de O2); G2 (0,1% álcool polivinílico [PVA] em 20% de O2), G3 (10% SVC em 5% de O2) e G4 (0.1% PVA em 5% O2). A proporção de oócitos em metáfase II, viabilidade das células do cumulus, taxa de blastocistos e número total de células não foi afetado (P>0,05) quando o soro foi substituído por PVA em 5% de O2, enquanto a taxa de blastocistos e número total de células foi maior (P<0.05) no grupo com soro comparado com PVA, ambos em 20% O2. O índice apoptótico foi menor em blastocistos produzidos a partir de oócitos maturados com PVA em 5% de O2 (G4) em relação aos de outros grupos (G1, G2 e G3), mas não foi encontrada diferença (P>0,05) na taxa de maturação, viabilidade das células do cumulus e de blastocistos. Foram encontradas diferenças (P<0,05) na quantidade de transcritos específicos em oócitos maturados sobre as diferentes condições. Conclui-se que a presença de soro durante a maturação é importante para o desenvolvimento embrionário em tensão de 20% de O2, e a suplementação com PVA em 5% de O2 fornece o melhor ambiente de maturação para os oócitos, resultando em blastocistos com baixo índice apoptótico. / In vitro maturation is an important step for in vitro embryo production. The objective of the present study was to investigate the effect of the interaction of serum and oxygen tension during in vitro maturation on nuclear maturation, viability of cumulus cells, oocyte transcript amount, preimplantation development and blastocyst apoptosis. Four experimental groups were designed: G1 (10% estrus cow serum [ECS] with 20% O2); G2 (0.1% polyvinyl alcohol [PVA] with 20% O2), G3 (10% ECS with 5% O2) e G4 (0.1% PVA with 5% O2). Proportion of metaphase II oocytes, viability of cumulus cells, blastocyst rates and the total cell number were not affected (P>0.05) when the ECS was replaced by PVA under 5% O2, whereas higher (P<0.05) blastocyst rate and total cell number were found with ECS than PVA, both under 20% O2. Apoptosis index were lower in blastocysts from oocytes matured with PVA under 5% O2 (G4) than blastocysts from other groups (G1, G2 and G3), but no differences (P>0.05) were found in nuclear maturation, viability of cumulus cells and blastocyst rate. Differences (P<0.05) in amount of specific transcripts were found in oocytes matured under different conditions. In conclusion, presence of serum during maturation is important for embryo development only when under 20% O2, and maturation with PVA and 5% O2 provides better environment for oocyte, resulting in blastocysts with low apoptosis index.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-09T14:47:58Z No. of bitstreams: 1 PGCA16MA201.pdf: 1020205 bytes, checksum: d956db0f093e7d366bba8bbcc7198546 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T14:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA16MA201.pdf: 1020205 bytes, checksum: d956db0f093e7d366bba8bbcc7198546 (MD5) Previous issue date: 2016-07-13 / UNIEDU / FUMDES / The biosynthesis of lipids is dependent of a coordinated action of several lipogenic enzymes, such as acetyl-CoA carboxylase alpha (ACC-α) and fatty acid synthase (FASN), in different tissues. This study evaluated the gene expression of acetyl-CoA carboxylase alpha (ACC-α) transcripts tissue-specific expressed from promoters I, II and III (PI, PII and PIII), fatty acid synthase (FASN), leptin and sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in mammary gland and adipose tissues of lactating ewes at three different stages of lactation. Eight crossbred Lacaune/Texel ewes weighing 62 ± 1.8 kg (mean ± SE), with mean parity number of 3.1 ± 0.23 and producing 0.94 ± 0.12 kg milk/d were used in three different stages of lactation (days in milk-DIM): a) Early, (15 DIM), b) Mid, (70 DIM) and; c) Late (120 DIM). Biopsies were taken after the morning milking, the total RNA was extracted, complementary DNA (cDNA) synthesized and qRT-PCR analysis carried out. The gene expression data were analyzed using the MIXED procedure of SAS using the geometric mean of two housekeeping genes, ribosomal protein S18 (RPS18) and beta actin (β-ACT), as a covariate. In mammary tissue, PII transcripts were reduced 82, 93 and 59% between early and mid, early and late and mid and late stages of lactation. PIII transcripts were decreased 73, 89 and 59% between early and mid, early and late and mid and late, respectively. Gene expression of FASN was reduced respectively, 54 and 83% in mid and late stages compared to early lactation. In mammary tissue SREBP1 was decreased 33 and 42% between early and late and mid to late lactation. In adipose tissue, the expression of PI transcripts was increased more than 30 fold between early and mid lactation. There is an adaptation for fatty acid synthesis in adipose and mammary tissues to meet the demands of lactation is associated with changes in gene expression of the transcription factor and codifying genes involved in fat synthesis in both tissues / A biossíntese de lipídeos é dependente de uma ação coordenada de várias enzimas lipogênicas, como a acetil-CoA carboxilase alfa (ACC-α) e a ácido graxo sintase (FASN) em diferentes tecidos. Este estudo mensurou a expressão gênica dos transcritos tecido-específicos oriundos de diferentes regiões promotoras I, II e III (PI, PII e PIII) do gene da ACC-α e transcritos da FASN, leptina e da SREBP1 na glândula mamária e no tecido adiposo de ovelhas lactantes em três diferentes estágios de lactação. Oito ovelhas mestiças Lacaune/Texel pesando 62 ± 1,8 kg (média ± SE), com média de parições de 3,1 ± 0,23 e produzindo 0,94 ± 0,12 kg leite/d foram utilizadas em três diferentes estágios de lactação (Dias em lactação - DEL): a) Inicial (15 DEL), b) Intermediário (70 DEL) e c) Final (120 DEL). As biópsias da glândula mamária e do tecido adiposo foram coletadas após a ordenha da manhã, o RNA total foi extraído, o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado e análises de qRT-PCR foram realizadas. A expressão gênica foi analisada utilizando o procedimento MIXED do SAS usando a média geométrica de dois housekeeping genes, proteína ribossomal S18 (RPS18) e beta-actina (β-ACT), como covariável. No tecido mamário os transcritos do PII reduziram 82% entre os períodos inicial e intermediário, 93% inicial e final e 59% entre o período intermediário e final. Os transcritos do PIII decresceram respectivamente 73, 89 e 59% entre os períodos inicial e intermediário, inicial e final e intermediário e final. A expressão gênica da FASN na glândula mamária reduziu respectivamente 54 e 83% quando o período inicial foi comparado com os períodos intermédiario e final. No tecido mamário a expressão da SREBP1 decresceu 33 e 42% entre o período inicial e final e entre o intermediário e final. No tecido adiposo a expressão do transcrito PI aumentou mais de 30 vezes entre os períodos inicial e intermediário. Há uma adaptação para a síntese de ácidos graxos nos tecido adiposo e mamário a fim de suprir as demandas fisiológicas da lactação, associada à mudanças na expressão gênica dos fatores de transcrição e genes envolvidos na síntese de lipídeos em ambos os tecidos

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3091_1.pdf: 1433589 bytes, checksum: cee30d09ca85980508dbf3f0ac6de0cd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Constituindo fontes ricas de compostos farmacologicamente ativos, com um amplo espectro de atividades biológicas, as toxinas e enzimas presentes nos venenos das famílias Crotalidae e Viperidae estão associadas a diversas atividades biológicas, como hemorrágica, fibrinolítica, inibidora da agregação plaquetária, proteolítica, neurotóxica e miotóxica. Dentre os constituintes de venenos de serpentes, merece destaque o grupo formado pelas metaloproteases, que compreende uma grande família de toxinas, com aproximadamente 200 membros catalogados, envolvendo uma marcante diversidade de estruturas e funções biológicas. Em meio a essa diversidade estrutural e funcional, um subgrupo de metaloproteses do tipo PIII, que apresenta atividade indutora de apoptose, vêm sendo alvo de inúmeras pesquisas. Ainda assim, muito pouco se conhece a respeito dessas proteínas. Em torno de doze exemplares dessas metaloproteases, como VAP1 e 2 de venenos de Crotalus atrox, foram identificadas. Desde o isolamento e purificação dessas proteínas, toxinas com alta similaridade às VAPs têm sido caracterizadas e purificadas do veneno de outras espécies de Viperídeos, que habitam diferentes lugares na Terra. Baseado no importante papel que essas metaloproteases indutoras de apoptose vascular podem desempenhar na angiogênese, através da inibição do crescimento de células neoplásicas, devido à indução da apoptose das células vasculares que nutrem o tumor, impedindo o crescimento acelerado e descontrolado das células tumorais, nós investigamos a expressão de metaloproteases VAP-like da glândula de venenos de três viperídeos, representantes do território brasileiro. Por clonagem molecular e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa, um gene calibrador de Crotalus durissus terrificus, homólogo a VAP1, nomeado crotastatin, e demais genes homólogos VAP1/crotastatin-like da glândula de veneno de Bothrops atrox, Crotalus durissus cascavella e Lachesis muta rhombeata foram expressos em diferentes níveis. O batroxstatin, o precursor crotastatin-like, de B. atrox, é expresso 87 vezes mais que crotastatin-1, de C. d. cascavella, e 7.5 vezes mais que lachestatins, de L. m. rhombeata. Além do mais, análises estruturais, in silico, das sequências de aminoácidos indicam que batroxstatin-2, crotastatin e lachestatin-1 e -2 apresentam domínios estruturais e sítio de ligação ao metal, iguais aos de VAP1, sendo dessa forma inclusos em um ramo filogenético que compreende as toxinas indutoras de apoptose

Orientador: Michel Eduardo Beleza Yamagishi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Herai_RobertoHirochi_D.pdf: 3625854 bytes, checksum: 3f19d10a9b0bb7f77091197cd302f66e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A grande quantidade de dados biológicos gerados recentemente permitiu verificar que os genomas são repletos de seqüências repetitivas (SR), como microsatélites e elementos genéticos móveis, altamente improváveis de ocorrer estatisticamente se os genomas fossem gerados a partir de uma distribuição aleatória de nucleotídeos. Tal comprovação motivou a classificação de tais seqüências e também a construção de diversas ferramentas de bioinformática, além de mecanismos de armazenamento baseados em sistemas de gerenciamento de bancos de dados (SGBD) para permitir localizá-las e armazená-las para posterior estudo. Entretanto, foi com a comprovação biológica da importância das SR, como no mecanismo de interferência por RNAi (SR reversa complementar), que as SR despertaram maior interesse por parte da comunidade científica. Atualmente, já há fortes evidências que associam as SR com fenômenos biológicos bastante interessantes, como o processamento de RNA por cis-splicing e a formação de transcritos quiméricos, freqüentes em organismos inferiores e muito raro em organismos superiores. Tais tipos de transcritos podem ser gerados a partir de trans-splicing ou, como conjecturamos nesse trabalho, pela transposição de elementos genéticos móveis (como por exemplo transposons ou retrotransposons). Em virtude disso, este projeto propõe a construção de metodologias de Bioinformática, disponibilizadas na WEB, para detectar transcritos quiméricos em genomas de organismos, tanto em versões draft ou em alta qualidade, e também estudar as SR que ocorrem no locus gênico dos transcritos envolvidos na formação de uma seqüência quimérica. As ferramentas propostas permitiram identificar, a partir de bibliotecas de transcritos de full-length cDNA, tanto de humanos quanto de bovinos, novos transcritos quiméricos provenientes de células de tecidos normais, e que não seguem splice-sites canônicos na região de fusão dos transcritos envolvidos. Além disso, as seqüências encontradas apresentam uma elevada taxa de concentração de pares de SR do tipo reverso complementar no locus gênico dos dois transcritos que formam a seqüência quimérica. As ferramentas propostas podem ser utilizadas para outros organismos e direcionar trabalhos experimentais para tentar comprovar em bancada novos transcritos quiméricos, tanto em organismos inferiores quanto em superiores / Abstract: The recent availability of a huge amount of biological data allowed to know about the high concentration of repetitive sequences (SR) like microsatellites and genetic mobile elements in different genomes. Repetitive sequences are improbable to occur statistically if genome data were generated by a random distribution of nucleotides. Such observation motivated the classification of repetitive sequences, and the construction of several bioinformatics tools. Furthermore, several mechanisms to store repetitive sequences, which are based on data base management systems (DBMS) were proposed and created. They can be used to search for specific sequences to make a posteriori study. However, it was with the biological confirmation of the importance of repetitive sequences, like by the RNA interference (reverse complement, or inverted repeat) mechanism, that the scientific community gained more interest by such sequences. Actually, there is strong evidence that associates the repetitive sequences with some interesting biological phenomena, like in RNA processing by cis-splicing, and in chimeric transcript formation mechanism. This last one is very frequently in inferior organism, but rare in superior organisms. Such types of transcripts can be generated by trans-splicing, or like conjectured in this work, by the retrotransposition of mobile genetic elements (like transposons or retrotransposons). In this way, this work proposed the construction of several Bioinformatics methodologies, available in the WEB, to detect new evidences of chimeric transcripts in genomes of different organisms, both in draft genome and in high quality genome assemblage. We also studied repetitive sequences in gene loci of the involved transcripts in a chimeric sequence formation. The proposed tools allowed us to identify, using a full-length cDNA databank, new chimeric transcript candidates in human and in bovine genome. They are from cells of normal tissues, and do not follow canonical splice-sites in the fusion region of the involved transcripts. Moreover, it was possible to show that the detected sequences have high concentration pairs of reverse complement type of repetitive sequences in gene loci of the two involved transcripts, which originated a new chimeric transcript candidate. The created bioinformatics tools can be used in other organisms in addition to the one used in this work, leading to the proposition of new experimental work to try to prove in vivo new chimeric transcripts, both in superior organism and in inferior organism / Doutorado / Bioinformatica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.

Os mecanismos da infertilidade relacionada à endometriose ainda não foram esclarecidos, embora diversos estudos proponham um efeito deletério desta doença sobre a qualidade oocitária (QO). No entanto, a análise de oócitos em pacientes com endometriose não é rotineiramente exequível, uma vez que os oócitos humanos raramente são doados para pesquisa e sua aplicação em técnicas invasivas impede sua utilização em procedimentos de reprodução assistida. Neste contexto, as evidências sugerem que as células cumulus (CC) podem ser utilizadas como biomarcadores indiretos capazes de prever a QO. Desta forma, através de um estudo inédito, objetivamos determinar o perfil diferencial de transcritos em CC de mulheres inférteis, com e sem endometriose avançada, submetidas à estimulação ovariana controlada para injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Para tanto, realizamos um estudo caso-controle, que analisou via sequenciamento de nova geração de RNA (RNA-Seq), 3 grupos (controle, endometriose III/IV sem endometrioma e endometriose III/IV com endometrioma), com 3 pools de 3 pacientes cada. Dentre os principais genes desregulados identificados nas comparações entre os grupos com endometriose avançada e mulheres sem a doença foram evidenciados transcritos com expressão alterada envolvidos na via de fosforilação oxidativa, genes relacionados aos processos da acetilação e conjugação de ubiquitina, além de genes associados a via de biossíntese do colesterol e do estradiol. Esses resultados demonstram que as CC de mulheres inférteis com endometriose avançada apresentam alterações moleculares possivelmente relacionadas ao desenvolvimento folicular e oocitário. Através do enriquecimento dos principais genes desregulados, nossos dados indicam as potenciais vias alteradas nesse processo que podem interferir na aquisição da competência gamética e por sua vez, mediar o comprometimento da fertilidade dessas pacientes. / The endometriosis related infertility mechanisms still remain to be elucidated, although several studies propose a deleterious effect of this disease on oocyte quality. However, the oocyte analysis in patients with endometriosis is not routinely feasible, since human oocytes are rarely donated to researches and their application in invasive techniques precludes their use in reproduction procedures. In this context, evidences suggest that cumulus cells (CC) could be used as indirect biomarkers capable of predicting oocyte quality. Thus, through an unprecedented study, we aimed to determine the differential transcripts profile in CC of infertile women with and without advanced endometriosis and its different stages, undergoing controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Therefore, we performed a case-control study, which analyzed by RNA next generation sequencing (RNA-Seq), 3 groups (control, endometriosis III/IV without endometrioma and endometriosis III/IV with endometrioma), with 3 pools of 3 patients each. The comparison of top deregulated genes among groups of advanced endometriosis and control patients show us altered genes associated with oxidative pathways, acetylation and ubiquitination process, aside from genes related to cholesterol and estradiol regulation. These data elucidated that CC of infertile woman with advanced endometriosis carried essential molecular alteration linked with follicular and gametic development. Through enrichment of the top deregulated genes, we can point out the potential pathways altered in this process toward oocyte commitment and infertility in these patients.