Debido a la falta de órganos para trasplantes, los donantes a corazón parado constituyen una posible fuente de obtención de los mismos. El principal inconveniente que se presenta en tales casos es el tiempo de "isquemia caliente" a la cual están sometidos los órganos. Nuestro grupo investigador ha demostrado que la realización después de la parada cardíaca (PC) de un periodo de recirculación extracorpórea mediante la utilización de una bomba de "bypass" cardiopulmonar y oxigenación tisular antes del enfriamiento corporal total tiene un efecto beneficioso y es capaz de evitar las lesiones hepáticas, cosa que hace viable su trasplante. Este procedimiento se ha denominado "recirculación normotérmica" (RN).

INTRODUCCIÓ: La lesió pulmonar aguda (LPA) és una entitat clínica que inclou un ampli espectre de dany pulmonar i que pot donar-se en associació a una gran varietat de condicions precipitants. La manifestació més severa de la LPA es coneix amb el nom de síndrome de distres respiratori de l'adult. La sepsis és l'etiologia més freqüent de LPA, amb una mortalitat superior al 50%. El mecanisme de producció d'aquesta entitat, implica una complexa resposta immunològica humoral i cel.lular, que es tradueix en una alteració estructural i funcional que origina trastorns en la vasculatura i en la mecànica pulmonar, alterant la relació ventilació/perfusió; això es manifesta clínicament amb hipertensió pulmonar i hipoxèmia severa.Actualment el tractament d'aquesta entitat es basa en mesures de manteniment en espera que es resolgui la causa precipitant. L'òxid nítric inhalat i les prostaciclines nebulitzades no s'inclouen en el tractament habitual de la LPA; contemplant-se el seu ús en els casos de hipoxèmia o hipertensió pulmonar severa refractàries al tractament convencional és a dir, en una fase evolutiva avançada de la malaltia.L'administració profilàctica d'aquests fàrmacs en la LPA s'ha reportat de manera aïllada i amb resultats dispars. Donada la naturalesa imunològica-inflamatòria de la LPA i les propietats antiinflamatòries del NO i de les PG, l'administració de manera profilàctica de iNO i de PGneb, abans de produir-se la noxa que desencadena el quadre, podria ser molt més efectiva que el seu ús amb finalitat terapèutica.HIPÒTESIS I OBJECTIUS:1. Verificar que l'administració endovenosa d'endotoxina produeix una lesió aguda a nivell de la membrana alveolo-capil.lar que condiciona un augment de la permeabilitat capil·lar, migració i activació de neutròfils ocasionant edema alveolar, hipertensió pulmonar i hipoxèmia severa.2. Investigar l'efecte de l'administració profilàctica de NO inhalat, de prostaglandines nebulitzades i d'ambdós alhora, sobre la hemodinàmica sistèmica, la hemodinàmica pulmonar i l'intercanvi de gasos.3. Investigar si l'administració profilàctica del iNO, de PGneb i d'ambdós alhora, evita l'increment de permeabilitat vascular, la migració i l'activació de neutròfilsMaterial i mètodes: l'estudi es va realitzar amb 31 ovelles anestesiades (8 en el grup control, 7 en el grup endotoxina, 6 en el grup iNO, 5 en el grup PGneb i 5 en el grup iNO+PGneb) de 20-25 Kg. Es va monitoritzar la pressió arterial i la hemodinàmica pulmonar a través d'un catéter de Swan Ganz. Es realitzaven gasometries arteriars i venoses, recompte de leucòcits en sang arterial, i nivells de GMPc i AMPc en sang arterial i venosa mixta, així com un rentat broncoalveolar (BAL) de cada pulmó. De la mostra obtinguda es va estudiar la cel.lularitat (nombre, viabilitat i tipus cel.lular), i la concentració de proteïnes. Al final de l'estudi s'obtenia una mostra de teixit pulmonar, per estudi anatomopatològic i determinació de mieloperoxidasa. La endotoxina (LPS) administrada era E. Coli. El iNO s'administrava amb un regulador caudalímetre (OPTINO), conectat a la branca inspiratòria del respirador. Les PGneb s'administraven mitjançant un nebulitzador ultrasònic (OMRON, model NE-012) conectat a la branca inspiratòria del respirador. Els animals foren distribuits de manera aleatòria en 5 grups. Grup control: rebien una infusió de sèrum fisiològic, grup LPS: rebien un bolus de 20&#61472;mi./Kg/min de LPS seguit d'una perfusió de 10 mi./Kg/min fins al final de l'estudi, grup iNO: rebien 10ppm de iNO, grup PGneb: rebien 10 mi./Kg/min de PGneb, i grup iNO+PGneb: rebien ambdós fàrmacs alhora. Tots els gups van ser estudiats durant un periode de 4 hores, i els controls es realitzaven en situació basal (T00), als 20 minuts de l'inici de l'administració de iNO, PGneb, o iNO+PGneb (T0), a la 1, 2, 3 i 4 hores d'iniciar-se la infusió sèrum salí/LPS (T1, T2, T3, T4 respectivament), i als 20 minuts de retirar el iNO, les PGneb o ambdós.Per analitzar l'evolució de les variables en el temps, es va comparar l'efecte de cadascún dels tractaments, mitjançant la descomposició de la variància de les diferències entre el moment basal i després d'haver passat 4 hores. En el cas que la diferència es distribuïa segons una Normal, es feien les múltiples comparacions pel mètode Bonferroni, i en el cas en que la variable a comparar no es distribuïa segons una Normal, es va contrastar la igualtat entre els grups mitjançant la prova Kruskall Wallis. Es va considerar significativa una p< 0,05.RESULTATS: en el grup d'animals que únicament van rebre endotoxina es va observar una disminució del dèbit cardíac (DC) i un increment de les resistències vasculars sistèmiques (RVS) significatius en l'hemodinàmica sistèmica; així com un increment significatiu de la pressió de l'artèria pulmonar (PAPm) i de les resistències vasculars pulmonars (RVP) respecte dels animals del grup control. L'administració de LPS també va produir una disminució significativa de la PaO2, i dels leucòcits en sang perifèrica. En el BAL d'aquest grup d'animals, hi habia un increment significatiu del percentatge de neutròfils i del valor de la mieloperoxidasa. A l'anatomia patològica de les mostres de teixit pulmonar s'observaba un infiltrat inflamatori difús amb augment dels leucòcits a l'interior de les arterioles.El grup d'animals que va rebre 10ppm de iNO no va mostrar variacions significatives en els paràmetres de l'hemodinàmica sistèmica. L'administració de iNO en aquest grup va evitar la disminució del dèbit cardíac, l'increment de la PAPm i l'increment de les RVP de manera significativa. L'administració de iNO també va evitar la disminució significativa de la PaO2 i dels leucòcits en sang perifèrica. En el BAL d'aquest grup el percentatge de neutròfils va ser significativament inferior al del grup que va rebre LPS. En les mostres de teixit pulmonar no hi habia edema ni infiltrat inflamatori agut, típics de l'administració de LPS.El grup d'animals que va rebre 10&#61549;/Kg/min de PGneb no va mostrar variacions significatives en l'hemodinàmica sistèmica respecte del grup que va rebre LPS. Amb l'administració de PGneb es va observar un increment significatiu de la PAPm i de les RVP respecte del grup que va rebre iNO. També es va observar una disminució significativa de la PaO2 respecte del grup que va rebre iNO. La disminució de la xifra de leucòcits en sang perifèrica observada en aquest grup va ser significativament inferior a la del grup LPS. El percentatge de neutròfils en el BAL d'aquest grup va ser significativament superior al del grup iNO. En la mostra de teixit pulmonar destacaba un intens infiltrat inflamatori agut amb marcat edema periarteriolar i perivenular.El grup d'animals que va rebre conjuntament 10ppm de iNO i 10 mi./Kg/min de PGneb no van mostrar variacions en l'hemodinàmica sistèmica. Es va observar una disminució significativa de la PAPm i de les RVP respecte del grup LPS i respecte del grup PGneb. No es van observar diferències significatives en la resta de paràmentres hemodinàmics ni gasomètrics mesurats. El percentatge de neutròfils en el BAL d'aquest grup va ser significativament superior al del grup iNO, mentre que el percentatge de macròfags va ser significativament inferior al del grup iNO. L'anatomia patològica d'aquest grup mostrava un infiltrat inflamatori agut i un edema perivascular moderats. No van haber-hi diferències significatives en els valors de AMPc i GMPc, arterials i venosos, entre els grups estudiats.DISCUSIÓ: el model de LPA per endotoxina presentat en aquest estudi, es caracteritza fonamentalment per hipertensió pulmonar i hipoxèmia severa com a conseqüència de la vasoconstricció i de l'augment de permeabilitat vascular, que origina extravassació de proteïnes, infiltració i degranulació de neutròfils. Aquest model està ampliament demostrat anteriorment en la literatura en diferents estudis experimentals. Nosaltres vàrem escollir el model oví per tenir una resposta vascular més similar a la dels humans. Per tant és un bon model per avaluar l'efecte de diferents fàrmacs com a tractament o profilaxi d'aquesta entitat.L'administarció profiactica de iNO va evitar la HTP, la disminució del DC i la hipoxèmia produits per l'administració de LPS. Aquests resultats estan en la mateixa línia que les dades previament reportades en la literatura, però amb un grau d'eficàcia superior, que artubuim al fet que aquests hagi estat administrat profilàcticament, abans d'iniciar-se l'insult sèptic. De manera paral.lela, l'administració profilàctica de iNO va evitar la LPA al reduir la migració alveolar de neutròfils i la leucopènia perifèrica indiudes per LPS. Les propietats antiinflamatòries del iNO es presenten de manera variable en funció del model experimental/clínic emprat; i l'ús potencial del iNO amb finalitat antiinflamatòria passa per assajar l'administració en diferents moments de l'evolució de la LPA. L'administració de PGneb, en canvi, no va evitar la disminució del DC, la HTP ni la hipoxèmia produits per l'administració de LPS, i va afavorir la LPA, en potenciar la migració intraalvèolar de neutròfils . En contraposició a aquests resultats, en la majoria d'estudis reportats els prostanoids, igual que tots els fàrmacs que incrementen els nivells de AMPc, mostren propietats antiinflamatòries. No tenim una explicació clara que justifiqui aquest fenòmen. Es possible que les PGneb fossin absorbides a nivell traqueobronquial, passant així a la crculació sistèmica; però la tendència a l'increment dels valors del AMPc en els animals d'aquest grup apunta que en una o altra mesura les PGneb van arribar a nivell alveolar, sense tenir l'efecte esperat. L'administració de iNO+PGneb va evitar la HTP però no la hipoxèmia, produïdes per l'administració de LPS. Amb aquesta associació no es va observar l'efecte profilàctic de l'administració de iNO, però tampoc es van manifestar els efectes proinflamatoris de l'administració de PGneb soles. Es possible que aquest fenòmen estigui en relació a un mecanisme de retroalimentació entre els respectius segons missatgers AMP i GMP cíclics.CONCLUSIONS:1. L'administració d'endotoxina de E. coli produeix una LPA que es caracteritza per migració transendotelial i activació dels neutròfils, edema alveolar, hipertensió pulmonar i hipoxèmia severa.2. L' administració profilàctica de 10ppm de iNO prevé de l'aparició de hipertensió pulmonar i de hipoxèmia induïdes per l'endotoxina. Així mateix prevé la migració transendotelial dels neutròfils, amb una disminució significativa del nombre de neutròfils en el rentat broncoalveolar.3. L 'administració profilàctica de 10&#61472;&#61549;/Kg/min de PGneb no evita l'aparició de hipertensió pulmonar ni de hipoxèmia induïdes per l´endotoxina. Tampoc evita la migració transendotelial de neutròfils.4. L'administració profilàctica de iNO i de PGneb conjuntament, si bé evita el desenvolupament de hipertensió pulmonar, no prevé la hipoxèmia. Tampoc evita l'augment de neutròfils en el rentat broncoalveolar i en el teixit pulmonar.5. La lesió pulmonar aguda induïda per endotoxina de E. coli es prevé totalment amb l´administració de iNO, mentre que la PGneb no exerceix cap efecte profilàctic d'aquesta lesió pulmonar i la l'associació d'ambdós tractaments té nomès un efecte profilàctic parcial. / INTRODUCCIÓN: la lesión pulmonar aguda (LPA) es una entidad clínica que incluye un amplio espectro de daño pulmonar y que puede darse en asociación a una gran variedad de condiciones precipitantes. La manifestación más severa de la LPA se conoce con el nombre de síndrome de distres respiratorio del adulto. La sepsis es la etiología más frecuente de la LPA, con una mortalidad superior al 50%. El mecanismo de producción de esta entidad, implica una compleja respuesta immunológica humoral y celular, que se traduce en una alteración estructural y funcional que origina trastornos en la vasculatura y en la mecánica pulmonar, alterando la ventilación-perfusión; esto se manifiesta clínicamente con hipertensión pulmonar (HTP) e hipoxemia severa.Actualmente el tratamiento de esta entidad se basa en medidas de mantenimiento en espera que se resuelva la causa precipitante. El óxido nítrico inhalado (iNO) y las prostaciclinas nebulizadas (PGneb) no se incluyen en el tratamiento habitual de la LPA; contemplándose su uso en los casos de hipoxemia o HTP severa refractarias al tratamiento convencional es decil, en una fase evolutiva avanzada de la enfermedad. La administración profiláctica de estos fármacos en la LPA ha sido reportada de manera aislada i con resultados dispares. Dada la naturaleza immunológico-inflamatoria de la LPA y las propiedades antiinflamatorias del NO y de las PG, la administración de manera profiláctica de iNO i de PGneb, antes de producirse el insulto que desencadena el cuadro, podría ser mucho más efectiva que su uso con finalidad terapéutica.HIPÓTESIS Y OBJETIVOS:1. Verificar que la administración endovenosa de endooxina produce una lesión aguda a nivel de la membrana alveolocapilar que condiciona un aumento de la permeabilidad capilar, migración y activación de neutrófilos ocasionando edema alveolar, HTP e hipoxemia severas.2. Investigar el efecto de la administración profiláctica de NO inhalado, de prostaciclinas nebulizadas y de ambos a la vez, sobre la hemodinámica sistémica, la hemodinámica pulmonar y el intercambio de gases.3. Investigar si la administración profiláctica de NO inhalado, de prostaciclinas nebulizadas y de ambos a la vez, evita el incremento de la permeabilidad vascular, la migración y activación de neutrófilos.MATERIAL Y MÉTODOS: el estudio se realizó con 31 ovejas anestesiadas (8 en el grupo control, 7 en el grupo endotoxina, 6 en el grupo iNO, 5 en el grupo PGneb y 5 en el grupo iNO más PGneb) de 20-25 Kg. Se monitorizó la presión arterial y la hemodinámica pulmonar a través de un catéter de Swan-Ganz. Se realizaron gasometrías arteriales y venosas, recuento de leucocitos en sangre arterial, i niveles de AMP i GMP cíclicos en sangre arterial y venosa mixta, así como un lavado broncoalveolar (BAL) de cada pulmón. De la muestra obtenida se estudió la celularidad (número, viabilidad y tipos celulares), y la concentración de proteínas. Al final del estudio se obtenía una muestra de tejido pulmonar, para estudio anatomopatológico y determinación de mieloperoxidasa. La endotoxina (LPS) administrada era E. Coli. El iNO se administraba con un regulador caudalímetro (OPTINO), conectado a la rama inspiratoria del respirador. Las PGneb se administraban mediante un nebulizador ultrasónico (OMRON, modelo NE-012) conectado a la rama inspiratoria del respirador. Los animales fueron distribuidos de manera aleatoria en 5 grupos. Grupo control: recibían una perfusión de suero fisiológico, Grupo LPS: recibían un bolus de 20&#61472;mi./Kg./min. Grupo iNO: recibían 10 ppm. de NO. Grupo PGneb: recibían 10 mi./Kg./min. de PGneb, y Grupo iNO+PGneb: recibían ambos fármacos a la vez. Todos los grupos fueron estudiados durante un periodo de 4 horas, y los controles se realizaron en situación basal (T00), a los 20 minutos del inicio de la administración de iNO, PGneb o iNO+PGneb (T0), a las 1, 2, 3 i 4 horas de iniciarse la infusión suero salino/LPS (T1, T2, T3, T4 respectivamente), y a los 20 minutos de retirar el iNO, las PGneb o ambos (T5). Para analizar la evolución de las variables en el tiempo, se comparó el efecto de cada uno de los tratamientos, mediante la descomposición de la varianza de las diferencias entre el momento basal y después de haber pasado 4 horas. En el caso que la diferencia se distribuía según una Normal, se hacían múltiples comparaciones por el método Bonferroni, y en el caso en que la variable a comparar no se distribuía según una Normal, se contrastó la igualdad entre los grupos mediante la prueba Kruskall Wallis. Se consideró significativa una p< 0,05.RESULTADOS: en el grupo de animales que únicamente recibió endotoxina se observó una disminución del gasto cardíaco (GC) y un incremento de las resistencias vasculares sistémicas (RVS) significativos; así como un incremento significativo de la presión de la arteria pulmonar (PAPm) y de las resistencias vasculares pulmonares (RVP) respecto los animales del grupo control. La administración de LPS también produjo una disminución significativa de la PaO2 y de los leucocitos en sangre periférica. En el BAL de este grupo de animales, había un incremento significativo del porcentaje de neutrófilos y del valor de la mieloperoxidasa. En la anatomía patológica de las muestras de tejido pulmonar se observaba un infiltrado inflamatorio difuso con aumento de leucocitos en el interior de las arteriolas.El grupo de animales que recibió 10 ppm de iNO no mostró variaciones significativas en los parámetros de la hemodinámica sistémica. La administración de iNO en este grupo evitó la disminución del GC, el incremento de la PAPm y el incremento de las RVP de manera significativa. La administración de iNO también evitó la disminución significativa de la PaO2 y de los leucocitos en sangre periférica. En el BAL de este grupo el porcentaje de neutrófilos fue significativamente inferior al del grupo que recibió LPS.El grupo de animales que recibió 10 mi./Kg./min. de PGneb no mostró variaciones significativas en la hemodinámica sistémica respecto el grupo que recibió LPS. Con la administración de PGneb se obserbó un incremento significativo de la PAPm y de las RVP respecto el grupo que recibió iNO. También se observó una disminución significativa de la PaO2 respecto el grupo que recibió iNO. La disminución de la cifra de leucocitos en sangre periférica observada en este grupo fue significativamente inferior a la del grupo LPS. El porcentaje de neutrófilos en el BAL de este grupo fue significativamente superior al del grupo iNO. En la muestra de tejido pulmonar destacaba un intenso infiltrad inflamatorio agudo con marcado edema periarteriolar y perivenular.El grupo de animales que recibió conjuntamente 10 ppm de iNO y 10 mi./Kg./min. de PGneb no mostró variaciones significativas en la hemodinámica sistémica respecto al grupo que recibió LPS. Se observó una disminución significativa de la PAPm y de las RVP respecto el grupo LPS y respecto el grupo PGneb. No se observaron diferencias significativas en el resto de parámetros hemodinámicos ni gasométricos medidos. El porcentaje de neutrófilos en el BAL de este grupo fue significativamente superior al del grupo iNO, mientras que el porcentaje de macrófagos fue significativamente inferior al del grupo iNO. La anatomía patológica de este grupo mostraba un infiltrado inflamatorio agudo y un edema perivascular moderados.No hubo diferencias significativas en los valores de AMPc y GMPc arteriales ni venosos entre los grupos estudiados.DISCUSIÓN: el modelo de LPA por endotoxina presentado en este estudio, se caracteriza fundamentalmente por hipertensión pulmonar y hipoxemia severa como consecuencia de la vasoconstricción y del aumento de permeabilidad vascular, que origina extravasación de proteínas, infiltración y degranulación de neutrófilos. Este modelo está ampliamente demostrado anteriormente en la literatura en diferentes estudios experimentales. Nosotros escogimos el modelo ovino por tener éste una respuesta vascular más similar a la de los humanos. Por tanto se considera un buen modelo para valorar el efecto de diferentes fármacos como tratamiento o profilaxis de esta entidad.La administración profiláctica de iNO evitó la HTP, la disminución del GC y la hipoxemia producidas por la administración de LPS. Estos resultados están en la misma línea que los datos previamente reportados en la literatura, pero en un grado de eficacia superior, que atribuimos al hecho de que éstos hayan estado administrados profilácticamente, antes de iniciarse el insulto séptico. De manera paralela la administración profiláctica de iNO evitó la LPA al reducir la migración alveolar de neutrófilos y la leucopenia periférica inducidas por LPS. Las propiedades antiinflamatorias del iNO se presentan de manera variable en función del modelo experimental/clínico estudiados; y el uso potencial del iNO con finalidad antiinflamatoria pasa por ensayar su administración en diferentes momentos de la evolución de la LPA. La administración de PGneb en cambio, no evitó la disminución del GC, la HTP ni la hipoxemia producidos por la administración de LPS, favoreciendo la LPA, al potenciar la migración intraalveolar de neutrófilos. En contraposición a estos resultados, en la mayoría de estudios reportados los prostranoides, al igual que el resto de los fármacos que incrementan el AMPc, muestran propiedades antiinflamatorias. No tenemos una explicación clara que justifique este fenómeno. Es posible que la PGneb fueran absorbidas a nivel traqueobronquial, pasando de esta manera a la circulación sistémica; pero la tendencia al incremento de los valores del AMPc en los animales de este grupo apunta que en alguna medida las PGneb llegaron a nivel alveolar, sin tener el efcto deseado. La administración de iNO+PGneb evitó la HTP pero no la hipoxemia producidas por la administración de LPS. Con esta asociación no se observó el efecto profilàctico de la administración de iNO, pero tampoco se manifestaron los efectos proinflamatorios de la administración de PGneb aislada. Es posible que este fenómeno esté en relación a un mecanismo de retroalimentación entre los respectivos segundos mensajeros AMPc i GMPc.CONCLUSIONES:1. La administración de endotoxina de E. Coli produce una LPA que se caracteriza por migración transendotelial y activación de los neutrófilos, edema alveolar, HTP e hipoxemia severa.2. La administración profiláctica de 10 ppm de iNO previene la aparición de hipertensión pulmonar y de hipoxemia inducidas por endotoxina. Así mismo previene la migración transendotelial de neutrófilos, con una disminución significativa del número de neutrófilos en el lavado broncoalveolar.3. La administración de 10 mi./Kg./min. de PGneb no evita la aparición de hipertensión pulmonar ni de hipoxemia inducibles por endotoxina. Tampoco evita la migración transendotelial de neutrófilos.4. La administración profiláctica de iNO+PGneb conjuntamente si bien evita el desarrollo de hipertensión pulmonar, no previene la hipoxemia. Tampoco evita el aumento de neutrófilos en el lavado broncoalveolar ni en el tejido pulmonar.5. La lesión pulmonar aguda inducida por endotoxina de E. Coli se previene totalmente con la administración de iNO, mientras que las PGneb no ejercen ningún efecto profiláctico de esta lesión pulmonar y la asociación de ambos tratamientos sólo tiene un efecto profiláctico parcial.

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis. Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009). Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos. Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad. Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis. / Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis. Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile. Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis. Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.

Tesi qualificada amb un EXCEL.LENT "Cum Laude", per a l'obtenció del títol de doctor per la Universitat de Barcelona amb menció europea / Nitric oxide or nitrogen monoxide (NO) is a tiny free radical gas. The discovery of this intriguing molecule has revolutionized physiology and pharmacology research during the last 20 years. Currently, it is known that NO is endogenously synthesized by several molecules and tissues via two pathways: the synthase-dependent pathway and the synthase-independent pathway. In the first, the amino acid L-arginine is the main donnor of NO synthesis. In the second, inorganic nitrate is the main substrate for the synthesis of this molecule. Interestingly, both pathways are directly connected. While the synthase-dependent pathway is oxygen dependent, the synthase-independent metabolic route is greatly facilitated under hypoxia conditions. Thus, these mechanisms of NO production regulate levels of NO in the tissues. An adequate production of NO is important because it plays an essential role in mechanisms related with vasodilatation and blood flow distribution. Additionally, NO modulates other important functions in the human body such as mitochondrial respiration and immune mechanisms. For all these reasons, the interest for dietary NO donors have increased during the last years. It has been suggested that the consumption of food rich in L-arginine or in inorganic nitrate may enhance NO availability in the human body. This hypothesis has not been unnoticed in exercise physiology. In fact, it has been suggested that supplementation with NO donors may improve the cardio-respiratory response, as well as the tolerance to endurance exercise in humans. However, there is a lack of studies analyzing this issue. Therefore, the aim of this doctoral thesis was to assess the effect of L-arginine and inorganic nitrate in the cardio-respiratory and metabolic response of healthy humans. To develop this aim, three studies and one review were carried out. In the first, it was found that L-arginine supplementation during three days at several doses, between 5.5 and 20.5 g/day was not effective to increase plasma markers of NO, as well as the cardio-respiratory and metabolic response during endurance test. In the second study we found that acute dose of inorganic nitrate supplementation (10 mg/kg of body mass) raised significantly plasma levels of nitrate and nitrite. However, this effect did not report an improvement in the cardio-respiratory response at low-to-moderate intensities of exercise. However, at maximal work loads of exercise dietary nitrate induced significantly reduction of oxygen consumption (VO2peak) compared with placebo. Other cardio-respiratory parameters, as well as blood lactate concentration did not differ between nitrate and placebo. In addition, exercise performance measured as time to exhaustion during an incremental test did not increase compared with placebo. All these findings together suggested that at higher intensities of exercise energy production became more efficient after inorganic nitrate ingestion. Accordingly, in the third study it was analyzed the effect of dietary inorganic nitrate ingestion for three days during endurance exercise in a cycle ergometer at high intensity (time-trial of 40-min). Results of this study showed that nitrate supplementation did not increase significantly plasma levels of nitrite, as well as enhance performance in healthy subjects. Interestingly, a significant, negative correlation was found between change in nitrite and endurance capacity measured as VO2peak during the exercise test. These results indicated that the effect of dietary nitrate ingestion was lower in subjects with high cardiovascular capacity compared with subjects with poor tolerance capacity to endurance exercise. This fact is very important, since it is known that endurance training increase values of VO2peak in sedentary population and this fact is correlated with lower incidence of cardiovascular diseases. These and other important conclusions of these studies are included in the last work of this thesis which was a review article. / L’òxid nítric (NO) es un radical lliure alliberat per diverses molècules i teixits en l’organisme humà. El descobriment d’aquesta intrigant molècula ha revolucionat la recerca en el camp de la fisiologia i la farmacologia durant els últims 20 anys. Actualment, es coneix que la alliberació de NO per part de les cèl•lules endotelials estimula el procés de vasodilatació. A més, també es coneix que aquesta molècula es un important regulador de la respiració mitocondrial i del sistema immunològic. Totes aquestes funcions han generat un gran interès per els precursors nutricionals de NO. En l’àmbit de la fisiologia de l’exercici físic s’ha suggerit que la suplementació amb alguna d’aquestes substancies (L-arginina o nitrat inorgànic) pot millorar la tolerància a l’exercici físic de resistència. No obstant, hi ha molta controvèrsia en els resultats dels estudis que han analitzat aquesta hipòtesi. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral va ser analitzar els efectes dels principals precursors de NO, L-arginina i nitrat inorgànic, en la resposta cardiorrespiratòria i metabòlica durant l’exercici físic de caràcter aeròbic en humans. Per dur a terme aquest objectiu es van realitzar 3 estudis i una revisió bibliogràfica. Els principals resultats d’aquests estudis van mostrar que la suplementació de L-arginina en diferents dosis no va ser efectiva per augmentar el marcadors plasmàtics de NO, així com, la resposta cardiorrespiratòria i metabòlica durant un exercici físic aeròbic en intensitats moderades. En referència als nitrat inorgànic, es va observar que la suplementació augmenta els nivells d’aquests compostos en plasma. No obstant, aquest fet no es va correlacionar amb una millora de la tolerància a l’exercici físic de resistència. A més, es va observar una correlación negativa i significativa entre l’augment dels nitrits plasmàtics i la potència aeròbica màxima (VO2max). Tots aquests resultats van ser àmpliament tractats en l’últim treball (revisió bibliogràfica) d’aquesta tesi. En resum, l’ingesta nutricional de L-arginina i/o nitrat inorgànic no resulta efectiva per millorar la resposta cardiorrespiratòria i la tolerància a l’exercici físic de resistència en humans sans i entrenats físicament.

Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit produït com a conseqüència del pèptid beta-amiloide (A&#61538;) contribueix l'augment de la relació A&#61538;42/A&#61538;40 que ocorre a la malaltia d'Alzheimer. L'A&#61538;42 contribueix a l'aparició de la malaltia degut a la seva major toxicitat (quan es compara amb l'A&#61538;40) que resulta d'una gran estabilitat i capacitat agregativa. A més el peroxinitrit incrementa la toxicitat d'aquest degut a què potencia la seva agregació en forma d'oligomers altament tòxics. De fet els oligomers formats de nitro-A&#61538;42 presenten una major toxicitat que aquells formats de A&#61538;42 . En conjunt aquest resultats senyalen l'important paper que l'A&#61538;42 té en la malaltia d'Alzheimer. Per altra banda, des de la identificació dels agregats d'A&#61538; i la subseqüent formació dels cabdells neurofibrilars (NFT) com a els dos trets distintius de la malaltia, un gran esforç s'ha dedicat a establir els mecanismes moleculars que uneixen ambdós processos. Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit format a partir de l'agregació de d'A&#61538;&#61472;i la conseqüent nitrotirosinació de proteïnes, potencia l'agregació de la proteïna tau en forma de fibres. D'aquesta forma, la nitrotirosinació de la proteïna triosafosfat isomerasa (TPI) podria ser el vincle entre la toxicitat derivada del agregats d'A&#61538;&#61472;i la patologia derivada de la proteïna tau. Per tant, la nitrotirosinació de la TPI podria explicar la progressió temporal que ocorre als cervells de pacients amb la malaltia d'Alzheimer des de la toxicitat induïda per l'A&#61538;&#61472;i l'aparició dels NFT. Els resultats presentats en aquesta tesi podrien obrir nous aspectes en la recerca de la malaltia d'Alzheimer així com en altres malalties que cursin amb estrès oxidatiu i plegament erroni de proteïnes. / This thesis demonstrates that amyloid ß-peptide (Aß)-induced peroxynitrite contributes to the switch of the A&#946;42/A&#946;40 ratio that occurs in Alzheimer's disease (AD). Since A&#946;42 is more toxic due to its higher aggregation and stability, it contributes to the trigger of the disease. In addition the aggregation of A&#946;42 in form of the highly toxic oligomers is incremented by the presence of peroxynitrite. Moreover, these nitro-Aß42 oligomers are more toxic than those non-nitrated. All these results support the important role of peroxynitrite in AD etiology. Furthermore, since the identification of Aß accumulation and the subsequent formation of neurofibrillary tangles (NFT) as the two defining pathological hallmarks of AD, a fair amount of research on AD has been driven by the need to find the molecular mechanism linking Aß and NFT. This thesis shows the Aß-induced peroxynitrite, and the consequent nitrotyrosination of proteins, promotes tau fibrillization. Thus triosephosphate isomerase (TPI) nitrotyrosination could be the link between Aß-induced toxicity and tau pathology. Therefore, TPI nitrotyrosination may explain the temporal progression from Aß toxicity to NFT formation in AD brain. The work presented in this thesis could open a novel angle in the research of the pathophysiology of AD and could also have an impact to the research in other neurodegenerative diseases involving oxidative stress and protein misfolding.

Protein nitration is considered as a marker of reactive nitrogen species formation. Heme oxygenases (HOs) are important for the defence against oxidative stress. We evaluated the involvement of the neuronal (nNOS), the endothelial (eNOS), and the inducible (iNOS) in nitrotyrosine formation and localitzation, and both the expression and funcional significance (HO inhibition and contractility studies) of HOs in sepsis-induced muscle contractile dysfunction. Sepsis was elicited by injecting rats and transgenic mice deficient in either nNOS, eNOS, or iNOS isoforms with E.Coli lipolysaccharide (LPS). Nitrotyrosine formation and HO expressions were assessed by immunoblotting. Oxidative stress was assessed measuring protein oxidation, lipid peroxidation, and muscle glutathione. We conclude that protein tyrosine nitration occurs in normal muscles, and sepsis-mediated increase in nitrotyrosine formation is limited to the mitochondria and membrane muscle fractions. The iNOS isoform is mostly involved in nitrotyrosine formation. HOs protect normal and septic muscles from the deleterious effects of oxidants. / En un model de sepsi de disfunció diafragmàtica, s´ha avaluat el paper de les sintetases de l'òxid nítric (NOS) en la formació i localitzacio de 3-nitrotirosina, i l´expressió i significat biològic de les hemo oxigenases (HOs) (inhibidor de les HOs i estudis de contractilitat) davant l' estrès oxidatiu. La sepsi s'induí mitjançant injecció de 20 mg/kg del lipolisacàrid (LPS) d´Escherichia Coli a rates, i a ratolins deficients en les NOS induïble (iNOS), neuronal (nNOS) i endotelial (eNOS). Les proteïnes nitrificades i les HOs es van detectar amb anticossos específics. L' estrès oxidatiu s' avaluà mitjançant l' oxidació proteica, la peroxidació lipídica i el glutation muscular. Concloem que hi han proteïnes nitrificades en el múscul normal i aquestes s'incrementen durant la sepsi en les fraccions mitocondrial i membranar. L'isoforma iNOS és majorment responsable de la formació de nitrotirosina. Les HOs protegirien el múscul normal i sèptic dels efectes deleteris dels oxidants.

En aquest treball de tesis doctoral s'estudia el paper de l'estrès oxidatiu tant a la etiologia com a la patofisiologia del dany vascular associat a la malaltia d'Alzheimer. Es demostra la capacitat de les cèl·lules musculars llises vasculars de produir pèptid &#946;-amiloide (A&#946;). L'estrès oxidatiu associat a edats avançades, estimula el processament amiloidogènic de l' APP a cèl·lules musculars llises vasculars portant a un augment de producció d' A&#946;1-40 i A&#946;1-42 contribuint així, a la formació dels depòsits amiloides vasculars. Alhora, els depòsits amiloides vasculars indueixen dany vascular a través d'estrès oxidatiu, a on la nitrotirosinació de proteïnes juga un paper clau en la inactivació d'enzimes essencials per la viabilitat cel·lular. La vitamina E i els estrogens tenen un efecte protector a neurones i cèl·lules musculars llises vasculars mentre que la vitamina E, però no els estrogens, és capaç de protegir les cèl·lules endotelials davant la toxicitat induïda pel pèptid A&#946;. / In this thesis we study the effect of oxidative stress in the etiology and pathophysiology of the vascular damage associated to Alzheimer's disease. We demonstrate the production of amyloid-&#946;-peptide (A&#946;) by vascular smooth muscle cells. Oxidative stress related to advance ages, induces the amyloidogenic APP cleavage producing an increase of A&#946;1-40 and A&#946;1-42 by vascular smooth muscle cells, which in tum contribute to vascular amyloid deposits generation. Vascular amyloid deposits induce oxidative stress, in which protein nitrotyrosination plays a key role in essential enzymes inactivation. Vitamin E and estrogens are able to protect neurons and vascular smooth muscle cells while vitamin E, but not estrogens, is able to protect endothelial cells against A&#946;-mediated toxicity.