Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una enfermedad de etiología desconocida, que afecta a niños y adolescentes, caracterizándose por un aumento de volumen y sensibilidad, uni o bilateral de las glándulas parótidas, asociada generalmente a una sialectasia no obstructiva, sin signos de infección aguda. Usualmente se acompaña de fiebre leve y malestar general, lo que compromete la calidad de vida del paciente, quienes son tratados por distintos especialistas sintomáticamente; ya que sin causa aparente tiende a remitir. En este estudio, se propuso analizar saliva parotídea de 33 pacientes entre 4 y 14 años, con presentación clínica uni o bilateral de PCRI, en periodo de latencia de la enfermedad. Se utilizó la técnica de inmuno-western-blot con anticuerpo anti-metaloproteasa-9 (anti-MMP-9), para identificar formas moleculares de MMP-9 tanto en glándulas afectadas y no afectadas clínicamente por PCRI, en condiciones desnaturalizantes y desnaturalizantes/reductoras. Se utilizó como agente reductor βmercaptoetanol para reducir las muestras salivales y dilucidar de esta forma la separación de formas acomplejadas de MMP-9. La muestra de saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó un total de 11 bandas de distinto peso molecular (>250, 250, 141, 100, 75, 60, 50, 47, 37, 29 y 25 kDa). Las formas moleculares de >250, 250, 141, 100, 50 y 47 kDa, corresponden a complejos moleculares de MMP-9 que son susceptibles de ser disociados en condiciones desnaturalizantes/reductoras. En presencia del agente reductor, se produce un aumento de las formas de MMP-9 de tamaños moleculares correspondientes a 75, 60, 29 y 25 kDa. La saliva parotídea proveniente de glándulas afectadas clínicamente por PCRI, presenta mayoritariamente el complejo molecular de MMP-9 de 141 kDa, lo que sugiere que se encuentra involucrado en la patogénesis de la enfermedad. La saliva parotídea proveniente de glándulas no afectadas clínicamente por PCRI, también presenta formas de MMP-9 de distintos tamaños moleculares, lo que sugiere que están afectadas subclínicamente por la enfermedad.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado, mediante zimografía, la presencia de metaloproteasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. En este estudio se propuso analizar, mediante zimografía, la actividad gelatinasa en saliva parotídea de dichos pacientes e identificar, mediante inmuno-western-blot, las formas moleculares de metaloproteasa 9. En 34 pacientes con PCRI de 4 a 13 años de edad, se recolectó saliva parotídea bilateral, se midió concentración de proteínas mediante el método de Bramhall, para posteriormente determinar la actividad gelatinasa mediante zimografía. Se registró el compromiso clínico-sialográfico de ambas glándulas parótidas y se les correlacionó con la actividad enzimática de las gelatinasas en cuestión. Además se realizó inmuno-western-blot con anticuerpo antiMMP-9 y se comparó la frecuencia de las distintas formas moleculares de metaloproteasa 9 en saliva proveniente de parótidas clínicamente afectadas y clínicamente sanas. La saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó actividad gelatinasa en ambas glándulas, independiente de si están o no afectadas clínicamente. Sólo se observó diferencia estadísticamente significativa en la actividad enzimática de la metaloproteasa de 141kDa, donde hubo una mayor actividad en glándulas clínicamente afectadas. La saliva de individuos con PCRI no presento un patrón uniforme de formas moleculares de MMP-9. La frecuencia de las formas moleculares de las MMP-9 analizadas en saliva parotídea de pacientes PCRI, no presentó diferencias estadísticamente significativas entre aquellas muestras tomadas de glándulas clínicamente sanas y clínicamente afectadas, salvo en las formas moleculares de 169kDa y 139kDa, que fueron más frecuentes en saliva proveniente de glándulas comprometidas clínicamente.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado, mediante zimografía, la presencia de metaloproteasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. Mediante western-blot, se ha detectado con mayor frecuencia la presencia de MMP-9 en la saliva proveniente de glándulas afectadas clínicamente en relación a las no afectadas. No existen estudios que analicen la presencia de MMP-2 en PCRI, mediante anticuerpos. En este estudio se propuso analizar, la presencia de formas moleculares de MMP-2 con actividad gelatinasa en la saliva parotídea bilateral de pacientes con PCRI. En 36 pacientes con PCRI uni o bilateral, de 4 a 14 años de edad, se recolectó saliva parotídea bilateral, se cuantificó la concentración de proteínas mediante el método de Bramhall, se determinó la actividad gelatinasa mediante zimografía y la presencia de MMP-2 mediante Western blot. Se registró el compromiso clínico-sialográfico de ambas glándulas parótidas como: glándulas clínicamente afectadas y no afectadas. Se determinó la frecuencia de MMP-2 salival con actividad gelatinolítica, en relación al compromiso clínico de la glándula. En la totalidad de los pacientes se detectaron 5 bandas con actividad gelatinasa y 17 formas moleculares de MMP-2, no encontrándose patrones de bandeo para estas moléculas en la enfermedad. Las formas moleculares de MMP2 de >250 kDa y 62 kDa, presentaron actividad gelatinasa. No hubo diferencias en la frecuencia de estas formas de MMP-2, tanto en la saliva parotídea proveniente de glándulas afectadas como en las no afectadas clínicamente por PCRI. Los resultados sugieren que tanto en la PCRI bilateral como en la unilateral, ambas glándulas parótidas se encuentran comprometidas en la enfermedad, aunque algunas glándulas no se vean afectadas por el aumento de volumen clínico.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Se inicia a los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia, comprometiendo la calidad de vida. Estudios recientes relacionan alteraciones de la composición molecular salival parotídea de pacientes con PCRI, con el grado de alteración sialográfico parotídeo. El propósito de este estudio fue realizar un seguimiento de la composición molecular de la saliva parotídea de pacientes con PCRI sometidos a mantención terapéutica. Se incluyeron 28 pacientes con PCRI tratados en el Servicio Máxilofacial Infantil del Hospital San Juan de Dios. Se tomó muestra de saliva parotídea bilateral para determinar: a) Concentración de proteínas, b) Perfiles electroforéticos unidimensionales y c) Frecuencia de actividad metaloproteinasa MMP9 y MMP2; antes y después de un periodo de mantención terapéutica. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI luego de la mantención terapéutica no presenta variaciones en la concentración de proteínas y en la frecuencia de individuos que presentan actividad MMP-9 y MMP-2. Los perfiles electroforéticos se mantienen relativamente estables a excepción de dos bandas: la banda I que se presentó en una menor cantidad de pacientes que recibieron el tratamiento, y la banda J que se presenta en una mayor cantidad de pacientes luego de que estos recibieran tratamiento. El conjunto de observaciones realizadas, ha permitido determinar que después de un largo periodo de tiempo de mantención terapéutica, la saliva parotídea de pacientes con PCRI presenta una mantención de las alteraciones en la composición molecular. Se requiere de estudios adicionales que permitan identificar y caracterizar las proteínas que variaron después del tratamiento en la saliva de estos pacientes.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Parotiditis crónica recurrente infantil (PCRI), inflamación recurrente de etiología desconocida se manifiesta alrededor de los 3 años y se mantiene hasta la adolescencia, comprometiendo la calidad de vida. Estudios recientes reportan un aumento en la frecuencia de algunos polipéptidos en la saliva parotídea proveniente de pacientes con PCRI al compararla con la de sujetos controles sanos. El propósito de este estudio fue identificar polipéptidos variantes asociados a la condición de PCRI. Se incluyeron 37 pacientes con PCRI que estaban siendo tratados en el Servicio Maxilofacial Infantil del Hospital San Juan de Dios y 8 individuos controles sanos. Se tomó muestra de saliva parotídea bilateral para determinar: concentración de proteínas, perfiles electroforéticos unidimensionales, frecuencias de polipéptidos variantes e identificación de ellos mediante espectrometría de masas MALDI TOF. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI, en relación a los controles, presenta con mayor frecuencia los polipéptidos de 87, 43, 37, 33, 29 y 26 kDa. La banda de 26 kDa presente en el 100% de los pacientes con PCRI, corresponde a la región C de la cadena liviana kappa de inmunoglobulina. Un péptido de 144 kDa, exclusivo para los pacientes con PCRI se presentó en 6 muestras. Los pacientes con PCRI presentan en su saliva parotídea alteraciones en la frecuencia de varias proteínas en relación a los individuos controles sanos. El aumento de la frecuencia de la banda correspondiente a la región C de la cadena liviana kappa de la inmunoglobulina sugiere un mecanismo de respuesta glandular asociado a esta condición patológica.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología aún no dilucidada de la glándula parótida asociada a sialectasia no obstructiva. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado la presencia de metaloproteinasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. En este estudio, trabajo se propuso analizar la frecuencia y actividad enzimática de las formas activas y latentes de dichas metaloproteinasas. En 32 pacientes con PCRI de 4 a 13 años, se recolectó saliva parotídea y se analizó mediante cuantificación de proteínas por el método de Bramhall para posteriormente determinar la actividad metaloproteinasa 2 y 9 mediante zimografía en presencia de gelatina. Se registró el compromiso clínico y sialográfico de ambas glándulas parótidas y se les correlacionó con la frecuencia y actividad nzimática de las formas activas y latentes de las metaloproteinasas en cuestión. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI, presentó una tendencia a una mayor frecuencia y actividad enzimática de las metaloproteinasas 2 y 9 de la saliva proveniente de glándulas comprometidas clínica y sialográficamente respecto de la saliva proveniente de glándulas asintomáticas. Sin embargo, no hubo diferencia estadística entre estos dos tipos de saliva para ninguno de los parámetros medidos. La presencia de las formas activas y latentes de las metaloproteinasas 2 y 9 en saliva proveniente de glándulas asintomáticas de los pacientes PCRI unilateral, sugiere que existe una modalidad subclínica de esta patología afectando a dichas parótidas. Estudios osteriores con un número mayor de muestras, realizados en pacientes con distintos esquemas terapéuticos, al inicio y durante el tratamiento, serían interesantes para poder determinar de manera mas clara la diferencia entre la frecuencia y actividad enzimática metaloproteasa en la saliva proveniente de glándulas comprometidas versus glándulas clínicamente sanas.

Tesis para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo y al Grado de Magíster en Enología y Vitivinicultura / La astringencia es una sensación táctil provocada al consumir algunos alimentos como frutas o algunas bebidas, como el vino, asociados a la presencia de polifenoles en su composición. Estas moléculas pueden interactuar con las proteínas de la saliva para producir agregados insolubles. Como consecuencia de esto, la lubricación de la cavidad bucal se pierde generando una sensación que se percibe en la boca como de sequedad o arrugamiento. Un numero de diferentes factores pueden afectar aquellas interacciones, tales como la composición y contenido de polifenoles, el alcohol, polisacáridos, ácidos orgánicos, entre otros. Sin embargo, varios informes han señalado al pH como el factor principal que afecta esas interacciones. En el presente estudio se evaluó el efecto del pH en el rango en el que se encuentran los vinos (2.8-4.0) sobre la interacción entre las proteínas salivares y las proantocianidinas de semillas de Carménère, mediante ensayos de difusión y precipitación en membranas de celulosa. Ambos ensayos fueron relacionados con la percepción de astringencia determinada por un panel sensorial. Los ensayos se realizaron a los pH que normalmente se producen los vinos (2.8, 3.2, 3.6, 4.0), junto con un control a pH 7.0. Los resultados indican que cambios de pH dentro de ese rango podrían cambiar significativamente el modo de difusión y la solubilidad de las proteínas salivares, es decir, a pH más bajos existe una interacción mayor entre proantocianidinas y proteínas salivares, lo que llevaría a una mayor percepción de astringencia. / Astringency is a tactile sensation elicited by some foods, like fruits, and some drinks, like wine, associated to the presence of polyphenols in their composition. These molecules can interact with the salivary proteins to produce insoluble aggregates. As a consequence of this, lubrication of the oral cavity is lost and a sensation of dryness and wrinkling mouth feel is perceived. A number of different factors may affect those interactions, such as the composition and concentration of polyphenols, alcohol, polysaccharides and organic acids, among others. Several reports have pointed to pH as a main factor affecting those interactions. In the present study the effect of changes within a narrow range of wine pH (2.8-4.0) on the interactions between salivary proteins and proanthocyanidins of Carménère seeds was assessed by diffusion and precipitation assays on cellulose membranes. Both assays were contrasted against astringency perception as determined by a sensory panel. Trials were conducted at pH usually occurring in wines (2.8, 3.2, 3.6, 4.0), together with a control condition at pH 7.0. We observed that changes within that range of pH could change significantly the mode of diffusion and solubility of the salivary protein, that is, at lower pH there is a higher interaction between proanthocyanidin and salivary proteins, which would lead to a greater sensation of astringency.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología / Una de las propiedades de los taninos es su capacidad de precipitar proteínas, fenómeno que ha sido asociado a su capacidad de producir astringencia. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la interacción de dos taninos enológicos comerciales de distinta naturaleza (hidrolizable y condensado) con proteínas de saliva humana. Se caracterizaron 10 taninos enológicos comerciales (TECs) mediante análisis espectrofotométricos de fenoles totales, taninos totales e índice de gelatina. A continuación se seleccionó un tanino condensado y otro hidrolizable, con los cuales se realizaron los ensayos de interacción tanino-proteínas de la saliva humana. Estos correspondieron a ensayos de difusión y precipitación sobre láminas de celulosa, empleando saliva humana como fuente de proteínas. Los ensayos consistieron básicamente en determinar la magnitud de la interacción entre taninos y proteínas tras mezclar concentraciones crecientes de cada uno de los dos TECs con una cantidad fija de saliva. Alícuotas de la mezcla (antes y después de centrifugación de la misma) fueron depositadas sobre láminas de celulosa, secadas, fijadas y teñidas para la detección de la distribución del material proteico. Las concentraciones de fenoles totales observadas en los taninos seleccionados promediaron 437 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g TEC, valores ampliamente superiores a lo encontrado por diversos autores en extractos de semillas y hollejos (10-30 mg EAG/g y 5-15 mg EAG/g, respectivamente). El contenido de taninos totales en los TECs seleccionados promedió 18,2 mg equivalentes de cianidina (EC) /g TEC, valor que se encuentra dentro del rango de concentraciones de taninos totales observado por otros autores en extractos de semillas y hollejos (10-60 y 5-20 mg EC/g, respectivamente). No se observó relación entre el contenido de fenoles totales y el de taninos totales, pues un alto contenido de taninos totales no implicó necesariamente un alto contenido de fenoles totales y viceversa. En los ensayos de interacción tanino-proteína correspondientes a los ensayos de difusión y precipitación sobre láminas de celulosa, se observaron diferencias notorias en la difusión y precipitación entre ambos tipos de TECs. Además ninguno de los dos TECs logro provocar el 100% de la precipitación de las proteínas salivales, formando además complejos solubles entre los taninos y las proteínas salivales. A partir de los resultados de este estudio, se puede concluir que dos TECs distintos (hidrolizables y condensados) interactúan diferencialmente con las proteínas salivales y que la metodología aplicada permite la evaluación independiente, expedita y objetiva de las interacciones entre proteínas salivales y extractos de TECs. / One of the main properties of tannins is its ability to precipitate proteins, a phenomenon that has been associated with its capacity to produce astringency. The aim of this study was to evaluate the interaction of two different commercial enological tannins (hydrolysable and condensed) with human salivary proteins. 10 commercial enological tannins (TECs) were characterized by total phenols, total tannins and gelatin index. Afterwards, one condensed and one hydrolysable tannin were selected, with which the interaction tannin-human salivary protein tests were conducted. These tests were the diffusion and precipitation assays over cellulose sheets using human saliva as proteins source. These assays determined the magnitude of the interaction between tannins and proteins after a mix of an increasing concentration of each one of the two TECs with a constant quantity of saliva. Aliquots of the mix (before and after centrifugation) were spotted onto cellulose membranes, dried, fixed and stained for the detection of the protein material distribution. The average total phenol concentration observed in the tannins was 437 mg EAG/g TEC, exceeding the values found in seeds and skins by several authors (10-30 mg EAG/g and 5-15 mg EAG/g, respectively). The total tannin concentration averaged 18,2 mg EC/g TEC, value within the range of total tannin concentration found by other authors in seeds and skins extracts (10-60 and 5-20 mg EC/g, respectively). A relation between the total phenol and the total tannin content was not observed, because a high total tannin content did not necessarily imply a high content of total phenols and vice versa. In the tests of tannin-protein interaction corresponding to the assays of diffusion and precipitation on sheets of cellulose, there were marked differences in the diffusion and precipitation between the two types of TECs. Furthermore neither induces a 100% of the precipitation of salivary proteins; however they did form soluble complexes between tannins and salivary proteins. From the results of this study, it is concluded that two different TECs (hydrolyzable and condensed) interact differentially with salivary proteins and that the methodology allows an expedite and objective independent evaluation of the interactions between salivary proteins and extracts from TECs.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La astringencia es una importante característica de calidad del vino tinto. Al degustarlo, produce aspereza, rugosidad y sequedad en la cavidad bucal, sensaciones que se han atribuido a la presencia de compuestos fenólicos (taninos) en el vino tinto. Se ha señalado que estos compuestos interactúan con las proteínas de la saliva en la boca formando complejos, los cuales precipitan generando la pérdida de la capacidad lubricante de la saliva y la sensación que denominamos astringencia. Para estimar la astringencia que produce un vino se emplea un panel de degustación, de manera que implica siempre cierta subjetividad. Por otro lado, se ha señalado que la interacción y la precipitación de los complejos tanino-proteínas salivales se produce por la presencia de proteínas ricas en prolina (PRPs), abundantes en la saliva humana. La investigación de las interacciones tanino-saliva se aborda frecuentemente con taninos y proteínas específicas, soluciones proteicas ideales y/o muestra biológica procesada (mediante dilución, centrifugación o filtración). Tales interacciones son evaluadas en nuestro laboratorio empleando, en cambio, “saliva total humana”. Esta se utiliza en el estudio de la fracción proteica salival en ensayos de difusión sobre membranas de celulosa y mediante ensayos de precipitación. Hasta ahora, las evaluaciones asociadas a este fenómeno son prácticamente inexistentes, por lo cual se planteó como objetivo de esta Tesis: “Evaluar cuantitativamente interacciones entre la fracción proteica de la saliva total humana y polifenoles del vino”. Para ello, se ha propuesto como hipótesis que: “La medición sistemática de alteraciones tanto en la capacidad de difundir sobre matrices de celulosa como en la solubilidad de la fracción proteica salival, producidas por los polifenoles del vino, permite la cuantificación de la formación de complejos entre polifenoles del vino y la proteína salival.”. Se implementó un método de estudio cuantitativo de interacciones polifenoles-proteínas de la saliva total humana, se estableció un modelo de análisis donde la interacción es dependiente de la composición polifenólica en el vino y se especificaron parámetros para cotejar aspectos de la progresión de la interacción vino-fracción proteica de saliva total humana / Astringency is an important feature of red wine quality. On tasting, astringency produces roughness, puckering and dryness of the mouth, feelings that have been attributed to the presence of phenolic compounds (such as tannins) in red wine. These compounds interact with proteins in the saliva forming complexes in the mouth, which precipitate generating the loss of lubricant properties of saliva which is followed by the sensation of astringency. To estimate levels of wine astringency a taste panel is employed, a traditional procedure that always involves some subjectivity. Moreover, it´s been indicated that interaction and precipitation of tannin – salivary protein complexes it´s produced by the presence of proline-rich proteins (PRPs), typically abundant in human saliva. Previous investigations studying interactions between saliva and tannins used specific proteins, model proteins or ideal solutions and/or processed biological samples (by dilution, centrifugation or filtration). However, none study employed not disrupted human saliva. In our laboratory, interactions with tannins were evaluated using whole human saliva. With this biological sample, the study of salivary protein fraction in assays of diffusion on cellulose membrane and employing precipitation assays was performed. Until now, evaluations associated with this phenomenon were virtually nonexistent. Thus the objective of this thesis is "To assess quantitatively interactions between protein fraction of whole human saliva and wine polyphenols”. The working hypothesis is that: "The systematic measurement of disruptions both diffusion capability over cellulose membranes and solubility of salivary protein fraction, produced by wine polyphenols, allow quantitation of complex formation between wine polyphenols and the salivary protein”. A method for the quantitative study of polyphenol - protein of whole human saliva interactions was set up and established an analytical model where these interactions are dependent on the polyphenolic composition of wine, and defined specific parameters for the analysis of the interaction between wine and the salivary protein fraction of whole human saliva / Fondecyt