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Orientador: Lair Zambon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T08:23:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DanielBotelho_D.pdf: 9890444 bytes, checksum: 90e3892529ddea892b184c2ca660ac69 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A maioria dos carcinomas de pulmão não pequenas células (CPNPC) em estádios avançados com mutações ativadoras (deleções do exon 19 ou a mutação L858R do exon 21) do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) respondem inicialmente, aos medicamentos gefitinib e erlotinib, que são inibidores da tirosina quinase (TKIs) do EGFR. Porém em uma média de 6-12, meses esses tumores desenvolvem resistência adquirida aos TKIs do EGFR. Dois mecanismos de resistência ao gefitinib/erlotinib explicam porque os CPNPC com mutações do EGFR se tornam resistentes aos TKIs: mutações de resistência secundária e um sistema de "troca de oncogenes". A mutação T790M-EGFR secundária ocorre em 50% dos pacientes com mutação no EGFR com resistência adquirida aos TKIs do EGFR, e em in vitro esta mutação T790M-EGFR inativa a hipersensitividade das mutações ativadoras do EGFR ao gefitnib ou erlotinib. Outras mutações de resistência secundárias (D761Y, L747S, A854T) são raras. Um outro mecanismo de resistência é a amplificação adquirida do oncogene MET, que ocorre em mais ou menos 20% do pacientes resistentes ao gefitinib/erlotinib e, em metade destes casos, em conjunção com T790M. O MET ativa sinais de sinalização que contornam o EGFR inibido, gerando um sistema de "troca de oncogenes" nesses tumores. Esses dados pré-clinicos relevantes aos CPNPCs com o EGFR mutado e resistência ao gefitinib ou erlotinib levaram ao desenvolvimento de experimentos clínicos com novos inibidores do EGFR que inibem "in vitro" a mutação T790M-EGFR (HKI-272, XL-647, BIBW-2992 e PF00299804), e inibidores de MET mais TKIs do EGFR em combinação. Neste trabalho: 1) Agrupamos e resumimos os dados dos experimentos clínicos prospectivos com o gefinitib em pacientes com o EGFR mutado. Mais de 80% dos pacientes com deleções do exon 19 ou a mutação L858R do EGFR tiveram resposta radiográfica, com sobrevivência livre de progressão de 7,7 a 12,9 meses nos estudos identificados, e sobrevivência geral acima de 15 meses; 2) Usamos células CPNPC com mutações do EGFR para identificarmos a molécula pró-apoptótica BIM como o efetor principal da apoptose induzida pelos TKIs do EGFR; 3) Caracterizamos a mutação resistente ao gefinitib EGFR-L858R-L747S, e determinamos que L858R-L747S apresenta um padrão de resistência menos acentuado ao gefitinib do que o observado com L858R-T790M; e 4) Avaliamos os efeitos do erlotinib em pacientes com CPNPC EGFR mutado e resistência ao gefitinib, caracterizando a correlação da resposta radiográfica e clínica com os mecanismos conhecidos de resistência ao TKIs do EGFR (as mutações de resistência secundárias T790M e L747S, e a amplificação do MET). A maioria (mais de 83%) dos pacientes resistentes ao gefitinib tiveram progressões radiográficas nos primeiros 2 a 4 meses de exposição ao erlotinib 150 mg/dia. Isto é consistente com nossas observações pré-clínicas, indicativas de que a maioria dos tumores resistentes ao gefitinib possui predominantemente T790M e/ou amplificações do MET, que são resistentes tanto ao gefitinib quanto erlotinib. Pesquisas pré-clínicas e experimentos clínicos futuros do CPNPC com EGFR mutado têm o potencial de melhorar os resultados do tratamento clínico de pacientes com essas mutações somáticas. / Abstract: Most advanced non-small cell lung cancers (NSCLCs) with activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations (exon 19 deletions or L858R) initially respond to the EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) gefitinib and erlotinib. However, over time (median of 6-12 months) most tumors develop acquired resistance to EGFR TKIs. Intense research in these NSCLCs has identified two major mechanisms of resistance to gefitinib/erlotinib: secondary resistance mutations and "oncogene kinase switch" systems. The secondary T790M mutation occurs in 50% of EGFR mutated patients with TKI resistance, and in vitro this mutation negates the hypersensitivity of activating EGFR mutations. Other secondary resistance mutations (D761Y, L747S, A854T) seem to be rare. The amplification of the MET oncogene is present in 20% of TKI-resistant tumors; however in half of the cases with this "oncogene kinase switch" mechanism the T790M is co-existent. The growing pre-clinical data in EGFR mutated NSCLCs with acquired resistance to gefitinib or erlotinib has spawned the initiation or conception of clinical trials testing novel EGFR inhibitors that in vitro inhibit T790M (HKI-272, XL-647, BIBW-2992 and PF00299804), and MET inhibitors in combination with EGFR TKIs. In this work we: 1) Pooled and summarized data from prospective clinical trials of gefitinib for EGFR mutated patients. More than 80% of patients with exon 19 deletions or the L858R EGFR mutation attained a radiographic response with progression-free survival of 7.7 to 12.9 months in the identified studies, and overall survival exceeding 15 months; 2) Identified the pro-apoptotic molecule BIM as the main effector of EGFR TKI-induced apoptosis using NSCLC cell lines with EGFR mutations; 3) Characterized the L858R-L747S gefitinib-resistant mutation, and demonstrated that L858R-L747S has a partial resistance pattern when compared to L858R-T790M; and 4) Evaluated the effects of erlotinib in EGFR mutated NSCLC with resistance to gefitinib while characterizing the correlation of response and resistance to this approach to the known mechanisms of resistance to EGFR TKIs (the secondary mutations T790M and L747S, and the amplification of MET). Our clinical observation was that the majority (over 83%) of the gefitinib-resistant patients given erlotinib 150 mg/day had radiographic progression within the first 2 to 4 months of exposure. This is consistent with our pre-clinical observations, since we expected gefitinib-resistant tumors to predominantly harbor T790M and/or MET amplification, which are cross-resistant to both gefitinib and erlotinib. Ongoing pre-clinical and clinical research in EGFR mutated NSCLC has the potential to significantly improve the outcomes of patients with these somatic mutations. / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

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ALMEIDA FILHO, T. P. Expressão e perfil mutacional do gene BCR-ABL em pacientes com leucemia mieloide crônica tratados com inibidores de tirosina quinase. 2017. 66 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-04-17T16:15:15Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_tpalmeidafilho.pdf: 2787026 bytes, checksum: b9194e4f13c4eef4b75cffe6dd53068b (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-04-17T16:15:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_tpalmeidafilho.pdf: 2787026 bytes, checksum: b9194e4f13c4eef4b75cffe6dd53068b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T16:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_tpalmeidafilho.pdf: 2787026 bytes, checksum: b9194e4f13c4eef4b75cffe6dd53068b (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / Most patients with chronic myeloid leukemia (CML) express the transcripts b2a2, b3a2 or both of the BCR-ABL gene. The role of these transcripts in the prognosis of patients undergoing treatment with tyrosine kinase inhibitors (ITKs) has been poorly investigated and remains unclear to date. In this study, we evaluated the prognostic value of the main transcripts in patients with CML, by evaluating the expression and mutational profile of the BCR-ABL gene in patients treated with ITKs. Sixty patients with CML were evaluated transversally. Demographic, hematological, and clinical data and mutation profile of CML patients treated with ITKs were obtained from medical records. Molecular analyzes for the determination of transcripts and mutations (T315, E255V and Y253H) were performed by the qPCR technique. Statistical analyzes were performed using the Kruskal-Wallis or one-way ANOVA tests, depending on the normality of the data. The level of significance was 0.05 and p values of less than 0.05 were considered significant. Of the sixty patients, 12 (20%) expressed the b2a2 transcript, 18 (30%) the b3a2 transcript, 10 (16.7%) both b2a2/b3a2 transcripts and 20 (33.3%) had undetectable levels. Twenty-eight patients (46.7%) were female and 32 (53.3%) were males, with a mean age of 46.5 ± 15.7 years (ranging from 19-82). The comparative analysis of hematological data with transcripts showed a significant difference in the number of leukocytes in patients expressing the b2a2 and b3a2 transcripts (p <0.05), with patients with the b2a2 transcript associated with lower amounts. The other data, hematological and clinical, did not show statistically significant differences in relation to transcripts (p>0.05). Regarding mutations of the kinase domain, the presence of the T315, E255V and Y253H mutations in the study patients was not evidenced. These are the first results found in this population, being necessary more studies with a greater number of individuals and evaluation of the cytogenetic and molecular responses to the treatment. If confirmed as a prognostic factor capable of providing better outcomes and response to treatment, the transcripts could be used in the elaboration of new mathematical models for patient risk stratification and in the selection of the best therapy with ITKs for patients with CML. / A maioria dos pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC) expressam os transcritos b2a2, b3a2 ou ambos do gene BCR-ABL. O papel desses transcritos no prognóstico dos pacientes em tratamento com inibidores de tirosina quinase (ITKs) tem sido pouco investigado e até o momento permanece incerto. Neste estudo, foi avaliado o valor prognóstico dos principais transcritos nos pacientes com LMC, através da avaliação da expressão e perfil mutacional do gene BCR-ABL em pacientes tratados com ITKs. Sessenta pacientes com LMC foram avaliados transversalmente. Os dados demográficos, hematológicos, clínicos e o perfil de mutações dos pacientes com LMC tratados com ITKs foram obtidos através dos prontuários. As análises moleculares para a determinação dos transcritos e das mutações (T315, E255V e Y253H) foram realizadas pela técnica de qPCR. As análises estatísticas foram realizadas através dos testes Kruskal-Wallis ou one-way ANOVA dependendo da normalidade dos dados. O nível de significância foi de 0,05 e valores de p inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Dos sessenta pacientes, 12 (20%) expressavam o transcrito b2a2, 18 (30%) o transcrito b3a2, 10 (16,7%) ambos os transcritos b2a2/b3a2 e 20 (33,3%) apresentaram níveis indetectáveis. Vinte e oito pacientes (46,7%) eram do sexo feminino e 32 (53,3%) do sexo masculino, com média de idade 46,5 ± 15,7 anos (variando de 19-82). A análise comparativa dos dados hematológicos com transcritos mostrou diferença significante na quantidade de leucócitos nos pacientes que expressavam os transcritos b2a2 e b3a2 (p<0,05), sendo os pacientes com o transcrito b2a2 associados a quantidades inferiores. Os demais dados, hematológicos e clínicos, não mostraram diferença estatisticamente significantes com relação aos transcritos (p>0.05). Quanto às mutações do domínio quinase, não foi evidenciada a presença das mutações T315, E255V e Y253H nos pacientes em estudo. Estes são os primeiros resultados encontrados nesta população, sendo necessário mais estudos com um número maior de indivíduos e avaliação das respostas citogenéticas e moleculares ao tratamento. Se confirmado como fator de prognóstico capaz de proporcionar melhores desfechos e resposta ao tratamento, os transcritos poderão ser empregados na elaboração de novos modelos matemáticos para estratificação de risco dos pacientes e na seleção da melhor terapia com ITKs para pacientes com LMC.

PETROLA, Maria Juracy Solon. Perfil do estresse oxidativo em pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica. 2011. 80 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-03T14:21:31Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjspetrola.pdf: 1006862 bytes, checksum: 350554246ce2360a0b03508d84166b59 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-03T14:22:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjspetrola.pdf: 1006862 bytes, checksum: 350554246ce2360a0b03508d84166b59 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-03T14:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjspetrola.pdf: 1006862 bytes, checksum: 350554246ce2360a0b03508d84166b59 (MD5) Previous issue date: 2011 / Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by clonal expansion of hematopoietic progenitor cells, result from the translocation (9:22). The oncogene BCR-ABL, in the Ph chromosome, is transcribed and translated into a fusion protein BCR / ABL. The ABL tyrosine kinase (TK) in the fusion protein is constitutively activated and is needed for the initial leukemogenic event of CML and its activity induces production of reactive oxygen species (ROS). Of particular relevance to CML is the fact that an increase of ROS can have consequences, facilitating genomic instability may contribute to disease progression. The aim of this study was to determine the oxidative status in patients with CML, in attendance at a university hospital (HUWC). This is a cross-sectional study consisted of 30 adult patients of both sexes with clinical and laboratory diagnosis of CML on treatment with inhibitors (TK) 1st and 2nd generation. The concentrations of malondialdehyde (MDA) and nitrite (NO2-) were performed by spectrophotometric method. The activities of enzymes glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) were determined in hemolysate by Glutathione Peroxidase Cellular Activity Kit ® Assay (Sigma-Aldrich) and spectrophotometry, respectively. Total glutathione, reduced glutathione (reduced GSH), glutathione (GSSG) were determined by Total Glutathione Activity Kit ® (Assay Designs, Inc) and calculated the ratio GSH / GSSG. For statistical analysis of nonparametric data was used ® and ANOVA test for multiple comparisons Tukey. It was considered the minimum level of significance of 5%. The average concentrations of NO2- and MDA were increased in CML patients compared to control, regardless of disease activity. The antioxidant profile was characterized by decreased CAT and GSH-Px increased also independent of disease activity. The reduced GSH is presented decreased, the GSSH, increased and GSH / GSSG decreased. It was observed that patients using protease inhibitors of TK 2nd generation of oxidative stress parameters were significantly elevated compared to controls. In the analysis of patients on imatinib were not detected significant changes in oxidative status. We conclude that patients with CML are under oxidative stress and impaired antioxidant activity. / A Leucemia mielóide crônica (LMC) é caracterizada pela expansão clonal de células progenitoras hematopoéticas, resultante da translocação (9:22). O oncogene de fusão BCR-ABL, no cromossomo Ph, é transcrito e traduzido numa proteína de fusão BCR/ABL. A tirosina quinase (TK) ABL na proteína de fusão é constitutivamente ativada sendo necessária para os eventos leucemogênicos iniciais da LMC e sua atividade induz a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). De particular relevância para LMC é o fato de que um aumento de EROs pode ter consequências, facilitando a instabilidade genômica podendo contribuir para a progressão da doença. O objetivo do estudo foi determinar o perfil oxidativo em pacientes com LMC, em acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC). Trata-se de um estudo transversal constituído de 30 pacientes adultos, com diagnostico clínico e laboratorial de LMC, em tratamento com inibidores de (TK) de 1ª e 2ª geração. As concentrações de malonaldeído (MDA) e de nitrito (NO2-) foram realizadas por método espectofotométrico. As atividades das enzimas Glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT) foram determinadas no hemolisado, por kit Glutathione Peroxidase Cellular Activity Assay® (Sigma-Aldrich) e por espectofotometria, respectivamente. Glutationa total, glutationa reduzida (GSH reduzida), glutationa oxidada (GSSG) foram determinadas por kit Total Glutathione Activity® (Assay Designs, Inc) e calculada a relação GSH/GSSG. Para a análise estatística de dados não paramétricos foi utilizado o ANOVA® e o teste de múltiplas comparações de Tukey. Foi considerado o nível mínimo de significância de 5%. As concentrações média de MDA e de NO2- foram aumentadas nos pacientes com LMC em relação ao controle, independente da atividade da doença. O perfil antioxidante foi caracterizado pela diminuição da CAT e aumento da GSH-Px também independente da atividade da doença. A GSH reduzida se apresentou diminuída, a GSSH, aumentada e a relação GSH/GSSG diminuída. Os pacientes em uso de inibidores de TK de 2ª geração apresentaram parâmetros do estresse oxidativo significativamente elevados em relação ao grupo controle. Conclui-se que os pacientes com LMC estão sob estresse oxidativo e com atividade antioxidante comprometida.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:58Z : No. of bitstreams: 1 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:59Z : No. of bitstreams: 2 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5) Publico-11857b.pdf: 2062339 bytes, checksum: 8d0ca9b3ac4476504ad8de27d8b090d1 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:59Z : No. of bitstreams: 3 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5) Publico-11857b.pdf: 2062339 bytes, checksum: 8d0ca9b3ac4476504ad8de27d8b090d1 (MD5) Publico-11857c.pdf: 120525 bytes, checksum: 614bb713dcd2fcace0a691958c4f8ae7 (MD5) / Objetivos: C-kit é uma proteína tirosina–quinase transmembrana que possui importante papel na tumorogênese. Com o desenvolvimento de um novo composto, o mesilato de imatinibe, que inibe especificamente os receptores tirosina quinases, o C-kit passou a ser um importante alvo terapêutico. Nosso objetivo é estudar as características histopatológicas do retinoblastoma, a expressão imuno-histoquímica do C-kit neste tumor e correlacionar esta expressão com os principais fatores prognósticos do retinoblastoma. Material e Métodos: Oitenta e quatro blocos de parafina foram selecionados do arquivo do laboratório de patologia ocular Henry C. Witelson, Montreal, Canada. A imunohistoquímica do C-kit foi realizada de modo automatizado e os resultados foram correlacionados com a idade dos pacientes por ocasião do diagnóstico, grau de diferenciação tumoral e presença ou não de invasão de coróide e nervo óptico. O valor de p menor que 0.05 foi considerado estatisticamente significante. Resultados: A expressão imuno-histoquímica do C-Kit foi observada em 33/63 (52.38%) dos espécimes analisados. Apenas 2 dos 13 (15.4%) tumores que não apresentaram invasão de nervo óptico ou coróide foram positivos para C-kit. Por outro lado, a expressão do C-kit foi observada em 31 (62%) dos 50 tumores que apresentaram algum tipo de invasão seja para coróide ou nervo óptico , 26 dos 44 espécimes com envolvimento de coróide (59.9%), e 20 dos 29 com invasão de nervo óptico (68.96%). Quatorze dos 25 espécimes (56%) moderadamente ou bem diferenciados e 19 dos 38 (50%) pouco diferenciados apresentaram positividade para o C-kit. Dos 41 espécimes provenientes de pacientes com idade superior a 1 ano, e dos 14 (42.80%) com idade até 1 ano a expressão do C-kit foi observada em 21 (51,21%) e 6 (42.80%) espécimes respectivamente. Conclusões: Mais da metade dos retinoblastomas estudados expressaram o C-kit . A expressão do C-kit apresenta correlação estatisticamente significante com a a invasão de nervo óptico. / Purpose: C-kit is a transmembrane tyrosine kinase protein thought to play an important role in tumorigenesis. With the development of the compound Imatinib Mesylate which specifically inhibits tyrosine kinase receptors, C-kit has emerged as a potential therapeutic target. This study aims to determine the immunoexpression of C-kit in retinoblastoma and correlate this expression with histopathological prognostic features. Methods: Eighty-four paraffin-embedded enucleation globes of retinoblastoma were collected from the archives of the Henry C. Witelson Ocular Pathology Registry. C-kit immunostaining was used according to the protocol provided by Ventana Medical System Inc., Arizona. Immunoreactivity was correlated with the presence or absence of invasion into the choroid and optic nerve and the degree of tumour defferentiation. Odds ratios were calculated to quantify differences in C-kit expression between tumours with different patterns of invasion. Results: C-kit expression was identified in 33/63 specimens analysed (53.8%).Two of 13 tumours without choroidal or optic nerve invasio (15.4%) were positive for C-kit. C-kit expression was seen in 31 of the 50 tumours with extraretinal invasion (62%, p<0.01), 26 of 44 specimens with choroidal involvement (59.9%, p<0.02), and 20 of the 29 with optic nerve involvement (68.96%, p<0.02). Fourteen of 25 moderate or well-diferentiated specimens (56%) and 19 of 38 undifferentiated specimens (50%) displayed positivity for C-kit (p>0.5). Conclusions: More than half of Retinoblastomas in this study expressed C-kit. The expression of Ckit in these retinoblastomas strongly correlated with histopathological features of worse prognosis including optic nerve and choroidal invasion. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_D.pdf: 34867811 bytes, checksum: 839d8dbb3d76170bebebbc5e8619b847 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K / Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_M.pdf: 14587191 bytes, checksum: b8bac41b29ca5081a5bcb225f83e4773 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Arrazoado. A Quinase de Adesão Focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação da sinalização que determina as alterações fenotípicas de cardiomiócitos estimulados mecanicamente. A regulação da atividade da FAK é complexa e depende de mecanismos intramoleculares e da cooperação com a tirosino-quinase Src. Há evidências de que a tirosino-fosfatase SHP-2 contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina e, portanto da atividade da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Este estudo objetivou examinar se a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs. Examinamos se em MVRNs controle (i.e. não submetido a estímulo mecânico), a atividade da SHP-2 contribui para o baixo nível de fosforilação em tirosina da FAK e se em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos a inibição da atividade da SHP-2 paralela a dissociação FAK/SHP-2 exerce papel permissivo na elevação da fosforilação da FAK. Material e Métodos. Utilizou-se modelo de sobrecarga pressora por coarctação da aorta em ratos (miocárdio-VE) e estiramento in vitro em MVRNs. As abordagens experimentais incluíram técnicas de imunoprecipitação, western blot, imunohistoquímica, atividade de tirosino fosfatase in vitro, expressão de SHP-2 recombinante e avaliação da expressão do gene da cadeia pesada de beta-miosina (ß- miosina). Resultados. A coarctação da aorta (miocárdio-VE) e o estiramento (MVRNs) aumentaram a fosforilação da FAK no resíduo tirosina 397, em miocárdio-VE (200%) e em MVRNs estirados (75%). A FAK imunoprecipitada de amostras controles, encontrou-se associada a SHP-2 e o estímulo mecânico acompanhou-se de redução dessa associação, no miocárdio (60%) e em MVRNs (84%). Experimentos com imunohistoquímica e microscopia confocal demonstraram co-localização da FAK e da SHP-2 em MVRNs controle. Ocorreu redução da atividade de tirosino-fosfatase em imunoprecipitados de anticorpo anti-FAK (25%) e anticorpo anti-SHP-2 (25%) de miocárdio-VE de animais submetidos à coarctação da aorta, e anti-FAK (20%) e anti-SHP-2 (40%) de MVRNs estirados. A SHP-2 recombinante foi capaz de reduzir (70%) in vitro a fosforilação da FAK ativada por estímulo mecânico. Ocorreu aumento (125%) da quantidade de FAK fosforilada em MVRNs controles tratados com TFMS (inibidor seletivo da atividade da SHP-2); naqueles submetidos ao estiramento, o aumento em relação aos MVRNs estirados, mas não tratados com TFMS, foi menor (40%). Ocorreu paralelamente, diminuição (40%) da associação FAK/SHP-2 e aumento da expressão do gene fetal da cadeia pesada da ß - miosina (110%) em MVRNs tratados com TFMS; Os MVRNs tratados concomitantemente com TFMS e PP2 (inibidor farmacológico da FAK), apresentaram atenuação desse aumento (25%). Conclusão. Os dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs, exercendo papel inibitório na ativação da FAK, contribuindo para o seu baixo nível de fosforilação em MVRNs e miocárdio na ausência de estímulo mecânico. A diminuição da associação FAK/SHP-2, da atividade específica da SHP-2 em MVRNs ou miocárdio submetidos a estímulos mecânicos e o aumento da fosforilação da FAK mediante tratamento dos MVRNs com TFMS, indicam que a redução da atividade da SHP-2 e da associação a FAK, é um importante mecanismo que colabora para o aumento de fosforilação da FAK em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos sustentados. O aumento da expressão da cadeia pesada da ß ¿ miosina conseqüente à inibição da atividade da SHP-2 e a atenuação desse aumento, perante a concomitante inibição da atividade da FAK, corrobora nossa hipótese de que a SHP-2 modula a ativação da FAK em cardiomiócitos, influenciando a reprogramação gênica característica da ativação da sinalização hipertrófica, por estímulo mecânico / Abstract: Mechanical forces drive changes in cardiac myocyte function and structure that occur in response to hemodynamic overload. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether the protein tyrosine-phosphatase SHP-2 plays a role in baseline and stretch induced FAK activation and signaling in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).NRVMs were subjected to cyclic stretch up to 60 min, studied by coimmunoprecipitation, immunoblotting, tyrosine-phosphatase activity assay, RT-PCR, and used in assays utilizing recombinant SHP-2 catalytic domain. Analysis was extended to NRVMs treated with Shp2 inhibitor TFMS and with FAK/Src Inhibitor PP2. FAK had a relatively low basal level of phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs. Cyclic stretch (1HZ, 10%) induced rapid and sustained (up to 60 min) increases in phosphorylation of FAK at Tyr397. The results of coimmunoprecipitation assays indicated that FAK and SHP-2 are associated in non-stretched NRVMs, but cyclic stretch markedly reduced (to 25% and 60% after 10 and 60 min, respectively) the amount of SHP-2 recovered from the anti-FAK antibody precipitates. The tyrosine phosphatase activity of the anti-SHP-2 immunocomplex taken from non-stretched cardiac myocytes was relatively high, but it was markedly reduced (to 60% after 10 and 60 min) in samples of stretched cells. The recombinant PTP domain of SHP-2 was demonstrated to be able to dephosphorylate the native FAK immunoprecipitated from NRVMs. The inhibition of SHP-2 activity by the pharmacological inhibitor TFMS markedly increased FAK phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs to levels comparable to those seen in stretched cells. Treatment with TFMS lasting for 4h was accompanied by a marked increase (to 200) the expression of beta-myosin heavy chain mRNA in non-stretched NRVMs. This effect was attenuated by 25% in NRVMs simultaneous treated with the FAK/Src inhibitor PP2.In conclusion, the present data demonstrated that the basal FAK phosphorylation at Tyr397 is modulated by SHP-2 and that inhibition of SHP-2 during cyclic stretch has a permissive role on FAK activation by mechanical stress. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by SHP-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T23:08:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_Leandro_M.pdf: 3831901 bytes, checksum: 40e5df211d7e6fd923f654bd8d3a1ec1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Nas doenças do coração ocorre hipertrofia e remodelamento do ventrículo esquerdo com impacto negativo na evolução clínica. Esses fatores influenciam independentemente o risco cardiovascular por elevarem a predisposição a infartos do miocárdio, ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca e ao aparecimento de arritmias ventriculares graves. Estruturalmente ocorrem crescimento e degeneração dos miócitos cardíacos, fibrose e alterações da microcirculação. Estas alterações comprometem irreversivelmente a histoarquitetura do miocárdio, limitando a eficácia dos tratamentos convencionais, principalmente no estágio mais avançado caracterizado pela insuficiência cardíaca. A rede de sinalização celular envolvida na resposta das células miocárdicas (miócito e não miócitos) a forças mecânicas tem papel crítico na compreensão da patogênese da hipertrofia. A quinase de adesão focal (FAK), uma enzima associada à sinalização por integrinas, é ativada precocemente e exerce influência no desenvolvimento e sustentação da resposta hipertrófica do miocárdio à sobrecarga pressórica. Nesse estudo foi avaliado o efeito de um composto inédito derivado de quinazolina (BZLO) com potencial ação inibitória da FAK no coração de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica por coarctação da aorta. In vitro, esse composto inibiu a atividade catalítica da FAK purificada com IC50 de 1nM. In vivo, o tratamento dos camundongos submetidos à coarctação da aorta com o composto (BZLO) provocou inibição do resíduo Tyr397 da FAK. Demonstrando que o composto não só preveniu, mas também promoveu regressão da hipertrofia do ventrículo esquerdo típica do modelo, acompanhada de atenuação da hipertrofia dos cardiomiócitos e da fibrose intersticial, e preservação da função ventricular. Esses resultados indicam que o tratamento com o composto (BZLO), presumivelmente por inibir a FAK, atenua as alterações estruturais e funcionais provenientes da sobrecarga pressórica crônica no ventrículo esquerdo de camundongos, sugerindo seu potencial como alternativa na prevenção e tratamento da insuficiência cardíaca / Abstract: Cardiac remodeling and hypertrophy have negative impact in the evolution of heart disease. They raise predisposition to myocardium infarction, heart failure and fatal ventricular arrhythmias, being independent markers of cardiovascular prognosis. Cardiomyocyte growth followed by degeneration, interstitial fibrosis and alterations in the microcirculation can be detected structurally in hypertrophic hearts. These alterations jeopardize myocardium tissue architecture irreversibly limiting therapeutic efficacy especially in advanced stages of disease with heart failure. The understanding of signaling network in response to mechanical stimuli is crucial in the study of cardiac hypertrophy. Focal adhesion kinase (FAK) an enzyme linked to signaling by integrins is activated in response to pressure overload and influences the development of myocardial hypertrophic response. In the present study, a compound based on quinazoline scaffold which is a FAK inhibitor, named BZLO, is examined for its effects on cardiac hypertrophy of mice model of aortic constriction. BZLO strongly inhibits catalytic activity of purified FAK in vitro (IC50 = 1nM). Satisfactory bioavailability of BZLO was observed after oral administration. BZLO treatment decreased FAK phosphorylation at Tyr397 and attenuated cardiomyocyte growth and interstitial fibrosis preserving cardiac function in the mice model of chronic pressure overload induced by aortic constriction. These findings suggest that BZLO is effective in attenuating the deleterious structural and functional consequences of chronic pressure overload in mice heart, suggesting that it has the potential to be considered as an option for the prevention and treatment of heart failure / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências