A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve Ca2+, troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura \"coiled-coil\", constituída de duas α-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo \"cabeça-cauda\" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N- terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade e-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das \"coiled-coils\". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50Hw), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) e um peptídeo sintético (Ac-Tm215-235) com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por sua interação com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50HW), Tm220-284) estão completamente dimerizados a 10 µM (concentração do dímero em 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0; 100 mM de NaCI; 0,5 mM de DTT e 0,5 mM de EDTA, 10°C), enquanto que fragmentos que não possuem o e-terminal nativo (Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão [θ]222/[θ]208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento Tm143-235 é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região, incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e\' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da \"coiled-coil\" e por fim, uma grande fração de resíduos β-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, ASTm1-142 e nfTm1-142, o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos e-terminais acabam na posição 260 (Tm167-260 e Tm143-260) e um deles termina na posição 284 (Tm220-284), que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal ASTm1-142 e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura a-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais. / Tropomyosin (Tm) participates in the process of muscle contraction, which is controlled by an allosteric mechanism involving Ca2+, troponin (Tn), actin (Ac) and myosin. Tm is a coiled-coil flexible molecule composed by two α-helices with 284 amino acids each. Tm molecule performs head-to-tail interactions with another Tm molecule through the overlap of approximately 8 to 15 N-terminal residues of one molecule with 8 to 15 C-terminal residues of the other molecule. Thus Tm forms linear filaments in low ionic strengths, which is characteristic for a polymerization process. The stability of specific regions of Tm may be important to its function in controlling the regulation of muscle contraction. Besides, Tm can be used as a relatively simple model and of natural occurrence to understand the intra- and intermolecular interactions that govern the stability of \"coiled-coils\". We therefore produced eight recombinant fragments of Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) and one synthetic peptide (Ac-Tm215-235) to investigate the relative conformational stabilities of different regions derived from the C-terminal end of the molecule, which is known to interact with the troponin complex. Analytical ultracentrifugation experiments show that fragments comprising the last 24 residues of the molecule (Tm143-284(50Hw), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50Hw), Tm220-284) are completely dimerized at 10 µM (dimer concentration in buffer containing 50 mM phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCI, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA, 10ºC), whereas the fragments that do not posses the native C-terminal portion (Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) present a monomer-dimer equilibrium at the same conditions. Trifluoroethanol promoted a decrease in the ratio [θ]222/[θ]208 for all fragments (observed by circular dichroism), and induced the formation of stable trimers for the fragments comprising the residues 261-284. Urea denaturation studies, followed by circular dichroism and fluorescence, show that residues 261-284 of Tm are very important for the stability of the C-terminal half of the molecule. Still, the absence of this region promotes an increase in the cooperativity of unfolding induced by urea. Urea and temperature denaturation experiments showed that the fragment Tm143-235 is relatively unstable when compared to other fragments of the same size. We identified some factors that may be contributing to the particular instability of this region, including interhelix repulsions between residues in positions g and e\' of the heptad repeat, a charged residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil and a great fraction of (β-branched residues located at d positions. It is known that the non-acetylation of the N-terminus of the Tm molecule, as well as, the absence of some residues in the C-terminus of the molecule cause Tm to loose its ability to undergo polymerization. Former works performed in our laboratory showed that a fragment of recombinant Tm (ASTm1-260) with the dipeptide fusion Ala-Ser (which is known by its ability in restores the polymerization of non-acetylated Tms), despite the absence of the C-terminal 24 amino acids, polymerizes to a much greater extent than the corresponding full length recombinant protein. To better investigate the nature of the head-to-tail interaction we constructed two fragments that comprise the N-terminal half of the Tm: ASTm1-142 and nfTm1-142, the former containing the dipeptide AS (Ala-Ser) fusion to its N-terminus, and the latter presenting a bare non-acetylated N-terminus without the dipeptide fusion . These two fragments were employed in thermal denaturation assays followed by circular dichroism to test their head-to-tail interaction along with three fragments comprising Tm\'s C-terminal region. Two of the C-terminal fragments ends at position 260 (Tm167-260 and Tm143-260), whereas one ends at position 284 (Tm220-284). Results show that there is a head-to-tail interaction between the N-terminal fragment ASTm1-142 and all other e-terminal fragments employed in this study. Recombinant Tm molecules ending at position 260, are capable of performing head-to-tail interactions, regardless of their stability under the studied condition. Upon interaction, an increase in the a-helix content occurs preferentially in the e-terminal fragments.

Uma série de mutantes recombinantes da tropomiosina com a sonda fluorescente 5-hidroxitriptofano inserida em várias posições ao longo da seqüência primária vêm sendo utilizados em nosso laboratório para o estudo em nível molecular do controle do processo de contração muscular. Estes mutantes têm sido produzidos em cepas de bactéria auxotróficas para triptofano em meio mínimo ao qual adicionamos 5-hidroxitriptofano, um análogo do aminoácido triptofano. Esta sonda fluorescente apresenta a vantagem de absorver energia numa faixa de comprimentos de onda não absorvida pelo triptofano (temos usado com sucesso o comprimento de onda de 312 nm para excitar seletivamente o 5-hidroxitriptofano). Desta forma, o ambiente da sonda pode ser estudado em situações nas quais outras proteínas que possuam triptofanos, como, por exemplo a actina, estejam presentes. Procedemos a uma caracterização dos mutantes utilizados quanto à sua ligação à actina na ausência e presença de troponina (+/- Ca2+) e na presença de acrilamida por meio de ensaios de co-sedimentação com actina. O comportamento funcional dos diversos mutantes foi investigado pela análise da regulação da atividade Mg2+ -ATPásica da acto-S1 miosina destes mutantes na ausência e na presença de troponina (+/- Ca2+). Estudos da estabilidade destes mutantes da tropomiosina por meio de desnaturação por temperatura seguida por dicroísmo circular foram realizados para analisarmos o efeito das mutações na estabilidade global da molécula. Ensaios de desnaturação por uréia seguidas por fluorescência também foram realizados para analisarmos a estabilidade da molécula próxima à região da sonda fluorescente. O presente estudo compreendeu ainda a análise da supressão de fluorescência pelos supressores extrínsecos acrilamida e iodeto para diversos mutantes da tropomiosina na presença e ausência de outras proteínas do filamento fino, o que permitiu a obtenção de informações sobre o grau de exposição da sonda fluorescente nas diversas situações estudadas bem como sobre o ambiente eletrostático ao redor das sondas nestas diferentes situações. Estes resultados permitiram a obtenção de um modelo para a ligação da tropomiosina ao filamento de actina na presença de troponina (+/- Ca2+). Este modelo propõe que as bandas α do padrão de repetição α/β inicialmente proposto por Mclachlan e Stewart (1975 e 1976) se liguem ao filamento na ausência de íons cálcio. A introdução de cálcio no sistema é capaz de induzir uma rotação e um deslocamento na molécula de tropomiosina com relação ao filamento de actina. Nesta situação, seriam as bandas β da tropomiosina as responsáveis pela ligação desta molécula ao filamento de actina. / Several recombinant mutants of tropomyosin with the fluorescent probe 5-hydroxytryptophan inserted at several positions along the primary sequence are being used in our laboratory for studying the control of the muscular contraction process at a molecular level. These mutants are produced in bacterial strains auxotrophic to tryptophan in minimal medium to which 5- hydroxytryptophan, a tryptophan analogue, is added. This fluorescent probe has the advantage of absorbing light in a range of wavelengths not absorbed by the amino acid tryptophan (we have been successfully using the wavelength of 312 nm to selectively excite the 5-hydroxytryptophan). The environment of the probe can thus be studied even when other tryptophan containing proteins, such as actin, are present. We have characterized the mutants as to their ability to bind to actin in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+) and in the presence of acrylamide through actin co-sedimentation assays. The functional behavior of the several mutants constructed was assessed by analyzing their ability to regulate the acto-S1 myosin Mg2+-ATPase activity in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+). Studies on the stability of these tropomyosin mutants by thermal denaturation followed by circular dichroism were performed to analyze the effect of the mutations on the molecule\'s global stability. Urea denaturation assays followed by fluorescence were also performed to allow us to investigate the stability of the molecule in the vicinity of the fluorescent probe. The present study also involved the analysis of the fluorescence quenching by the extrinsic quenchers acrylamide and iodide for divers tropomyosin mutants in the presence and in the absence of other thin filament proteins. This allowed us to obtain information on the degree of exposure of the fluorescent probe in the several conditions studied as well as on the electrostatic microenvironment surrounding the probes in these different situations. These results enabled us to propose a model for the binding of tropomyosin to the actin filament in the presence of troponin (+/Ca2+). In this model the α-bands from the α/β repetition pattern initially proposed by Mclachlan and Stewart (1975 and 1976) would be binding the filament in the absence of calcium ions. The introduction of calcium to the system would induce a rolling motion in and a displacement of the tropomyosin molecule with relation to the actin filament. In this situation tropomyosin\'s β-bands would be responsible for the binding of this molecule to the actin filament.

A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve Ca2+, troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura \"coiled-coil\", constituída de duas α-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo \"cabeça-cauda\" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N- terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade e-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das \"coiled-coils\". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50Hw), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) e um peptídeo sintético (Ac-Tm215-235) com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por sua interação com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50HW), Tm220-284) estão completamente dimerizados a 10 µM (concentração do dímero em 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0; 100 mM de NaCI; 0,5 mM de DTT e 0,5 mM de EDTA, 10°C), enquanto que fragmentos que não possuem o e-terminal nativo (Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão [θ]222/[θ]208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento Tm143-235 é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região, incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e\' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da \"coiled-coil\" e por fim, uma grande fração de resíduos β-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, ASTm1-142 e nfTm1-142, o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos e-terminais acabam na posição 260 (Tm167-260 e Tm143-260) e um deles termina na posição 284 (Tm220-284), que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal ASTm1-142 e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura a-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais. / Tropomyosin (Tm) participates in the process of muscle contraction, which is controlled by an allosteric mechanism involving Ca2+, troponin (Tn), actin (Ac) and myosin. Tm is a coiled-coil flexible molecule composed by two α-helices with 284 amino acids each. Tm molecule performs head-to-tail interactions with another Tm molecule through the overlap of approximately 8 to 15 N-terminal residues of one molecule with 8 to 15 C-terminal residues of the other molecule. Thus Tm forms linear filaments in low ionic strengths, which is characteristic for a polymerization process. The stability of specific regions of Tm may be important to its function in controlling the regulation of muscle contraction. Besides, Tm can be used as a relatively simple model and of natural occurrence to understand the intra- and intermolecular interactions that govern the stability of \"coiled-coils\". We therefore produced eight recombinant fragments of Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) and one synthetic peptide (Ac-Tm215-235) to investigate the relative conformational stabilities of different regions derived from the C-terminal end of the molecule, which is known to interact with the troponin complex. Analytical ultracentrifugation experiments show that fragments comprising the last 24 residues of the molecule (Tm143-284(50Hw), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50Hw), Tm220-284) are completely dimerized at 10 µM (dimer concentration in buffer containing 50 mM phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCI, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA, 10ºC), whereas the fragments that do not posses the native C-terminal portion (Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) present a monomer-dimer equilibrium at the same conditions. Trifluoroethanol promoted a decrease in the ratio [θ]222/[θ]208 for all fragments (observed by circular dichroism), and induced the formation of stable trimers for the fragments comprising the residues 261-284. Urea denaturation studies, followed by circular dichroism and fluorescence, show that residues 261-284 of Tm are very important for the stability of the C-terminal half of the molecule. Still, the absence of this region promotes an increase in the cooperativity of unfolding induced by urea. Urea and temperature denaturation experiments showed that the fragment Tm143-235 is relatively unstable when compared to other fragments of the same size. We identified some factors that may be contributing to the particular instability of this region, including interhelix repulsions between residues in positions g and e\' of the heptad repeat, a charged residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil and a great fraction of (β-branched residues located at d positions. It is known that the non-acetylation of the N-terminus of the Tm molecule, as well as, the absence of some residues in the C-terminus of the molecule cause Tm to loose its ability to undergo polymerization. Former works performed in our laboratory showed that a fragment of recombinant Tm (ASTm1-260) with the dipeptide fusion Ala-Ser (which is known by its ability in restores the polymerization of non-acetylated Tms), despite the absence of the C-terminal 24 amino acids, polymerizes to a much greater extent than the corresponding full length recombinant protein. To better investigate the nature of the head-to-tail interaction we constructed two fragments that comprise the N-terminal half of the Tm: ASTm1-142 and nfTm1-142, the former containing the dipeptide AS (Ala-Ser) fusion to its N-terminus, and the latter presenting a bare non-acetylated N-terminus without the dipeptide fusion . These two fragments were employed in thermal denaturation assays followed by circular dichroism to test their head-to-tail interaction along with three fragments comprising Tm\'s C-terminal region. Two of the C-terminal fragments ends at position 260 (Tm167-260 and Tm143-260), whereas one ends at position 284 (Tm220-284). Results show that there is a head-to-tail interaction between the N-terminal fragment ASTm1-142 and all other e-terminal fragments employed in this study. Recombinant Tm molecules ending at position 260, are capable of performing head-to-tail interactions, regardless of their stability under the studied condition. Upon interaction, an increase in the a-helix content occurs preferentially in the e-terminal fragments.

Uma série de mutantes recombinantes da tropomiosina com a sonda fluorescente 5-hidroxitriptofano inserida em várias posições ao longo da seqüência primária vêm sendo utilizados em nosso laboratório para o estudo em nível molecular do controle do processo de contração muscular. Estes mutantes têm sido produzidos em cepas de bactéria auxotróficas para triptofano em meio mínimo ao qual adicionamos 5-hidroxitriptofano, um análogo do aminoácido triptofano. Esta sonda fluorescente apresenta a vantagem de absorver energia numa faixa de comprimentos de onda não absorvida pelo triptofano (temos usado com sucesso o comprimento de onda de 312 nm para excitar seletivamente o 5-hidroxitriptofano). Desta forma, o ambiente da sonda pode ser estudado em situações nas quais outras proteínas que possuam triptofanos, como, por exemplo a actina, estejam presentes. Procedemos a uma caracterização dos mutantes utilizados quanto à sua ligação à actina na ausência e presença de troponina (+/- Ca2+) e na presença de acrilamida por meio de ensaios de co-sedimentação com actina. O comportamento funcional dos diversos mutantes foi investigado pela análise da regulação da atividade Mg2+ -ATPásica da acto-S1 miosina destes mutantes na ausência e na presença de troponina (+/- Ca2+). Estudos da estabilidade destes mutantes da tropomiosina por meio de desnaturação por temperatura seguida por dicroísmo circular foram realizados para analisarmos o efeito das mutações na estabilidade global da molécula. Ensaios de desnaturação por uréia seguidas por fluorescência também foram realizados para analisarmos a estabilidade da molécula próxima à região da sonda fluorescente. O presente estudo compreendeu ainda a análise da supressão de fluorescência pelos supressores extrínsecos acrilamida e iodeto para diversos mutantes da tropomiosina na presença e ausência de outras proteínas do filamento fino, o que permitiu a obtenção de informações sobre o grau de exposição da sonda fluorescente nas diversas situações estudadas bem como sobre o ambiente eletrostático ao redor das sondas nestas diferentes situações. Estes resultados permitiram a obtenção de um modelo para a ligação da tropomiosina ao filamento de actina na presença de troponina (+/- Ca2+). Este modelo propõe que as bandas α do padrão de repetição α/β inicialmente proposto por Mclachlan e Stewart (1975 e 1976) se liguem ao filamento na ausência de íons cálcio. A introdução de cálcio no sistema é capaz de induzir uma rotação e um deslocamento na molécula de tropomiosina com relação ao filamento de actina. Nesta situação, seriam as bandas β da tropomiosina as responsáveis pela ligação desta molécula ao filamento de actina. / Several recombinant mutants of tropomyosin with the fluorescent probe 5-hydroxytryptophan inserted at several positions along the primary sequence are being used in our laboratory for studying the control of the muscular contraction process at a molecular level. These mutants are produced in bacterial strains auxotrophic to tryptophan in minimal medium to which 5- hydroxytryptophan, a tryptophan analogue, is added. This fluorescent probe has the advantage of absorbing light in a range of wavelengths not absorbed by the amino acid tryptophan (we have been successfully using the wavelength of 312 nm to selectively excite the 5-hydroxytryptophan). The environment of the probe can thus be studied even when other tryptophan containing proteins, such as actin, are present. We have characterized the mutants as to their ability to bind to actin in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+) and in the presence of acrylamide through actin co-sedimentation assays. The functional behavior of the several mutants constructed was assessed by analyzing their ability to regulate the acto-S1 myosin Mg2+-ATPase activity in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+). Studies on the stability of these tropomyosin mutants by thermal denaturation followed by circular dichroism were performed to analyze the effect of the mutations on the molecule\'s global stability. Urea denaturation assays followed by fluorescence were also performed to allow us to investigate the stability of the molecule in the vicinity of the fluorescent probe. The present study also involved the analysis of the fluorescence quenching by the extrinsic quenchers acrylamide and iodide for divers tropomyosin mutants in the presence and in the absence of other thin filament proteins. This allowed us to obtain information on the degree of exposure of the fluorescent probe in the several conditions studied as well as on the electrostatic microenvironment surrounding the probes in these different situations. These results enabled us to propose a model for the binding of tropomyosin to the actin filament in the presence of troponin (+/Ca2+). In this model the α-bands from the α/β repetition pattern initially proposed by Mclachlan and Stewart (1975 and 1976) would be binding the filament in the absence of calcium ions. The introduction of calcium to the system would induce a rolling motion in and a displacement of the tropomyosin molecule with relation to the actin filament. In this situation tropomyosin\'s β-bands would be responsible for the binding of this molecule to the actin filament.

O objetivo deste trabalho foi contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos na regeneração muscular esquelética, através do estudo da influência das proteínas de choque térmico (HSPs) e do mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) no processo regenerativo muscular. O tratamento com radicicol (indutor de HSPs) em músculos lesados induziu aumento da área de secção transversal das fibras musculares em 10 e 21 dias após lesão e aumento do número de células satélites e de fibras musculares em diferenciação em 1 e 10 dias após lesão, respectivamente, quando comparado aos seus respectivos controles apenas lesados. O tratamento com rapamicina (inibidor de mTORC1) em músculos lesados induziu uma diminuição maior da área de secção transversal das fibras musculares em 10 e 21 dias após lesão e menor síntese protéica muscular em 10 dias após lesão quando comparado aos músculos somente lesados. Nossos resultados sugerem que as HSPs e o mTORC1 são importantes para o processo de regeneração muscular esquelética. / The goal of this work was to contribute to a better understanding about the intracellular mechanisms involved in skeletal muscle regeneration by studying the influence of heat shock proteins (HSPs) and mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) in the muscle regeneration process. The treatment with radicicol (a HSP inductor) in injured muscles induced increase of myofiber cross section area at 10 and 21 days post lesion and increased number of satellite cells and differentiating myofibers at 1 and 10 days post lesion, respectively, when compared to their respective injured controls. The treatment with rapamycin (a mTORC1 inhibitor) in injured muscles induced a more accentuated decrease in myofiber cross section area at 10 and 21 days post lesion and decreased muscle protein synthesis at 10 days post lesion when compared to only-injured muscles. Our results suggest that HSPs and mTORC1 are important to the process of skeletal muscle regeneration.

Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press). / Tropomyosin (Tm) is a coiled-coil protein that polymerizes by head-totail interactions in an ionic-strength-dependent manner. In skeletal muscle,Tm interacts with troponin (Tn) to modulate muscle contraction via its Ca2+-dependent repositioning on the actin filament. Since residues 258-275 present a striated muscle-specific pattern atypical for a coiled-coil structure, we produced a total of 18 polymerizable (ASTm) and non-polymerizable (nfTm) versions of recombinant Tm with tryptophan analogues probes incorporated at specific positions near their C-termini. We found three mutants whose fluorescence are specifically sensitive to Tn-binding (position 263), actin-binding (261) or Tm polymerization (269). We used these mutants to: i) quantitatively investigate the ASTm monomer - polymer equilibrium and its dependence on ionic strength and determine a minimum number effective charges involved in stabilizing the head-to-tai/ interaction, ii) demonstrate that amino acid residue 263 of Tm interacts with residues 77-157 of TnT and that neighboring amino acid sequences along the primary structure of TnT modulate this interaction, iii) quantitatively analyze the binding of the ASTm mutants to Tn, in the presence and in the absence of actin and Ca2+; and iv) qualitatively investigate the influence of the head-to-tail overlap in Tm binding to actin and/or Tn.

O objetivo deste trabalho foi contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos na regeneração muscular esquelética, através do estudo da influência das proteínas de choque térmico (HSPs) e do mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) no processo regenerativo muscular. O tratamento com radicicol (indutor de HSPs) em músculos lesados induziu aumento da área de secção transversal das fibras musculares em 10 e 21 dias após lesão e aumento do número de células satélites e de fibras musculares em diferenciação em 1 e 10 dias após lesão, respectivamente, quando comparado aos seus respectivos controles apenas lesados. O tratamento com rapamicina (inibidor de mTORC1) em músculos lesados induziu uma diminuição maior da área de secção transversal das fibras musculares em 10 e 21 dias após lesão e menor síntese protéica muscular em 10 dias após lesão quando comparado aos músculos somente lesados. Nossos resultados sugerem que as HSPs e o mTORC1 são importantes para o processo de regeneração muscular esquelética. / The goal of this work was to contribute to a better understanding about the intracellular mechanisms involved in skeletal muscle regeneration by studying the influence of heat shock proteins (HSPs) and mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) in the muscle regeneration process. The treatment with radicicol (a HSP inductor) in injured muscles induced increase of myofiber cross section area at 10 and 21 days post lesion and increased number of satellite cells and differentiating myofibers at 1 and 10 days post lesion, respectively, when compared to their respective injured controls. The treatment with rapamycin (a mTORC1 inhibitor) in injured muscles induced a more accentuated decrease in myofiber cross section area at 10 and 21 days post lesion and decreased muscle protein synthesis at 10 days post lesion when compared to only-injured muscles. Our results suggest that HSPs and mTORC1 are important to the process of skeletal muscle regeneration.

Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press). / Tropomyosin (Tm) is a coiled-coil protein that polymerizes by head-totail interactions in an ionic-strength-dependent manner. In skeletal muscle,Tm interacts with troponin (Tn) to modulate muscle contraction via its Ca2+-dependent repositioning on the actin filament. Since residues 258-275 present a striated muscle-specific pattern atypical for a coiled-coil structure, we produced a total of 18 polymerizable (ASTm) and non-polymerizable (nfTm) versions of recombinant Tm with tryptophan analogues probes incorporated at specific positions near their C-termini. We found three mutants whose fluorescence are specifically sensitive to Tn-binding (position 263), actin-binding (261) or Tm polymerization (269). We used these mutants to: i) quantitatively investigate the ASTm monomer - polymer equilibrium and its dependence on ionic strength and determine a minimum number effective charges involved in stabilizing the head-to-tai/ interaction, ii) demonstrate that amino acid residue 263 of Tm interacts with residues 77-157 of TnT and that neighboring amino acid sequences along the primary structure of TnT modulate this interaction, iii) quantitatively analyze the binding of the ASTm mutants to Tn, in the presence and in the absence of actin and Ca2+; and iv) qualitatively investigate the influence of the head-to-tail overlap in Tm binding to actin and/or Tn.