Els receptors d'adenosina són receptors acoblats a proteïna G classificats en A1, A2A, A2B i A3 en funció del grau d'afinitat pel seu agonista endogen, l'adenosina. Els receptors A1 i A3 interaccionen amb l'adenilat ciclasa (AC) inhibint la seva activitat i els receptors A2A I A2B activant-la. El receptor d'adenosina A1 (A1R) té un paper clàssicament neuroprotector mentre que el receptor A2A (A2AR) està associat a neurotoxicitat, dany neuronal i mort cel·lular. Les malalties neurodegeneratives són un conjunt de patologies que presenten dèficit cognitiu o alteracions motores en funció del tipus neuronal que degenera i que, bioquímicament s'anomenen proteïnopaties, perquè acumulen agregats proteics.L'objectiu d'aquest estudi ha estat l'anàlisi dels nivells d'expressió dels receptors d'adenosina en la malaltia de grans argiròfils (AGD), la malaltia d'Alzheimer (AD) i la malaltia de Parkinson (PD). En aquest punt, hem descrit un increment dels receptors A1R en l'hipocamp de pacients amb AGD i un increment dels receptors A1R i A2AR en el còrtex frontal de pacients amb AD des de estadiatges preclínics. Paral·lelament s'ha detectat un augment dels receptors A2AR en el nucli estriat de pacients amb PD que encara no han rebut tractament farmacològic. Altres autors havien descrit increments del receptor tot i que sempre associat a tractaments de llarga durada amb Levodopa (L-Dopa). A partir d'aquest resultat i per tal de conèixer el mecanisme molecular implicat en l'increment patològic del receptor vam afrontar el segon objectiu del treball: l'estudi de la regulació transcripcional del gen ADORA2A, gen que codifica pel receptor A2AR.Es va estudiar el percentatge de metilació de l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A, tant en línies cel·lulars com en l'estriat de pacients amb PD i el paper de dos factors de transcripció, ZBP-89 i Yin-yang 1(YY1), en l'increment patològic del receptor. La metilació de l'ADN és un dels principals mecanismes de repressió de l'expressió gènica. Hem demostrat que el percentatge de metilació en l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A controla els nivells d'ARNm del receptor en línies cel·lulars tot i que no hem observat canvis en el percentatge de metilació en el nucli estriat de pacients amb PD respecte els pacients controls. A més, hem demostrat, per primera vegada, que els factors de transcripció ZBP-89 i YY1 actuen com activador i repressor, respectivament, del receptor A2AR en les cèl·lules SHSY-5Y. En els pacients de PD no s'han observat canvis en l'expressió del ZBP-89 però sí, un increment tant a nivell d' ARNm com de proteïna del YY1. Conjuntament, per microscopia confocal, hem observat que YY1 està localitzat tant als nuclis de les cèl·lules positives com negatives pel receptor A2AR. En conclusió, el percentatge de metilació no varia en les regions analitzades entre controls i patològics. Tot i així, hem demostrat un increment patològic de YY1 en pacients amb PD i, com que està descrit que els nivells d'AMPc controlen l'expressió del factor de transcripció, ens permet proposar la hipótesis per la qual un increment de YY1 pot representar un mecanisme de regulació retrògrada del A2AR per tal de reduir-ne els nivells a PD. / Adenosine is a nucleoside distributed throughout the entire organism as an intermediary metabolite. At the extracellular level, adenosine plays multiple physiologic roles, interacting with specific receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine receptors A1 and A2B have been related in neuroprotective role and adenosine activity through A2 receptors (A2ARs) can give rise to neurotoxicity, neuronal damage and cellular death. In this work we have devolve two main points. First of all we characterized the adenosine receptor expression levels in neurodegenerative disease: Argirofilic grains disease (AGD), Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD). We described an increase of A1R in hippocampus of patients with AGD, increased levels of A1 and A2A in frontal cortex of patients with AD in early stages. We observed an increase of de A2A levels in striatum in PD patients with any treatment at all. Trying to know the molecular reason of the pathological expression levels of A2A R we studied the percent of methylation of 5'UTR of ADORA2A which codifies by A2aR in cell lines and in post-mortem tissue of patients of PD. We conclude that DNA methylation plays a role in a constitutive A2AR cell surface level, but no changes were observed comparing PD patients and controls. By the other hand, we studied the role of two transcription factors ZBP-89 and Yin-yang 1 (YY1) in the A2AR expression level. We conclude ZBP-89 active and YY1 repress the expression of the receptor in SHSY-5Y lines.

La rodopsina és el fotoreceptor visual responsable de la visió a baixa intensitat lumínica que es troba en les cèl·lules bastó de la retina. Aquesta proteïna és el model per excel·lència de la superfamília de receptors acoblats a proteïna G (GPCR), que estan constituïts per 7 hèlices transmembrana, i que tenen un gran interès farmacològic. La rodopsina és l'únic membre de la superfamília l'estructura del qual s'ha determinat per difracció de Raigs X. El seu estudi és de vital importància per determinar aquells motius estructurals comuns als GPCR, així com per contribuir a l'elucidació dels trets bàsics d'un mecanisme d'activació comú. A més, l'estudi de mutacions en rodopsina associades a malalties de la retina com la retinosi pigmentària (RP) i la ceguesa nocturna congènita (CNC), ha de permetre determinar les bases moleculars d'aquestes patologies. L'objectiu principal d'aquesta tesi és aprofundir en l'estudi dels determinants estructurals de l'estabilitat, així com també contribuir a desxifrar els mecanismes moleculars de la RP i la CNC. Per això s'ha estudiat l'efecte de factors externs, com la unió de cations (en particular del zenc), i l'estat de l'entorn lipídic (alterant la concentració del detergent dodecil maltòsid) en l'estabilitat de diferents estats de la rodopsina i del seu cromòfor. També s'ha determinat com afecten l'estabilitat i la conformació de la rodopsina mutacions puntuals associades a la CNC, T94I, i a la RP, L46R; i a la xarxa electrostàtica present entre la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 mitjançant la construcció de mutants senzills, dobles i triples en les posicions 134, 247 i 251, els quals s'ha vist que estan implicats en el canvi conformacional de pas a la forma activa. Els mutants s'han obtingut mitjançant tècniques de DNA recombinant, les proteïnes mutades s'han expressat en cèl·lules COS-1, immunopurificat amb l'anticòs monoclonal Rho-1D4, i caracteritzat per espectrofotometria UV-visible.Els resultats obtinguts demostren que el zenc s'uneix de manera específica a la rodopsina, disminuint la seva estabilitat tèrmica i la seva capacitat d'unir 11-cis-retinal.També s'ha demostrat que la temperatura provoca la isomerització específica de l'11-cis-retinal a tot-trans-retinal quan aquest es troba unit a rodopsina però no quan es troba lliure en solució. Això reforça la idea de la interacció òptima present entre els aminoàcids de la butxaca del retinal i el cromòfor. Pel que fa a l'estudi de l'efecte de l'entorn lipídic en l'estructura i estabilitat de la rodopsina, s'ha mostrat que elevades concentracions de detergent desestabilitzen la conformació activa (Metarodopsina II) però promouen la formació d'un fotointermediari inactiu (Metarodopsina III). El detergent, doncs, juga un paper molt important en el desplaçament de l'equilibri entre els diferents fotointermediaris.En el cas dels mutants associats a malalties de la retina, la mutació T94I disminueix l'estabilitat de la conformació inactiva però estabilitza enormement la conformació activa, indicant un paper rellevant de la T94 en l'estabilització d'una xarxa electrostàtica en l'entorn de la base de Schiff. La mutació L46R en la hèlix 1 i causant de la RP impedeix que la proteïna es processi correctament i arribi a la membrana. Aquest resultat posa èmfasi per primera vegada en la importància de l'hèlix 1 per a l'estructura de la rodopsina i probablement per altres GPCR. L'estudi dels mutants en les posicions 134, 247 i 251 en la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 ha confirmat que aquestes posicions són importants per a l'estabilitat de la conformació inactiva de la rodopsina. Es proposa una paper central de la posició 251 en l'estructura i l'estabilitat de la xarxa eletrostàtica que implica aquestes posicions.