OBJETIVO: Determinar las complicaciones, características clínicas y bioquímicas del síndrome de ovario poliquístico en pacientes atendidas en el Hospital Docente Madre-Niño San Bartolomé, durante el periodo 2010 -2012. METODOLOGÍA: El estudio es observacional, descriptivo-comparativo, transversal y retrospectivo. En el estudio se analizó 170 historias clínicas de pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP) en el periodo del 2010-2012. Para describir a las variables cuantitativas se usó medidas de tendencia central y dispersión, para las cualitativas se usó frecuencias absolutas y relativas, y para el análisis bivariado la prueba chi-cuadrado. RESULTADOS: Las pacientes en estudio tenían en promedio 27.3±4.8 años, donde el 53.5% tiene entre 26 a 35 años, estado civil conviviente (57.6%) y grado de instrucción secundaria (86.6%). La mitad de las pacientes manifestó que su inicio sexual fue a partir de los 19 años a más, con antecedentes de una sola pareja sexual principalmente, casi el 40% no tuvo gestaciones, el 28.8% fueron primíparas al igual que segundíparas. El 37.1% tuvieron partos a término, el 35.9% tuvieron abortos. La mayoría no usaban algún método anticonceptivo, con respecto a las características del ciclo menstrual la alteración más frecuente fue la oligomenorrea (18.2%) seguida de la amenorrea (1.8%). Entre las características clínicas más frecuentes, el 55.3% tuvieron IMC aumentado, el 62.4% presentó dismenorrea y el 35.3% presentó irregularidad menstrual; entre las características clínicas menos frecuentes fueron dislipidemia (5.3%), hirsutismo (8.2%), acné (5.9%), acantosis nigricans (1.8%) y dispareunia (2.9%). Las características bioquímicas en estas pacientes fueron: el nivel de testosterona, FSH, glucosa, prolactina se mantuvieron en rangos normales en la mayoría de las pacientes. No obstante, se presentaron pacientes (2% y 33%) con rangos aumentados de testosterona, FSH y prolactina. Entre los exámenes menos solicitadas se encontraban la prueba del TSH y DHEAS y solo se presentaron entre 3 a 6 casos con valores aumentados en estas pruebas. La complicación más frecuente del SOP fue la infertilidad en el 57.1% y solo se encontró un caso de diabetes mellitus tipo 2. Al comparar las características clínicas entre las pacientes que presentaron y no infertilidad, se presentaron diferencias entre la proporción de pacientes que presentaron irregularidad menstrual y dismenorrea; y al comparar los resultados bioquímicos se encontró que los niveles de FSH, prolactina y TSH fueron diferentes entre los grupos. CONCLUSIONES: La complicación más frecuente en pacientes con SOP fue la infertilidad, las características clínicas más frecuentes fueron IMC aumentado, irregularidad menstrual y dismenorrea. En el resultado del análisis bioquímico el nivel aumentado de testosterona fue el más frecuente.

Orientadores: Denise Engelbrecht Zantut Wittmann, Marcos Antonio Tambascia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garmes_HeraldoMendes_D.pdf: 21645590 bytes, checksum: a4b38d6d73ba2bba38173c083329660d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O hiperandrogenismo da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOPC) pode resultar de hiperinsulinemia decorrente da resistência periférica à ação da insulina. Assim, as drogas sensibilizadoras da ação da insulina tornam-se possível opção terapêutica para as pacientes. A relação entre hormônio luteinizante e hormônio folículo-estimulante (LH/FSH) encontra-se aumentada na SOPC, ocorrendo hiper-resposta do LH ao estímulo com hormônio liberador das gonadotrofinas hipofisárias (GnRH). Entretanto, permanece sem elucidação como a hiperinsulinemia induz ao hiperandrogenismo e se as ações da insulina na hipófise alterariam a liberação de gonadotrofinas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com pioglitazona sobre a resposta de insulina ao teste oral de tolerância à glicose (GTTO), o perfillipídico, os níveis séricos de andrógenos e globulina transportadora de hormônios sexuais (SHBG) e a resposta das gonadotrofinas hipofisárias frente ao estímulo com GnRH. Para detectar possíveis efeitos colaterais da droga avaliaram-se os perfis hepático, renal e hematológico.Foram selecionadas 15 pacientes obesas com SOPC, tratadas com pioglitazona 30mg/dia por 58 dias, submetidas a avaliações clínicas e laboratoriais antes, durante e ao final do tratamento. Verificou-se, de modo estatisticamente significativo, diminuição de 34,9% na resposta de insulina ao GTT, redução dos níveis séricos de testosterona total (1,48 ± 0,47vs 0,83 ± 0,27) e livre (8,94 ± 5,2 vs 3,69 ± 2,03), elevação de SHBG (21 ,87 ± 8,68 vs 25,62 ± 10,06) e diminuição de 14,8% na resposta do LH ao estímulo com GnRH. Resultados semelhantes são descritos utilizando-se metformina e troglitazona, porém não se encontraram na literatura avaliações com a pioglitazona ou estudos sobre alteração da resposta de LH ao teste de estímulo com GnRH. Concluindo, observou-se diminuição da resposta de insulina ao GTT acompanhada por redução significativa nos níveis de testosterona livre e total e aumento na concentração sérica de SHBG com o uso da pioglitazona. Adicionalmente, houve queda significativa na resposta do LH ao estímulo com GnRH. Novas investigações com o uso da pioglitazona devem ser conduzidas para que sejam estabelecidos os riscos e beneficios, auxiliando no entendimento fisiopatológico da SOPC / Abstract: The hyperandrogenism found in Polycystic Ovarian Syndrome(PCOS) can be a consequence of hyperinsulinemia as a result of peripheral resistance to insulin. Therefore, drugs used to induce insulin sensitizationhave become a possible therapeutic option for these patients. The relationship between luteinizing hormone/follicle-stimulating hormone (LH/FSH) is increased in PCOS and there is hyperresponsivity of LH to stimulation with gonadotropin-releasing hormone (GnRH). However, the reason why hyperinsulinemia produces hyperandrogenism and whether insulin action on the hypophysis alters gonadotropin liberation remains unknown. Our objective was to evaluate the resultsof treatment with pioglitazone on insulin response to the oral glucose tolerance test (GTT), serum levels of androgens and sexual hormone binding globulin (SHBG), lipidic profile and hypophyseal gonadotropin response to GnRH stimulation. In order to detect possible side effects of the drug the hepatic, renal and hematologic profiles were evaluated. We selected 15 obese patients with PCOS treated with pioglitazone 30mg/day for 58 days who had clinical and laboratorial evaluations before, during and after treatment. The outcome was a statistically significant decrease in insulin response to GTT by 34,9%, serum levels of total testosterone (1.48 ± 0.47vs 0.83 ± 0.27)and free testosterone (8.94 ± 5.2vs 3.69 ± 2.03), increase of SHBG (21.87 ± 8.68 vs 25.62 ± 10.06) and decrease in LH response to GnRH stimulation by 14,8%. Similar results are described using metformin and troglitazone, but we did not find in the literature pioglitazone evaluations or studies on alteration of LH response to GnRH stimulation test. In conclusion, a decrease in insulin response to GTT, accompanied by a significant reduction in free and total testosterone levels as well as increase in serum concentration of SHBG with pioglitazone was observed. In addition, there was a significant reduction in LH responseto GnRH stimulation. Further research with pioglitazone should be carried out to establish risks and benefits, assisting in the pysiopathologic comprehension of PCOS / Doutorado / Medicina Interna / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T10:52:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garmes_HeraldoMendes_M.pdf: 1631848 bytes, checksum: fed0142ad21dd75d72806c3fbb118f74 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: A falência ovariana precoce é caracterizada por amenorréia hipergonadotrófica antes dos 40 anos de idade e pode apresentar diversas etiologjas. Trabalhos recentes caracterizaram subgrupos destas pacientes com inúmeras evidências sugerindo auto-imunidade como fator responsável. Com objetivos de detectar o anticorpo antiovário neste subgrupo, inúmeras técnicas têm sido utilizadas. Contudo, a prevalência deste anticorpo na população com falência ovariana precoce :oão está estabelecida. Neste trabalho realizaram-se a extração e a solubilização de antígenos a partir de tecido ovariano humano. Os extratos assim obtidos foram caracterizados eletroforeticamente e utilizados para a detecção do anticorpo antiovário através das técnicas de imunodifusão simples e immunoblotting. Utilizando imunodifusão simples foram detectados anticorpos séricos em 5 (14%) pacie!1tes. Por outro lado, empregando o método de immunoblotting, 14 (40%) pacientes apresentaram reatividade para peptídeo com peso molecular de 30kDa. Após classificar as pacientes em dois grupos dependentes da presença ou não de reatividade à banda de 30kDa, não foram verificadas diferenças estatísticas quando avaliada a idade da menarca, idade de início dos síntomas e nível de gonadotrofinas. Estudos posteriores, como a caracterização das propriedades biológicas destes anticorpos e isolamento da fração com peso molecular de 30kDa, poderão trazer importantes subsídios para o entendimento dos fatores imunes envolvidos com a falência ovariana precoce / Abstract: Premature Ovarian F ailure is characterized by hypergonadotrophic ammenorrhea before the age of forty (40) and can present diverse aetiologies. There is innumerable evidences suggesting that auto immUIrity is a factor which responsible for this disfunction. To detect this antibody, several techniques have been used, however the prevalence in the population of women who have premature ovarian failure. has not been established yet. Human ovarian tissue was used with the purpose to extract soluble antigens to be able to use them in the detection of serum antibodies by means of simple immuno-diffusion and immunoblotting methods. 5/35 (14%) patients presented reaction by immunodifusion and specific reactivity was found for a protein wi1!b molecular weight of 30 kDa in 14/35 (40%) patient~ using immunoblotting. Nevertheless, even classificating these patient in two groups depending on the presence or not, of reactivity for peptide of 30 kDa, no diference with the regard the age of menarc, the age of onset of synptoms and the leveI of gonadotrophins was found. Later studies such as the characterization of biological properties of these antibodies and isolation of peptide of 30 kDa, could bring important aid for the understanding of premature ovarian failure / Mestrado / Medicina Interna / Mestre em Medicina

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / En la actualidad las parejas deciden postergar la maternidad más allá de los 30 años de edad, acercándose a la ventana de subfertilidad de la mujer. Este cambio en la conducta de la población disminuye la probabilidad de éxito del embarazo y también la natalidad. El periodo de subfertilidad en la mujer se asocia a una pérdida acelerada de la reserva folicular junto con un aumento en el tono adrenérgico del ovario, efecto observado tanto en humanos como en ratas. Ante esto, el comprender los mecanismos que aceleran el reclutamiento folicular durante el periodo de subfertilidad permitirá desarrollar potenciales terapias que faciliten la fertilidad durante esta etapa de la vida. Por esto, el objetivo de este trabajo es caracterizar el rol del kisspeptina como un factor clave del desarrollo folicular durante el periodo de subfertilidad en ratas y relacionarlo con el control simpático del ovario. En este trabajo planteamos que “El aumento del tono simpático ovárico durante el periodo de subfertilidad incrementa la expresión de kisspeptina, lo que se relaciona con cambios en la dinámica de crecimiento folicular”. Nuestros resultados muestran que: 1) Existe un aumento de la expresión de kisspeptina en el ovario de rata, que se correlaciona positivamente con un aumento del tono adrenérgico ovárico durante el envejecimiento, 2) El bloqueo β-adrenérgico y la denervación del nervio ovárico superior previenen el aumento de kisspeptina durante el envejecimiento, lo que se relaciona a una disminución en los folículos primordiales y un aumento de folículos secundarios y antrales. Más aún, este aumento en el desarrollo folicular se relacionó con una mayor expresión del receptor de FSH y 3) Kisspeptina antagoniza el efecto de isoproterenol (agonista β-adrenérgico) in vitro, antagonizando la expresión del FSHR inducida por isoproterenol. Además, un antagonista del receptor de kisspeptina (péptido P234) potencia el efecto de isoproterenol sobre la inducción de la expresión del FSHR. Estos resultados sugieren que kisspeptina es regulada por el tono adrenérgico del ovario y que el sistema simpático en conjunto con el kisspeptinérgico participa en la regulación de la expresión del FSHR, lo que puede explicar en parte los cambios en el reclutamiento folicular durante el periodo de subfertilidad / In the present days, couples decide to delay childbearing beyond the 30-year-old, approaching to the window of subfertility in women. This change in the behavior of the population had decreased the successful of pregnancy and birth rate. On the other hand, subfertility period in women has been associated with an accelerated loss of follicular reserve along with an increased adrenergic tone of the ovary, effect observed both in humans and rats. Given this, understanding the mechanisms that accelerates follicular recruitment during the subfertility period will help us develop potential therapies to improve fertility during this stage of life. Therefore, the objective of this work is characterize the role of kisspeptin as a key factor in follicular development during sub-fertility period using a rat model, and relate kisspeptin expression with the sympathetic control of the ovary. In this thesis we claim that "The increase in ovarian sympathetic tone during the period of subfertility increases the expression of kisspeptin, which is associated with changes in follicular development". Our results show that: 1) There is an increased expression of Kisspeptin in rat ovary that directly correlates with an increased ovarian adrenergic tone during aging, 2) The pharmacological blockade of β-adrenergic receptors and denervation of superior ovarian nerve, prevents kisspeptin increase during aging, which is related with a decrease in primordial follicles and an increase in antral and secondary follicles. Furthermore, this increase in follicular development was associated with increased expression of FSH receptor, and 3) Kisspeptin antagonizes the effect of isoproterenol (a β-adrenergic agonist) in vitro, antagonizing the FSHR induced expression for isoproterenol. In summary, these results suggest that kisspeptin expression is regulated by the adrenergic tone of the ovary and that the sympathetic system together with the kisspeptinergic system are involved in the regulation of FSHR expression, which may partially explain the changes in follicular recruitment during the subfertility period / Conicyt; Fondecyt

Doctor en Farmacología / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / El síndrome del ovario poliquístico (SOP), es la patología endocrina más común que afecta las mujeres durante su etapa reproductiva, se presenta en una variedad de fenotipos heterogéneos que van desde una condición de amenorrea hasta ciclos menstruales conservados y da cuenta de más del 75% de todas las formas de infertilidad ovulatoria. Hasta el momento no existen características únicas que tengan el suficiente valor predictivo que permitan explicar el desarrollo del SOP. De esta forma los modelos animales experimentales que presenten características de SOP, son muy valiosos para entender la etiología de este síndrome. En relación a ello, nuestro grupo de trabajo ha obtenido evidencia experimental que el ovario está bajo un control neuroendocrino efectuado por la participación interactiva de las gonadotrofinas, la inervación noradrenérgica y peptidérgica del ovario y una familia de factores neurotróficos que regulan las etapas iniciales de desarrollo folicular. Con modelos experimentales de administración de valerato de estradiol y de estrés por frío, se ha reunido evidencia que permite sugerir que la formación de ovario poliquístico en rata es consecuencia de un aumento de la actividad nerviosa simpática ya sea de origen local u originado a nivel hipotalámico y que se proyecta al ovario a través del nervio ovárico superior. En esta tesis se estudió un modelo farmacológico que remeda un tono adrenérgico aumentado, estimulando “in vivo” los receptores β-adrenérgicos mediante la administración del agonista isoproterenol, en su efecto sobre el desarrollo y mantención de la condición de ovario poliquístico en rata, así como la reversión mediante el bloqueo con el antagonista propranolol. Con este objetivo se administró una dosis de isoproterenol descrita para inducir hipertrofia cardíaca. Ratas hembras adultas recibieron por vía subcutánea 125µg/kg de peso durante 10 días. Tomando en consideración el tiempo requerido para completar el desarrollo folicular las ratas se sacrificaron en día de estro al finalizar el tratamiento (ISO 10+1) o 30 días después de finalizada la administración del agonista (ISO 10+30). Con el fin corroborar la relación causal de los cambios observados, se bloqueó el efecto del agonista mediante la administración conjunta del antagonista β-adrenérgico propranolol. Los resultados obtenidos mostraron que isoproterenol (ISO 10+1) además de generar hipertrofia cardíaca, altera el desarrollo folicular generando estructuras quísticas y que mientras isoproterenol está presente, los ovarios tienen una capacidad aumentada de secretar andrógenos. El bloqueo con propranolol no solo previene la hipertrofia cardíaca, sino que también evita la formación de quistes y revierte el efecto de isoproterenol sobre la actividad secretora de andrógenos. Treinta días después de finalizado el tratamiento (ISO 10+30) en el ovario todavía perduran las estructuras quísticas lo que pudo ser revertido por propranolol. La alteración en el desarrollo folicular inducido por el agonista no afectó la ciclicidad estral, ni al los niveles circulantes de progesterona, androstenediona, testosterona y estradiol ni capacidad ovulatoria estimada por presencia de cuerpos lúteos en el ovario y número de ovocitos presentes en el oviducto, lo que hace suponer que no hay compromiso del eje endocrino. Sin embargo se detectó aumento del nivel plasmático de LH y aumento del contenido intraovárico de NGF. Este aumento de neurotrofina, no se acompañó de cambios en otros marcadores nerviosos. El contenido de NE y de receptores β-adrenérgicos en ovario, y el contenido de NE y TH en gangio celíaco, sitio donde reside el soma de las neuronas simpáticas que inervan el ovario, no presentó diferencias con respecto al grupo control. Cabe señalar que el alza de ambos factores tróficos LH y NGF no fue revertido por propranolol. Si bien los resultados no permiten dilucidar si esta es una asociación cirucunstancial, el azla de NGF y la detección del recpetor p75NTR en la pared de los folículos en desarrollo y en las estructuras prequísticas como el folículo tipo III sugieren que esta señal trófica inducida por isoproterenol podría participar en la mantención de la condición de ovario poliquístico. En conclusión el presente trabajo indica que la estimulación β-adrenérgica es un componente del desarrollo y mantención de la condición de ovario poliquístico, abrendo la posibilidad de un manejo farmacológico de SOP. / Polycystic ovarian syndrome (PCOS), the most common ovarian endocrine disorder in women of reproductive age, could be expressed in heterogeneous phenotypes like women suffering amenorrea or women with conserved menstrual cycles. Indeed his clinical condition represents 75% of ovulatory infertility. Untyl now, there are no unique characteristics that have sufficient predictive value to explain the development of PCOS, then experimental animal models that exhibit characteristics of PCOS are invaluable tools for understanding the etiology of this syndrome. Our group has obtained experimental evidence that the ovary is under neuroendocrine control carried out by the interactive participation of gonadotropins, noradrenergic and peptidergic ovarian innervation and ovarian neurotrophic factors regulating the early stages of follicular development. In female rat treated with estradiol valerate or under cold stress, it was find evidence suggesting that polycystic ovary development is consecuence of increased sympathetic nerve activity either locally or originated in the hypothalamus and projected to the ovary via the superior ovarian nerve. In the present thesis we study a pharmacological model that mimics increased adrenergic tone via "in vivo" stimulation of the β-adrenergic receptors with the agonist isoproterenol, its effect on the development and maintenance of polycystic ovarian condition in rats, and the blockade by the antagonist propranolol. Isoproterenol in doses described by others to induce cardiac hypertrophy were administrated to adult female rats subcutaneously, 125μg/kg weight, during 10 days. Taking into consideration the time required to complete follicular development, rats were sacrificed at the next oestrus day after the treatment (ISO 10+1) or 30 days after the end of administration of the agonist (ISO 10+30). In order to confirm the causal relationship between the treatment and the observed changes in the ovary, we check the blockade effect of the adrenergic antagonist propranolol. The results showed that isoproterenol (ISO 10+1) generate cardiac hypertrophy, and anomalous follicular development like cystic structures in the ovary. Wile isoproterenol is present, the ovaries have an increased capacity to secrete androgens. Blockade with propranolol not only prevents cardiac hypertrophy, but also prevents the formation of follicular cysts and reverses the effect of isoproterenol on the secretory activity of androgens. Thirty days after the end of treatment (ISO 10+30) ovarian cysts were still present. This cystic phenotype was reversed by propranolol. Altered follicular development induced by the agonist neither affected estrous cyclicity, nor circulating levels of progesterone, androstenedione, testosterone and estradiol. The ovulatory capacity estimated by presence of corpus luteum in the ovary and the number of oocytes found in the oviduct were conserved which suggests the absence of endocrine axis compromise. Plasmatic LH and intraovarian NGF were increased. Although increased in neurotrophin, no changes in other neural markers were detected. The ovarian content of NE and β-adrenergic receptors were not different from the control group as well as NE content and TH in celiac ganglia where the soma of sympathetic neurons that innervate the ovary lies. It should be noted that the rise in both LH and trophic factors NGF was not reversed by propranolol. Although our results do not discarded a cirucunstancial relationship between LH and NGF rise, the detection of p75NTR on the wall of the developing follicles and as the follicle prequísticas structures like type III follicles suggest that this trophic signal induced by isoproterenol may participate in the maintenance of polycystic ovarian condition. In conclusion, the present study indicates that β-adrenergic stimulation is part of the development and maintenance of the condition polycystic ovary raising the possibility of pharmacological management of PCOS

Memoria para optar al título de Bioquímico / El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una neurotrofina, que inicialmente fue descrita en el cerebro, y que en los últimos años ha adquirido importancia, debido a que actúa en sitios no-neuronales, entre ellos el ovario, donde se ha encontrado que NGF participa en el desarrollo ovárico, proliferación y diferenciación de células somáticas y en la esteroidogénesis. Una de las etapas importantes que ocurren durante el desarrollo folicular y del cuerpo lúteo es la angiogénesis, una de las moléculas importantes en este proceso es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). NGF aumenta la expresión de VEGF en diversos tipos celulares. VEGF es regulado en forma directa por el gen inducible por hipoxia (HIF-1) y en forma indirecta por c-Myc. Además c-Myc, es un gen involucrado en la proliferación celular. En este trabajo se investigó el rol que cumple NGF en la regulación de VEGF y la proliferación celular. Para este fin se utilizaron células de granulosa humana, provenientes de pacientes del programa de fertilización asistida, las cuales se cultivaron por 2, 4, 8 y 18 horas con NGF (50 ng/ml). Se midieron los niveles del ARNm de VEGF, c-Myc e HIF-1 alfa por RT-PCR. En este trabajo el ARNm de las isoformas de VEGF 165 y 121 aumentaron a las 4 y 8 horas respectivamente, los niveles del ARNm de HIF-1 alfa se mantuvieron inalterados a todos los tiempos estudiados. Los niveles de ARNm de c-Myc aumentaron a las 8 y 18 horas por efecto de NGF. Por Inmunocitoquímica se determinó Ki67, un marcador de proliferación celular. La proteína Ki67 aumentó a las 8 y 18 horas por efecto de NGF, concordando con la expresión génica de c-Myc. Los resultados indican que NGF presenta la capacidad de aumentar, tanto la expresión del ARNm de VEGF, como la proliferación en forma independiente, y que este aumento en la proliferación sería en una etapa posterior al alza de VEGF y que probablemente el VEGF expresado en las células de granulosa humana en cultivo, éste involucrado en la proliferación directamente, esto podría suponer que una falla en la producción de NGF por parte del folículo podría llevar a éste a un crecimiento y maduración deficiente, debido a que no ocurriría una angiogénesis y proliferación adecuada / The nerve growth factor (NGF) is a neurothrophin, initially described in the brain, that has acquired importance in the last few years, because it has several functions in non-neuronal tissues. One of these tissues is the ovary, where NGF participates in the ovarian development, proliferation and differentiation of somatic cells and steroidogenesis. Angiogenesis is an essential stage during follicular and luteal development, and one of the most important molecules in this process is the vascular endothelial growth factor (VEGF). NGF increases VEGF expression in different cell types. VEGF is directly regulated by hypoxia inducible factor-1(HIF-1) and indirectly by c-Myc. c-Myc is also a gene involved in cell proliferation. This work investigated the role of NGF in regulating VEGF and cell proliferation. To this aim, granulosa cells obtained from patients undergoing in vitro fertilization were cultured for 2, 4, 8 and 18 hours with NGF (50 ng/ml). The levels of VEGF, c-Myc and HIF-1alpha mRNA were evaluated by RT-PCR. mRNA for VEGF 165 and VEGF 121 isoforms increase at 4 and 8 hours respectively. HIF-1alpha mRNA levels did not change at any time. NGF (50ng/ml) induces c-Myc mRNA increase at 8 and 18 hours. Ki67 protein, a cell proliferation marker, was determined by immunocytochemistry. Ki67 protein increases at 8 and 18 hours with NGF stimulation, and no change was observed at 4 hours, agreeing with the genic expression of c- Myc. The results indicate that NGF is able to increase VEGF mRNA expression and cell proliferation by independent ways, and that the increase in the proliferation would be a later stage to VEGF's rise. It is probable that the VEGF expressed in cultured human granulosa cells acts directly on cell proliferation, suggesting that fails in follicular NGF production might induce a deficient follicular growth and maturation, due to impairment in angiogenesis and cell proliferation

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benjamin_LaerciodosAnjos_D.pdf: 33504982 bytes, checksum: e6c612f9f87d4f0fe11fd9572883eff0 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os poecilídeos são peixes ovovivíparos de ampla utilização na piscicultura ornamental. Apesar disso, pouco se conhece sobre aspectos reprodutivos dessas espécies. O estudo das características histológicas e ultra-estruturais dos ovócitos constitui etapa básica e primordial para se estabelecer a biologia reprodutiva das diferentes espécies de peixes, essencial para a compreensão da fertilização, desenvolvimento inicial do embrião e crescimento das larvas. Como o sucesso da criação de peixes depende basicamente do conhecimento de sua biologia, e em especial, do processo reprodutivo, o presente trabalho aborda o desenvolvimento ovocitário, a caracterização dos ovários e a recuperação ovariana pós-parto do platy (Xiphophorus maculatus). Por outro lado, estudos mostram que o hormônio de crescimento está também envolvido nos processos de maturação gonadal, gametogênese e ovulação, sendo um importante modulador da reprodução da fêmea. Com base nesses aspectos, foram analisados os efeitos do hormônio de crescimento na recuperação ovariana pós-parto de fêmeas em condições laboratoriais controladas. Além disso, o presente estudo determina o tamanho de primeira maturação sexual de fêmeas de platy, outro parâmetro essencial na compreensão da biologia reprodutiva dos peixes. Para tal, foram utilizadas fêmeas jovens e adultas de X. maculatus mantidas em aquários. Fragmentos de gônadas foram coletados e processados para estudo da ovogênese em microscopias de luz e eletrônica de transmissão e varredura. Respeitando os diferentes períodos pósparto pré-estabelecidos, gônadas de animais do grupo-controle foram coletadas e preparadas para o estudo, em microscopia de luz, da recuperação ovariana após o parto. Foram coletadas gônadas do grupo de animais tratados com hormônio de crescimento, para estudo dos efeitos desse hormônio sobre o processo de recuperação ovariana. Fragmentos de gônadas de animais do grupo controle e do grupo tratado também foram processados para imuno-histoquímica, com o intuito de determinar a presença de imunorreatividade ao hormônio de crescimento. Além disso, foram calculados a partir de dados biométricos dos espécimes coletados, os valores dos índices gonadossomático (IGS) e hepatossomático (IHS), e dos fatores de condição (K1 e K2), nos diferentes períodos de coleta para os dois grupos em estudo. Alevinos de diferentes idades foram coletados para os estudos de determinação da idade de primeira maturação sexual. A organização estrutural dos ovários mostrou que o trato genital feminino possui estruturas capazes de armazenar espermatozóides. A ovogênese de X. maculatus, espécie ovovivípara, parece ser similar à maioria dos teleósteos ovíparos de água doce. No estudo do tamanho de primeira maturação sexual, 50% da população (Lso) foi considerada madura com 2,03cm de comprimento-padrão, e a estimativa de tamanho para que toda a população seja considerada madura (L1oo) foi de 2,5cm. Nesse último tamanho, foram observadas fêmeas gestantes, corroborando os valores de L1oo. Não se observou imuno-marcação para hormônio de crescimento nos ovários de platy, seja no grupo-controle seja no grupo tratado. Isso pode ser decorrente da baixa concentração do hormônio no órgão, ou mesmo da meia-vida bastante curta deste hormônio, ou ainda da dosagem utilizada no tratamento. Mesmo durante a gestação, ovócitos jovens iniciavam o processo de amadurecimento. Porém, eles não são fertilizados enquanto a fêmea não se recupera da gestação anterior, entrando em atresia. Nas fêmeas tratadas com o hormônio de crescimento, os eventos de atresia continuaram a ocorrer mesmo 72, 84 e 96 horas após o parto, indicando que os ovos que iniciaram a maturação após o parto também entraram em atresia. É possível que este evento tenha sido provocado pelo tratamento hormonal. Como o estresse é fator importante na determinação da ocorrência de atresia folicular em peixes, a manipulação dos animais para anestesia e administração do hormônio pode também ter influenciado o processo de atresia folicular / Abstract: The platy Xiphophorus maculatus (Poeciliidae), is an ornamental freshwater fish, ovoviviparous and able to produce offspring throughout the year, when maintained at the ideal temperature and photoperiod. This fish is considered a promising species for wide scale production and easily adaptable to laboratory conditions. It presents internal fertilization, sperm storage in the ovary permitting sucessive fertilizations, intra-follicular gestation, and sexual dimorphism. Some studies have been made using the platy as an experimental mode!. However, considering the peculiarities of the reproductive biology of X. maculatus and its potential for the study of gametogenesis, little is known about germ cell morphology. The histological study leads to basic knowledge of their reproductive biology with practical application for the understanding of fertilization, initial embryo development and larvae growth. The success of fishculture basically depends on the knowledge of fish biology, and particularly of the reproductive process. The present work includes oocyte development, the characterization of the ovary and post-partum ovarian recrudescence in the platy (Xiphophorus maculatus), analyzing the structural events observed in controlled conditions. Research has shown that growth hormone is also involved in gonadal maturation, gametogenesis and ovulation, being an important modulator of female reproduction. Therefore, the effect of growth hormone (GH) in ovarian recrudescence has been analyzed in post-partum females. The present study also determines the size of females at first sexual maturation, that is essential for understanding of reproductive biology in fishes. In this study, juveniles and adult females of X. maculatus were kept in aquariums. The ovaries were removed and prepared for study of oogenesis with the light and electron microscopes. According to established post-partum periods, ovaries of the control and growth hormone (GH) treated groups were collected and prepared for the study of ovarian post-partum recrudescence with light microscopy. Gonads of the control and treated groups were also prepared for the deteccion of growth hormone by immunohistochemistry. Moreover, the values of the gonadossomatic (IGS) and hepatossomatic (IHS) index were calculated, as well as the condition factors (K1 and K2), in the different post-partum periods for the two study groups. To determine the size of the first sexual maturation, juveniles and small pieces of their ovaries were collected. Standard body length, body weight and the age of each fish were recorded for the calculation of the LSO. The ovarian structural organization showed that the female genital tract possesses structures for spermatozoa storage. Oogenesis in X. maculatus, an ovoviviparous species, is similar to that described for most of the freshwater fish. In the study of the size of first sexual maturation (L50), the platy were considered mature with 2,O3cm of standard body length, and the estimated size when ali the population is considered mature (L1oo) was 2,Scm. With this size, gravid female were observed. No immunostaining was observed for the growth hormone in the ovaries, neither in the control group nor in the treated group. This result probably is related to the low concentration of the growth hormone in the ovary, or the short half-life of this hormone, or even the dosage used in the treatment which did not allow immunostaining. During gestation new oocytes initiate vitellogenesis. However, the oocytes which develop during the gestation enter atresia, and therefore will not be fertilized. In females treated with growth hormone, atresia continues to occur 72, 84 and 96 hours post-partum, indicating that the eggs that had initiated postpartum maturation also entered atresia. This event may have been due to the hormonal treatment. As estresse is an important factor causing follicular atresia in fish, the manipulation to anesthetize and administer the hormone probably stimulated the atretic process / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología / La función ovárica es controlada por un eje endocrino y una regulación nerviosa paralela. La administración de valerato de estradiol (EV) a ratas produce una condición morfológica de ovario poliquístico (PCO) que está acompañada por un tono adrenérgico aumentado. Esta condición está precedida por el aumento del factor de crecimiento nervioso (NGFB) y su receptor, NGFR. La relación causal entre la actividad nerviosa y el desarrollo de PCO se demostró, ya que la disección del nervio ovárico superior (NOS) o la administración de anticuerpos contra NGFB producen la reversión de la condición de ovario poliquístico generada por EV en ratas adultas. Esta reversión ocurre a nivel de la dinámica folicular, ciclicidad estral y tono adrenérgico. Además de estos resultados evidencias preeliminares muestran que la condición de PCO tiende a revertir en forma espontánea en estas ratas, sin embargo ésta no ocurre en la misma magnitud en ratas tratadas en la edad neonatal con EV, manteniéndose éstas acíclicas, sugiriendo una ventana en la cual estradiol produce efectos irreversibles en el control nervioso de la función ovárica. Nuestro objetivo fue determinar la ventana de mayor sensibilidad al tratamiento con EV y los cambios tempranos en NGFB/NGFR/TrkA, que programan la condición de ovario poliquístico en la rata de forma irreversible. Administramos EV a distintas edades (1, 7, 14, 21 y 30 días postnatal) y controlamos los ciclos estrales hasta los 6 meses de edad. En ese momento evaluamos la morfología ovárica y norepinefrina (NE) por HPLC. Encontramos que las ratas tratadas a los 1, 7 y 14 días de edad se mantenían acíclicas durante todo el periodo estudiado, lo que se condecía con un pobre desarrollo folicular, anovulación y presencia de quistes foliculares ováricos. En cambio las ratas que fueron tratadas a los 21 y 30 días de edad con EV recuperaron su ciclicidad estral, la capacidad ovulatoria, mostraban un patrón de desarrollo folicular similar al control. En conclusión la ventana de sensibilidad al efecto deletéreo permanente producido por EV corresponde a la etapa neonatalinfantil en la rata. Además nos propusimos buscar el mecanismo por el cual estradiol genera estos efectos. Para esto se realizó la técnica Microarray para evidenciar los genes relacionados a neurotrofinas y receptores que cambian luego de la administración neonatal de EV. Encontramos que varios genes relacionados con proliferación celular, apoptosis, diferenciación y cambios epigenéticos inducidos por EV eran regulados a la baja. Según esto realizamos inmunohistoquímica y TUNEL para evidenciar que células están muriendo o proliferando y cuales están sujetas a cambios epigenéticos en el ovario neonatal de rata. Aparentemente, existe un desbalance en la conducta proliferativa y diferenciación de células implicadas en el ensamblaje folicular, lo que repercute en un menor número de folículos primarios en las ratas inyectadas con la hormona. Por último para verificar si el aumento de NGFB fue el responsable de los cambios permanentes producidos en el desarrollo folicular, administramos un anticuerpo policlonal contra NGFB durante los 3 primeros días de vida en ratas tratadas el día 1 de edad con EV. Al analizar el ovario a los 60 días de vida, además de una baja concentración de NA y NGFB elevado, existe un aumento de folículos antrales grandes y una acumulación de estructuras foliculares prequísticas y quísticas, sugiriendo que la presencia de niveles aumentados de NGFB durante la vida adulta facilita la conversión de estructuras preovulatorias en folículos quísticos. Además la ausencia de ovulación indica fuertemente que probablemente existen mecanismos dependientes de catecolaminas, como la ovulación, y otros mecanismos que dependen de NGFB, como el desarrollo folicular, que en forma fina y coordinada regulan la función ovárica. / Ovarian function is under dual gonadotropic and neural control driven by gonadotropins and sympathetic nerves respectively. Estradiol Valerate (EV) single exposure to neonatal or adults rats develops a polycystic ovarian condition (PCO), which is preceded by an increased adrenergic tone and an increased concentration of Nerve Growth Factor (NGFB) and its low affinity receptor NGFR. A causal relationship between the nerve activity and PCO was demonstrated, since either the Superior Ovarian Nerve resection (SONX) or the blockade of NGFB with an antibody against the peptide reversed the polycystic condition in adult EV-treated rats. Previous work of our group have shown that the reversion occurs spontaneously in rats treated at different ages with the hormone, but it does not occur in rats are exposed to EV in the early life. Thus it is suggested that exists a developmental window in which estradiol produces irreversible damages in the reproductive system. Our aim was to determine this window of sensitivity to the deleterious effects of estradiol and the mechanism underlying this effect. We administered a single EV dose (10 mg/Kg) at different ages and the estrual cyclic activity was controlled until 6 month of life. At this age we analyzed the ovarian morphology and the noradrenaline (NA) ovarian concentration. We find that EV-treated rats at 1, 7 and 14 days old were acyclic during the whole period studied, and in addition they had a poor follicular development, anovulation and follicular cyst formation. In contrast, rats that were treated at days 21 and 30 of life recovered the estrual cyclic activity, the normal follicular development and the ovulatory capacity. In conclusion, the neonatal-infant period of life is the most sensitive period to the permanent damage produced by estradiol in the rat. Looking for the mechanism by which estradiol generates these effects, we performed a microarray to quantify the changes in the expression of neurotrophins, its receptors and related genes, 24h after estradiol exposure. Different changes in the expression of genes (particularly down-regulation) related to cell proliferation/differentiation and epigenetic regulations of gene expression were observed. We choose some genes specially affected and we did inmunohistochemistry against PCNA,Hystone H3 acetylated and TUNEL. Apparently there is an unbalance in the pattern of proliferation and differentiation in cells during the follicular assembly, a fact that has repercussion in the number of primary follicles. These results strongly suggest that rapid and early changes to the neurotrophin/receptors system, participates in the changes in follicular development found when rats were exposed neonatally to estradiol. Finally, and to verify if the primary increase in NGF was responsible for the permanent changes in follicular development, we administrated a policlonal antibody against NGFB during the first three days after birth to rats treated with EV the first day of age. The analysis of follicular development demonstrated that , in addition to a 90% decrease in NE concentration in the ovary and a increase in endogenous NGFB concentration, adults rats presented a further accumulation in precysts and cysts and in the preovulatory follicles strongly suggesting that the presence of increased levels of NGF during adulthood facilitates the conversion of antral follicles to cysts and because these rats did not recovered the ovulatory performance, there are probably mechanisms dependent of the presence of catecholamines (eg. ovulation) and other mechanism such us follicular development depend of NGF, strongly suggesting that ovary function is the results of coordinated regulation in which both sympathetic nerves and NGFB participates. / CONICYT; FONDECYT; MECESUP

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una patología que afecta directamente la homeostasis endometrial, debido a la pérdida de la función normal del ovario. Se ha sugerido un aumento en la sensibilidad a la acción de los esteroides ováricos en mujeres con esta patología, lo cual podría llevar a que factores de crecimiento que responden a las hormonas esteroidales, como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), poderoso angiogénico, y el factor de crecimiento nervioso (NGF), por medio de su receptor trkA, alteren su expresión. Ambos factores participan en la angiogénesis y dada la gran vascularización del endometrio, participarían en la regulación de la función endometrial, junto a otras moléculas. El objetivo de este trabajo es determinar si existen diferencias en los niveles de VEGF, NGF y de su receptor de alta afinidad, trkA, en endometrios de mujeres con síndrome de ovario poliquístico, respecto a los endometrios de mujeres controles. Para esto, se evaluó la localización y tipo de tinción a través de inmunohistoquímica para VEGF, NGF y trkA con anticuerpos específicos y el mRNA, a través de RT-PCR de los transcritos de VEGF, NGF y rRNA18S en endometrios controles de fase proliferativa (ENp, n=9), fase secretora (ENs, n=6), endometrios SOP de fase proliferativa (ESOPp, n=8) y de fase secretora (ESOPs, n=4). Los resultados presentaron una tinción homogénea y de predominio citoplasmático para VEGF, NGF y trkA en todos los grupos estudiados. Junto a ello se observó un aumento significativo en la intensidad de la tinción en los ENs y en los ESOPp, en el epitelio y el estroma comparados con los ENp, en las tres proteínas analizadas. El nivel de mRNA de VEGF-189 fue mayor en ESOPs versus ENs y el transcrito VEGF-165 fue el mayormente expresado a través del ciclo menstrual. Los niveles de mRNA-NGF disminuyeron en ESOPp versus ENp. Las diferencias encontradas entre los endometrios controles y los SOP sugieren alteración en la vascularización del tejido endometrial de mujeres con SOP. Además, trkA y NGF podrían tener un papel funcional en la fase secretora del ciclo, y el aumento de estas tres moléculas en los ESOP podría indicar un rol de ellas en esta patología. / Proyectos FONDECYT 1050098 y 1095127

Doctor en Bioquímica / La activación del sistema nervioso simpático ha sido reconocida como uno de los factores que forman parte de la etiología del síndrome de ovario poliquístico (SOP) en humanos y en modelo de rata. La literatura muestra datos consistentes que relacionan el aumento de la actividad simpática, expresada en un aumento en la liberación de norepinefrina (NE) en ratas y en las prolongaciones nerviosas en humanos, y la formación de quistes ováricos. Así mismo, la simpatectomía en animales y la resección de la zona de entrada de los nervios ováricos en humano, permiten una vuelta a la ciclicidad estral y menstrual respectivamente. Datos clínicos apuntan, además, a que la condición poliquística sería persistente, ya que las mujeres con SOP durante el embarazo y el postparto presentan patrones hormonales alterados con respecto a las mujeres control, a pesar d existir un bloqueo central del eje hipotálamo-hipófisis-gónada. Esto indica que existe también un componente intraovárico que participa en la mantención de esta condición. En modelo animal, durante el establecimiento de la condición quística, se ha observado un aumento conjunto en el mRNA para el factor de crecimiento neuronal (NGF) y en el de su receptor de baja afinidad p75NTR. Se sabe que la sobreexpresión de esta neurotrofina gatilla la activación nerviosa y además genera quistes ováricos y que la utilización de anticuerpos anti-NGF, permite una vuelta a la normalidad. En el ovario se han descrito diferentes tipos celulares que podrían participar junto con la inervación extrínseca en la homeostasis de las catecolaminas ováricas. Estos serían la contraparte ovárica intrínseca que participaría, en respuesta a cambios en el complejo neurotrófico NGF/p75NTR, junto con la inervación extrínseca, en la hiperctividad nerviosa persistente, característica de la condición poliquística. Para resolver esta hipótesis usamos un modelo de ovario poliquístico generado en ratas, 60 días post administración de una dosis única de valerato de estradiol. Se desarrolla así una condición quística en los ovarios de los animales con características similares a las humanas. En este modelo observamos aumento en el mRNA para p75NTR y con esto una mayor disponibilidad de NGF para su acción sobre las células blanco. Esto podría explicar una activación tanto del componente nervioso extrínseco como intrínseco. Mediante RT-PCR en tiempo real medimos la concentración de mRNA para Tirosina hidroxilasa, marcador de la presencia de cuerpos neuronales, corroborando la presencia éstas. Sin embargo al no haber cambios en la concentración del mRNA entre la condición control y la condición quística, creemos que las neuronas no participan de manera activa durante la condición quística. Usando inmunohistoquímica observamos la presencia del transportador de Dopamina (DAT) en células de granulosa, células intersticiales y cuerpos lúteos tanto en la condición quística como en la control y creemos que este transportador es un buen marcador de algunas de las células del componente nervioso ovárico intrínseco. Para evaluar la funcionalidad del sistema nervioso extrínseco e intrínseco, se midió la capacidad de liberación del trazador radiactivo norepinefrina tritiada (3HNE). Observamos una mayor capacidad de liberación de 3HNE en los animales con quistes y al desnervar, esta liberación disminuye sólo a niveles control, indicando, desde un punto de vista fisiológico, la participación de un componente celular intraovárico. La incorporación de 3HNE es un indicador de la presencia de estructuras nerviosas. En la condición quística la incorporación es mayor que en la situación control y cuando se desnerva al animal con quistes, la incorporación no varía, indicando que el componente intraovárico está activado en la condición quística. Al bloquear la incorporación de 3HNE con cocaína, los animales con quistes y desnervación, incorporan menos que los animales con quistes, indicando que la incorporación de NE en los animales con quistes, estaría mediada probablemente por DAT. Los resultados presentados muestran evidencias fuertes sobre la existencia de un sistema nervioso ovárico intrínseco, el que participaría junto con el sistema nervioso extrínseco en el control de los niveles de catecolaminas intraováricas. Además la activación de este componente intraovárico, dada por cambios en el complejo neurotrófico, podría explicar la mantención de la hiperactividad nerviosa característica de esta condición.