Se analizó la utilización de medicamentos biológicos ranibizumab (2,3mg/0.23mL) y bevacizumab (400mg/16mL) en el Servicio de Oftalmología del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins durante el periodo mayo 2011-mayo 2012, utilizando el análisis descriptivo-retrospectivo de los reportes de consumo de Farmacia, hoja de trabajo de la Unidad de Mezclas Oncológicas e historias clínicas. Los objetivos de este estudio fueron: determinar el consumo cuantitativo y los costos del ranibizumab y bevacizumab, los resultados de la utilización de los medicamentos biológicos y describir los esquemas de tratamiento. De los 194 pacientes tratados con los medicamentos de estudio, 160 tenían como diagnóstico degeneración macular relacionado con la edad (DMRE) exudativa, 89 del sexo femenino y 71 de sexo masculino de los cuales el 55,6% están dentro del grupo etario 66-80 años. En total, se administraron 319 dosis (319 viales) de ranibizumab y 83 dosis (12 viales) de bevacizumab generando un gasto de S/. 907992,6 nuevo soles de los cuales, aproximadamente, el 93.3% lo genera el ranibizumab. El costo promedio el tratamiento farmacológico de la DMRE exudativa con ranibizumab es S/.5310,00 y con bevacizumab es S/.606.88 nuevo soles. Los pacientes con DMRE exudativa tratados con ranibizumab + bevacizumab y ranibizumab tuvieron una buena evolución en un 32% y 22% respectivamente. La principal prescripción del ranibizumab como monoterapia y en combinación con bevacizumab fue DMRE exudativa y para el bevacizumab (monoterapia) fue retinopatía diabética y edema macular. La DMRE exudativa fue tratada como mínimo 1 mes y como máximo por 12,4 meses durante el cual se administraron en promedio 2,3 números de dosis con intervalos de tiempo que va de 0,9 meses a 9,9 meses de una dosis a otra. / --- The use of biological drugs Ranibizumab (2,3mg/0,23ml) and Bevacizumab (400mg/16ml) was analyzed at the Ophthalmology Service from the National Hospital Edgardo Rebagliati Martins during the period May 2011 – May 2012, using the descriptive – retrospective analysis of the consumer reports of Pharmacy, worksheet of the Oncological Mixtures Unit and medical records. The objectives of the study were: determine the quantitative consumption and the costs of Ranibizumab and Bevacizumab, the results using biological drugs and describe the treatment schemes. Of the 194 total patients treated with the study drugs, 160 had a diagnosis of macular degeneration associated with age (MDAA) exudative, 89 of them female sex and 71 male sex of which 55,6% are in the age group of 66 – 80 years old. A total of, 319 doses (319 vials) of Ranibizumab and 83 doses (12 vials) of Bevacizumab were administered generating an expense of S/. 907992,6 of which approximately 93.3% was generated by Ranibizumab. The average cost for the pharmacological treatment of MDAA exudative with Ranibizumab and Bevacizumab are of S/.5310,00 and S/.606,88 respectively. The patients with MDAA exudative treated with Ranibizumab + Bevacizumab and with just Ranibizumab had a good performance by 32% and 22% respectively. The main prescription of Ranibizumab as monotherapy and in combination with Bevacizumab was for MDAA exudative, and of Bevacizumab (monotherapy) was for diabetic retinopathy and macular edema. The MDAA exudative was treated 1 month as minimum and 12,4 months at the most during which were administered an average of 2,3 numbers of doses with time intervals of 0,9 months up to 9,9 months between each dose. Key words: Ranibizumab, Bevacizumab, antiangiogenic agents, macular degeneration associated with age exudative and choroidal neovascularization.

La formación de vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes, o angiogénesis, es un proceso esencial en el desarrollo del tejido normal. La mayor parte de la angiogénesis fisiológica ocurre en la etapa embrionaria, y en el adulto, el endotelio vascular es un tejido con un bajo índice de proliferación. Sin embargo, los ovarios presentan cíclicamente procesos asociados a angiogénesis. En el ovario, la angiogénesis acompaña al desarrollo folicular y a la formación del cuerpo lúteo, y de no existir concepción, esta red vascular involuciona. La extraordinaria rapidez con que los vasos sanguíneos aparecen y son reabsorbidos en cada ciclo ovárico, hace de este sistema un modelo ideal para el estudio de los elementos regulatorios de la angiogénesis, por lo que su mejor comprensión podría significar un gran avance para la investigación de la angiogénesis en eventos fisiológicos y patológicos. Distintos elementos regulan la angiogénesis en el ovario y otros tejidos. Entre ellos, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF[beta]) han sido asociados a eventos importantes en la angiogénesis ovárica fisiológica y patológica. El factor de crecimiento nervioso (NGF) también se ha relacionado con angiogénesis en otros tejidos, como el ganglio cervical superior en ratas neonatas. Además este factor gatilla la proliferación de células endoteliales humanas. NGF, a través de sus receptores trkA y p75, ejerce acciones esenciales tanto en el desarrollo ovárico como en la función del ovario. De hecho, NGF está presente en el ovario humano desde la etapa fetal. Sin embargo, se desconoce si NGF participa en la angiogénesis ovárica. Por otra parte, NGF modula la expresión de TGF[beta]1 y VEGF en distintos tipos celulares, pero tampoco se sabe si en el ovario dicha expresión es regulada por esta neurotrofina. En esta Tesis se propuso estudiar la participación de NGF como factor angiogénico en el ovario, y su acción en los niveles de proteína y mRNA de los factores VEGF y TGF[beta]1. Para cumplir con este objetivo, se trabajó con ovarios de ratas neonatas cultivados con NGF, ovarios de ratones neonatos NGF-deficientes (NGF KO), ratas prepúberes con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y ratones transgénicos prepúberes que sobreexpresan NGF en el ovario. Se analizaron los niveles de mRNA y/o proteína de VEGF y TGF[beta]1 en los ovarios de estos animales. También se cultivaron células de granulosa humana y se estimularon con NGF, para luego determinar los contenidos de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 y los niveles de proteína secretada en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos en ovario de roedores y en el cultivo de células de granulosa indican que NGF incrementa tanto el mRNA como la proteína de VEGF. Los niveles de TGF[beta]1 no se modificaron por NGF en los modelos estudiados. Con el objetivo de conocer el mecanismo mediante el cual NGF induce los cambios observados en el ovario, se estudió la participación de trkA, el receptor de alta afinidad para NGF. Se analizaron ovarios de ratones neonatos trkA-deficientes (trkA KO). Se determinó que en estos animales el contenido de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 es similar al encontrado en ratones silvestres, probablemente por un sistema de compensación que involucra el aumento de la expresión p75, el receptor de baja afinidad para NGF. También se analizó el efecto de K252a, inhibidor del receptor trkA, en células de granulosa humana tratadas con NGF. La preincubación con el inhibidor revirtió en forma significativa el aumento de mRNA y proteína de VEGF inducido por NGF. A continuación, se quiso saber si NGF inducía la activación de MAPK asociadas a la fosforilación del receptor trkA en el ovario, y si la producción del mensajero o proteína de VEGF y TGF[beta]1 dependía de esta vía de señalización. Para estudiar esto se utilizó el modelo de células de granulosa humana en cultivo. Análisis de western blot mostraron que hubo un incremento significativo en la proporción de proteínas ERK 2 fosforiladas respecto de ERK 2 totales, luego de 5 minutos de estimulación con NGF. Además, el incremento en la expresión de mRNA y proteína de VEGF fue prevenido por la incubación previa con U0126, un inhibidor de la proteína MEK, responsable de la fosforilación de ERK 1/2. El factor de transcripción HIF1 es uno de los responsables de la activación transcripcional de VEGF como respuesta a la hipoxia, pero también frente al estímulo con factores de crecimiento. No se produjo un cambio en el contenido de mRNA de la isoforma inducible de HIF1, HIF1[alfa] en células de granulosa humana estimuladas con NGF 50 ng/ml por 8 horas. Sin embargo, en ovario de rata neonata en cultivo, el contenido de mRNA de HIF1[alfa] aumenta en los tejidos estimulados con NGF por 2 horas. Finalmente, se quiso verificar si existían acciones indirectas de NGF sobre la proliferación de células endoteliales, a través del aumento en los niveles de VEGF. Para esto se realizó un ensayo de angiogénesis in vitro, en el cual el medio condicionado de células de granulosa tratadas con NGF se utilizó para estimular células endoteliales provenientes de cordón umbilical humano (células HUVEC). El medio condicionado no indujo mayor proliferación de células endoteliales, probablemente debido a que la concentración de VEGF en éste era muy baja para estimular la proliferación en las células HUVEC. Sin embargo, es muy importante destacar que estudios in vivo realizados en ratas con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y en ratones transgénicos que sobreexpresan NGF en el ovario, demostraron que esta neurotrofina es capaz de incrementar la vascularización en ovario de roedores prepúberes. Los resultados aquí reportados no permiten establecer si el efecto de NGF sobre la vascularización ovárica es una consecuencia del aumento de VEGF. La señalización de NGF es esencial para la ovulación. Por otra parte, se produce un marcado aumento de la expresión ovárica de VEGF en la etapa periovulatoria. Los resultados presentados indican que NGF es capaz de aumentar la expresión de VEGF y la vascularización ovárica. De acuerdo con lo anterior, existiría una asociación entre el alza periovulatoria de NGF, y el aumento de VEGF y de los capilares ováricos. Esto podría tener importantes aplicaciones en el área de la medicina reproductiva y las terapias contra el cáncer, ya que amplía la información acerca de los elementos reguladores de la angiogénesis en el ovario.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La angiogénesis es la generación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Fisiológicamente, se produce sólo en casos excepcionales (inflamación crónica, ciclo menstrual, cicatrización, etc.), y es un mecanismo fundamental para el crecimiento de un tumor, desde los 2 mm3. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. CRT humana (HuCRT) y su dominio N- terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis, inhibiendo así la proliferación de células endoteliales. Anteriormente, en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), se ha descrito que CRT de Trypanosoma cruzi (TcCRT) es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo (CAM). Estas propiedades también son expresadas por TcCRT y su dominio N-terminal, en ensayos ex vivo e in vitro, en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies de mamíferos, Rattus rattus y Homo sapiens sapiens. Este efecto se correlaciona, en experimentos in vitro, con la inhibición de la morfogénesis capilar, la proliferación y la migración de las células endoteliales y con la internalización de TcCRT por estas células, también descrito en el LIAM. El objetivo general de este estudio fue validar los resultados antiangiogénicos de TcCRT obtenidos in vivo en aves, así como los generados in vitro y ex vivo, con varias especies de mamíferos, usando ahora un ensayo in vivo en un modelo mamífero. Esto se basa en la posibilidad de que las moléculas que regulan la angiogénesis pueden actuar de forma diferente en diferentes especies. Matrigel es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Entre los ensayos in vivo descritos para medir la angiogénesis, está el ensayo de tapón de Matrigel, que se utilizó en esta investigación, que se basa en la siguiente hipótesis: Dadas las propiedades antiangiogénicas que TcCRT expresa en una variedad de ensayos in vitro, ex vivo, en células mamíferas y, también in vivo en aves, entonces, TcCRT inhibirá la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en mamíferos (Mus musculus). Los objetivos específicos para satisfacer esta hipótesis, fueron: 1. Estandarizar el ensayo de tapón de Matrigel in vivo para medir angiogénesis, 2. Estandarizar la concentración de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) por tapón de Matrigel, 3. Determinar la presencia de TcCRT recombinante (rTcCRT) y HuCRT recombinante (rHuCRT) en extracto proteico de tapones de Matrigel, y 4. Cuantificar el efecto de rTcCRT y rHuCRT sobre la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en ratón. 500μl de Matrigel, que contiene 300ng de bFGF (para promover la infiltración de células endoteliales), fueron inoculados por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Siete días más tarde, fue posible diseccionar y analizar los tapones, tanto inmunológica e histológicamente. Además, los anticuerpos mono y policlonales, anti-TcCRT y anti- HuCRT reconocieron las proteínas recombinantes en extracto proteico de tapón de Matrigel. rHuCRT y rTcCRT inhibieron la proliferación de células endoteliales promovido por bFGF en los tapones de Matrigel. En síntesis, se demostró que TcCRT inhibe la migración de células endoteliales a una matriz fisiológica semisólida, tal como el Matrigel ubicado subcutáneamente en ratones. Dado que la migración de células endoteliales es un pre-requisito para la morfogénesis capilar, es muy probable que este ensayo se correlacione con la capacidad de inhibición que la molécula parasitaria ejerce in vivo sobre el crecimiento tumoral. Este es el primer estudio que define un efecto antiangiogénico para la calreticulina parasitaria, in vivo en mamíferos. Aun cuando, más indirectamente, este efecto podría correlacionarse con las propiedades antitumorales de T. cruzi, reportadas por otros laboratorios, y recientemente confirmadas en el LIAM

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La preeclampsia es un síndrome caracterizado por remodelación anormal de las arterias espirales, defectuosa vasculogénesis y disfunción en el endotelio vascular materno. Sus características clínicas más importantes son: hipertensión y proteinuria. El objetivo de este estudio fue evaluar el valor predictivo de marcadores bioquímicos relacionados con angiogénesis y estrés oxidativo sobre la ocurrencia de esta enfermedad. Se invitó a participar de este estudio a mujeres embarazadas entre las 11 – 14 semanas y se obtuvieron muestras de sangre que se congelaron hasta ser analizadas. Se seleccionaron todas las muestras de sangre de embarazos preeclámpticos (n=32) y cinco controles para cada caso provenientes de embarazos normotensos (n=143). El análisis multivariado mostró que solamente dos marcadores bioquímicos (sFlt1 y PlGF) y uno clínico (IMC) son independientes y significativamente predictores de la aparición de preeclampsia a las 11-14 semanas de gestación. Además, se demostró que la combinación de éstos, pueden predecir en el primer trimestre de la gestación a más de las mitad de las mujeres que desarrollarán preeclampsia, con solo un 10% de falsos positivos

La presente tesis tiene como objetivo principal el desarrollo de un controlador de presión de oxígeno contenido dentro de una cámara hiperbárica que no cuenta con cierre hermético, para que la misma pueda cumplir con las necesidades mínimas indicadas por los especialistas, que serán presentadas en el capítulo 1, de manera óptima, durante el tiempo de tratamiento. Para la elección del controlador se realizaron pruebas experimentales con un microcontrolador PIC, para los diversos tipos de control (P, PI, PD y PID), y, al mismo tiempo, pruebas simuladas con la herramienta Simulink, del programa MATLAB. Además, fueron comparados dos métodos para el diseño del controlador: el método de la respuesta al escalón de Ziegler-Nichols y el método del ángulo faltante. Con los resultados obtenidos, se logró demostrar que es posible compensar las fugas de oxígeno y mantener, el mayor tiempo posible, la presión de trabajo constante, según las especificaciones de los médicos. Finalmente, se concluye que el controlador adecuado para esta aplicación, es el control PID desarrollado con el método de Ziegler-Nichols, por su menor sobreimpulso, menor tiempo de establecimiento y su efecto de corrección del error (eliminación offset). / This thesis' main objective is to develop a controller for the pressure generated by the oxygen contained inside a hyperbaric chamber with no hermetic seal, so that it can accomplish optimally the requisites indicated by the specialists (which will be shown in chapter 1),during the treatment. For the election of the controller, experimental tests were carried out with a PIC microcontroller for the different types of control (P, PI, PD, and PID), as well as simulated tests with MATLAB's Simulink tool. Additionally, two methods for controller design were compared: Ziegler-Nichols' step response method and the root locus approach. With the obtained results, it was demonstrated that the oxygen leaks were able to be compensated, maintaining the pressure operation point constant as much as possible in accordance with the medics' specifications. Finally, it is concluded that the adequate controller for this application is the PID controller designed with Ziegler-Nichols' method due to its smaller overshoot, its smaller settling time and its error correction effect (offset elimination). / Tesis

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La búsqueda de tratamientos alternativos para el cáncer es un gran desafío para la comunidad científica moderna, ya que la aparición de resistencia a los tratamientos utilizados, por parte de los diversos tipos de tumor, es un problema aún sin resolver. Se ha visto y comprobado que la angiogénesis (desarrollo de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes) es un fenómeno estrechamente ligado al crecimiento tumoral y la capacidad metastásica del cáncer, por lo que su limitación es un nuevo camino de investigación en búsqueda de un tratamiento definitivo. Con el objetivo de estudiar el efecto angiogénico tumoral analizamos el efecto del implante intramuscular profundo de tumor TA3-MTX-R. en el modelo de ratón (Mus musculus) AJ hembras, clínicamente sanas. Para ello, se utilizaron 2 grupos de 8 ratones cada uno. Un grupo control (A) al cual se le aplicó suero fisiológico y un grupo experimental (B), al cual se le inoculó por vía intramuscular tumor el mismo día. A los ratones se les realizó mediciones del crecimiento tumoral y se esperó hasta la muerte natural de estos, debido al tumor primario y sus metástasis. Se realizó estudio histológico e inmunohistoquímico con conteo de los capilares en un área de estudio estándar, para evaluar angiogénesis, tanto en tumor como en tejidos blanco de metástasis. Los resultados se analizaron estadísticamente, mostrando un importante aumento en la angiogénesis de los ratones con tumor versus los controles. Se constató también que el tumor tiene la capacidad de sacar a las células endoteliales de su estado de reposo del ciclo celular (G0), para hacerlas entrar en una proliferación acelerada

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis. Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009). Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos. Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad. Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis. / Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis. Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile. Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis. Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.

Como otros tumores sólidos, el sarcoma de Ewing (SE) requiere de un aporte vascular adecuado que permita nutrir y oxigenar a las células tumorales. En el SE, la vascularización tumoral se encuentra caracterizada principalmente por los procesos de vasculogenesis, mimetismo vascular y angiogénesis. Considerando la participación de CAV1 en el aporte vascular, nos planteamos demostrar que CAV1 juega un papel importante en el desarrollo vascular de la enfermedad. Estableciendo tres nuevos modelos de baja expresión de CAV1 en células se SE (RDES, SKES1 y TC71), fue posible observar la reducción en el desarrollo tumoral en xenoinjertos, y a su vez esta reducción fue relacionada con la disminución en la densidad micro-vascular. Este trabajo demuestra el efecto directo del silenciamiento de CAV1 sobre el proceso angiogénico en el SE, regulando la respuesta de la célula endotelial ante las señales producidas por la célula tumoral. Nuestros resultados mostraron que las células endoteliales presentan mayor migración ante el estímulo de las señales producidas por la célula tumoral. Mediante el análisis de expresión de diferentes factores utilizando RT-PCR, fue posible determinar que la expresión de bFGF era afectada en los modelos analizados como efecto del silenciamiento de CAV1. Para determinar el mecanismo molecular a través del cual CAV1 regula la angiogénesis en el sarcoma de Ewing, partimos del análisis de expresión de 3 miembros de la familia Eph descritos como pieza clave en el desarrollo vascular. La expresión del receptor EphA2 en los modelos de baja expresión de CAV1 mostró una disminución en los clones, donde el silenciamiento de CAV1 conlleva la redistribución y reducción EphA2. Los análisis mostraron además una interacción entre ambas proteínas. Establecida la relación EphA2/CAV1, analizamos el efecto de la estimulación de EphA2 a partir de EfnA1 y confirmamos que las células con baja expresión de CAV1 presentaban una respuesta menor. La estimulación resultó en el incremento de la fosforilación de AKT, sugiriendo que los efectos podrían depender de la actividad quinasa del receptor. Para respaldar esto, las células RDES y TC71 fueron transfectadas con un dominante negativo de EphA2 que no modificaba la expresión de CAV1 (EphA2-Kd). Los modelos EphA2-Kd reprodujeron los resultados observados en los modelos de baja expresión de CAV1. La estimulación del modelo TC71-EphA2-Kd con la proteína recombinante EfnA1, mostró tanto la activación de AKT como la sobreexpresión de bFGF, reproduciendo en cierta medida lo observado por el silenciamiento de CAV1 y destacando la importancia de la actividad dependiente de quinasa de EphA2 en el proceso angiogénico de la enfermedad. Considerando que CAV1 es necesario para el correcto funcionamiento de las rutas de señalización controladas por EphA2 en el SE, decidimos determinar la implicación de CAV1 y EphA2 en el mimetismo vascular de la enfermedad. Se decidió analizar el papel independiente de quinasa del receptor EphA2 como una posible pieza clave en el proceso de mimetismo vascular en el SE. Nuestros resultados mostraron que el silenciamiento de CAV1 reduce el desarrollo de vasos miméticos in vivo e impide la formación tubular in vitro. Además, el efecto de bloquear la actividad quinasadependiente del receptor EphA2 mostró que la actividad quinasa del receptor no afecta al proceso de mimetismo vascular en esta entidad tumoral. Para confirmar la participación de EphA2 en el proceso de formación de vasos miméticos, se transfectó un mutante que carece de toda la región citoplasmática del receptor EphA2 (ΔCyto), eliminando así sus funciones dependientes e independientes de quinasa. Los resultados mostraron que el bloqueo total del receptor tenía un efecto negativo en la formación de estructuras tubulares. Estos resultados confirman la importancia de la actividad prooncogénica del receptor EphA2 en el sarcoma de Ewing. / We established low CAV1 expressing models by knocking down CAV1 in TC71, RDES and SKES1 Ewing sarcoma (ES) cells by stably transfecting a previously validated shRNA construct. In vivo studies showed a decrease in tumor volume from the CAV1 knocked-down clones when compared with controls. This correlated with a reduction in microvascular density (MVD) and higher levels of necrosis. Conditioned media from CAV1 knocked-down cells showed reduced capability to promote migration of endothelial cells with no changes in proliferation. Different pro-angiogenic factors were analyzed by RT-PCR in the models and, downregulation of bFGF was observed in all four. Results suggested that CAV1 was indirectly affecting bFGF expression. EphA2 expression was observed in ES cell lines and tumor samples. CAV1 knocked-down cells showed a reduction in EphA2 phosphorylation as well as a displacement from the membrane to the cytoplasm. Furthermore, we showed that the CAV1/EphA2 interaction was necessary for Eph-mediated signaling. To further support these results, RDES and TC71 cells were stably transfected with a dominant negative of EphA2 that did not alter the expression of CAV1 (EphAh2-kd). EphA2-Kd models were able to replicate the effects observed in the CAV1 knocked-down models, where the stimulation of the TC71-EphA2-Kd model with the recombinant protein EfnA1, showed both the activation of AKT and the overexpression of bFGF. These results replicate the effect of silencing CAV1 and highlighted the importance of the kinase-dependent activity of EphA2 in the angiogenic process in ES. We decided to analyze the kinaseindependent role of EphA2 as a possible key in the process of vascular mimicry in ES. Our results showed that the silencing of CAV1 reduces the development of mimetic vessels in vivo and prevents the tubular formation in vitro. In addition, our results showed that the kinase-dependent activity of the receptor does not affect the process of vascular mimicry in ES. Moreover, we stably transfected a mutant that lacks all the cytoplasmic region of EphA2, blocking its kinase-dependent and –independent activities. Results showed a negative effect on the formation of tubular structures. These results confirm the importance of the pro-oncogenic activity of EphA2 in ES.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 suelisuzigan_tese_parte5.pdf: 78044 bytes, checksum: ede6079670fe7d13ddd7e25ead03f505 (MD5) Previous issue date: 2002-05-03 / Introduction. Tumor growth and metastasis depend greatly on angiogenesis. There are several angiogenic growth factors able to induce new vessels in renal tumors, but the most important are vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (b-FGF). The aim of our study was to investigate expression of b-FGF and to quantify microvessel density (MVD) in oncocytomas and renal cell carcinomas (RCCs) and to relate these parameters of tumor vascularity to other clinicopathological features. Material and Methods. b-FGF and CD31 immunostaining were performed on formalin-fixed paraffin-embedded archival tissues from Larpac Laboratories files, including 36 RCCs (10 conventional, 10 papillary, 8 sarcomatoid, and 8 chromophobe) and 5 oncocytomas. Angiogenesis was quantified microscopically by two independent observers. Results. b-FGF was positive in all five oncocytomas and only in seven of 36 RCCs: 5 of conventional type, 1 papillary, and 1 chromophobe. All sarcomatoid carcinomas were negative. The expression of b-FGF was not related to tumor size, grade, stage, or short survival in either group. MVD mean value was 124.16 ± 50.1 in oncocytomas and 91.54 ± 52.4 in RCCs. The pattern of vascularization observed in oncocytomas was characterized by a fine vascular network around groups of tumor cells although in RCCs the microvessels tended to be more disorganized. When analyzing only carcinomas, patients who died within 12 months after the diagnosis had a tumoral MVD mean value significantly higher (124.12 ± 75.2) than that observed in patients who were still alive one year after diagnosis (80.34 ± 37.8). ix Conclusion. We demonstrate that b-FGF is expressed more often in oncocytomas than in RCCs but MVD is similar in both groups of tumors. The high expression of b-FGF in oncocytomas may reflect the peculiar pattern of vascularization of these tumors. High MVD in rapidly lethal RCCs is an indication that angiogenesis may be correlated with the degree of malignancy of these tumors. / O desenvolvimento dos tumores e das suas metastases dependem em grande parte da angiogenese tumoral. Existem varios fatores de crescimento capazes de induzir à neoformação vascular nas neoplasias renais, porém, os mais importantes são o fator de crescimento do entotélio vascular (vegf) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bfgf). O objetivo deste estudo foi o de investigar a expressão do b-fgf e a densidade microvascular (dmv) nos oncocitomas e nos carcinomas de células renais (ccrs) e correlacionar estes parâmetros da vascularização tumoral com outros ascpectos clínico-patológicos. Material e métodos. O estudo imunohidtoquímico para o b-fgf e o cd31 (densidade microvascular) foi realizado em material fixado em formalina e incluído em parafina de 36 casos de ccrs (10 convencionais, 10 papilíferos, 8 sarcomatóides e 8 cromófobos) e 5 oncocitomas, oriundos de exames anátomo-patológicos por dois observadpres independentes. Resultados. Nota de Resumo Foi encontrada positividade para o b-fgf em todos os 5 casos de oncocitomas e em 7 dos 36 casos de ccrs: 5 do tipo convencional, um papilífero, e um cromófobo. Todos os carcinomas sarcomatóides mostraram-se negativos. A expressão tumoral do b-fgf não apresentou correlação com tamanho tumora, grau histológico, estadio patológico, ou sobrevida a curto prazo em nenhum dos grupos. O valor médio da dvm foi de 124,16 +/- 50,1 nos oncocitomas e de 91,54 +/- 52,4 nos ccrs. O padrão de vascularização observado nos oncocitomas era caracterizado por um delicado leito vascular envolvendo grupos de celulas tumorais, enquanto que nos ccrs a microvascularização se apresentou de forma mais organizada. Entre os carcinomas, os tumores que se mostraram letais nos 12 primeiros meses após o diagnóstico, apresentaram um ídice angiogênico significativamente maior (124,12 +/- 75,2) em relação aos pacientes que ainda permaneciam vivos um ano após o diagnóstico (80,34 +/- 37,8). Conclusão. Demostramos que o b-fgf está expresso mais freqüentemente nos oncocitomas do que nos ccrs. Nota de Resumo Apesar de as dmv ser semelhante em ambos os grupos tumorais, observou-se um padrão de vascularização característico nos oncocitomas. Uma dvm mais elevada nos ccrs, rapidamente letais é indicativo de que a angiogenese possa estar correlacionada com grau de malignidade destes tumores.