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Péptidos de calreticulina de trypanosoma cruzi con potencial antiangiogénico y antitumoralPeña Álvarez, Jaime Enrique January 2017 (has links)
Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal.
Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal.
Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.
A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario.
Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.
A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario.
Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.
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Expresión y purificación del factor acelerador del decaimiento de la convertasa recombinante de Trypanosoma cruziMendel Reyes, Yael Andrea January 2016 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, protozoo perteneciente a la familia Trypanosomatidae, es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El principal mecanismo de transmisión de esta enfermedad es vectorial, por medio de insectos hemípteros hematófagos de la familia Reduviidae.
Los tripomastigotes, formas infectantes del parásito, son capaces de resistir la acción del Sistema del Complemento (C) del hospedero, importante componente efector de la respuesta inmune innata. Se describen 3 vías de activación: clásica (VC), alterna (VA) y de las lectinas (VL), las cuales se activan en forma de cascada, por lo cual el C debe ser finamente regulado, impidiendo el daño en células del hospedero. En mamíferos, una proteínas reguladoras del C es el factor acelerador del decaimiento de la convertasa (DAF). DAF actúa inactivando las proteínas C3 y C5 convertasas de la VC y VA, acelerando su decaimiento.
Se ha reportado que T. cruzi expresa factores reguladores del C similares a los del hospedero mamífero, inhibiendo su activación. Entre estos, se ha identificado la expresión de una proteína con función similar a DAF humana (T-DAF), de la cual sólo se han expresado parcialmente algunos fragmentos y se desconoce gran parte de sus funciones.
En esta memoria de título se amplificó e insertó la secuencia nucleotídica codificante para la proteína de T. cruzi T-DAF en un vector de expresión de Escherichia coli. Utilizando bacterias transformadas con el plasmidio generado, se expresó y purificó en condiciones nativas la proteína recombinante T-DAF y se caracterizó su estructura tridimensional mediante un modelamiento in silico. / Trypanosoma cruzi, protozoan belonging to the Trypanosomatidae family, is the causative agent of Chagas disease. The main mechanism of transmission of this disease is through blood-sucking insects belonging to the Reduviidae family.
Trypomastigotes, infectious forms of the parasite, are able to resist the action of the complement system (C), an important effector of the innate immune response in mammals. C has 3 activation pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP) pathways. These 3 pathways are activated sequentially. For this reason, the activation of the C should be finely regulated in order to prevent damage on the host cells. In mammals, an important C regulatory proteins is the decay accelerating factor (DAF). DAF acts by inhibiting the C3 and C5 convertase proteins activation of the CP and AP, accelerating its decay.
It has been reported that the parasite expresses C regulatory proteins similar to those present in the mammalian host, inhibiting C. One of these C regulatory proteins has a similar function of human DAF (T-DAF), however, it has only been expressed partially and most of their functions are unknown.
In the present work, the nucleotide sequence coding for the protein of T. cruzi T-DAF was amplified and inserted into an expression vector for Escherichia coli. Using bacteria transformed with this vector, the recombinant protein T-DAF was expressed and purified under native conditions, and its three dimensional structure was characterized by an in silico modeling. / Financiamiento: Proyectos FONDECYT de Iniciación: Nð11110251 y Nð1130113.
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