Thesis Ph.D.)(Botany)-University of Pretoria, 2008.

Thesis (MSc (FABI))--University of Pretoria, 2008. / Includes summary. Includes bibliographical references. Available on the Internet via the World Wide Web.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007.

Thesis (Ph. D.)--Colorado State University, 2004. / Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 420-445). Available also in a digital version from Dissertation Abstracts.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

O uso de enzimas como agentes de modificação das propriedades funcionais de proteínas tem se tornado bastante difundido na indústria de alimentos. As proteases, apresentam inúmeras vantagens, principalmente, devido a sua atividade em baixas concentrações e a sua ausência de toxicidade, que faz com que se elimine a necessidade da sua remoção do produto final. O objetivo deste trabalho foi determinar as condições ótimas de produção da protease de Microbacterium sp. kr10, caracterizar e purificar parcialmente a enzima, assim como verificar a sua utilização como agente de modificação das propriedades funcionais da proteína de soja. Através da metodologia de superfície de resposta foram determinadas as condições ótimas de produção da protease, pH de 7,0, temperatura de 25°C e 12,5 g L-1 de farinha de pena (p/v). O padrão proteolítico da enzima tanto no extrato cru quanto na parcialmente purificada indicam que esta é uma metaloprotease, com pH e temperaturas ótimos nas faixas de 6,5 a 7,5, e 45 a 55°C, respectivamente. A atividade enzimática foi totalmente inibida por EDTA, fenantrolina, HgCl2 e CuCl2 e parcialmente inibida por ZnCl2, MnCl2 e SnCl2. A enzima foi parcialmente purificada através de cromatografia de gel filtração e troca iônica resultando num fator de purificação de 250. Um aumento gradativo do grau de hidrólise da proteína de soja foi observado à medida que se aumentou a razão enzima/substrato utilizada, assim como a redução da formação de espuma e o aumento da capacidade emulsificante de uma solução composta pelo hidrolisado de soja e óleo de soja, mesmo sob condições de alta temperatura e alta concentração de sal. Desta forma, esta protease apresenta potencial para aplicação como agente de modificação protéica de proteína de soja isolada.

Doctor of Philosophy / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Ying Fang / Viral papain-like proteases (PLPs)-related proteins have been shown to be actively involved in host innate immunity manipulation and virus replication. In this dissertation, the research were focused on the elucidation of biological roles of nidoviral PLPs-related proteins in innate immunity suppression and viral RNA transcription regulation. Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) is the most prominent swine diseases worldwide. Understanding PRRSV pathogenesis and development efficient vaccines are highly required in swine industry. PRRSV nsp2-related proteins including nsp2 and two ribosomal frameshifting products-nsp2TF and nsp2N share the same N-terminal PLP2 domain. In chapter 2, nsp2TF and nsp2N were demonstrated to be critical for host innate immunity suppression at least through the PLP2 domain-mediated deubiquitination and deISGylation effects. The infection of nsp2TF/nsp2N knockout mutants significantly upregulated antiviral innate immune responses in vitro. Furthermore, manipulating the expression of nsp2TF/nsp2N could enhance innate and adaptive immunity in pigs, providing potential basis for modified live vaccine development. In addition to the PLP2 domain of PRRSV nsp2-related proteins, the biological roles and biochemical nature of the poorly investigated long mysterious PLP2 downstream region was also characterized in Chapter 3. This long unknown region is also shared by nsp2-related proteins. At first, the hyper-phosphorylation nature of nsp2-related proteins was demonstrated. Physical features of this uncharacterized region was then delineated, including two intrinsically disordered hypervariable regions spaced by a structured inter-species conserved domain. One critical phosphorylated residues in the conserved domain were later proved to be of great importance in recombinant virus rescue and subgenomic RNAs accumulation. Collectively, our investigations underline the pleiotropic effects exerted by nsp2-related proteins in virus life cycle and potential contributions with pathogenesis. In Chapter 4, potential functions of PLP encoded by other nidovirus was also investigated. We discovered a unique cross-order recombination event, in which the chimeric picornavirus-enterovirus G expresses the PLP gene, homologous to torovirus (ToV) PLPs. Like other nidoviral PLPs, the recombinant ToV-PLP was proved to be a highly active deubiquinase/deISGylase and potent innate immune antagonist. After PLP knockout, viral fitness is significantly decreased and the suppression on host ubiquitination/ISGylation is largely reduced. Furthermore, host antiviral innate immune responses have been greatly upregulated post PLP knockout mutant infection. Our study underscores potential contributions of PLP domain in viral pathogenicity, and further provides an ideal example for how recombination shapes virus evolution. In summary, studies in this dissertation highlight the critical roles of nidoviral PLPs-related proteins in host immunity manipulation and virus replication, and more importantly, potential links with viral pathogenicity and application in vaccine development.

O uso de enzimas como agentes de modificação das propriedades funcionais de proteínas tem se tornado bastante difundido na indústria de alimentos. As proteases, apresentam inúmeras vantagens, principalmente, devido a sua atividade em baixas concentrações e a sua ausência de toxicidade, que faz com que se elimine a necessidade da sua remoção do produto final. O objetivo deste trabalho foi determinar as condições ótimas de produção da protease de Microbacterium sp. kr10, caracterizar e purificar parcialmente a enzima, assim como verificar a sua utilização como agente de modificação das propriedades funcionais da proteína de soja. Através da metodologia de superfície de resposta foram determinadas as condições ótimas de produção da protease, pH de 7,0, temperatura de 25°C e 12,5 g L-1 de farinha de pena (p/v). O padrão proteolítico da enzima tanto no extrato cru quanto na parcialmente purificada indicam que esta é uma metaloprotease, com pH e temperaturas ótimos nas faixas de 6,5 a 7,5, e 45 a 55°C, respectivamente. A atividade enzimática foi totalmente inibida por EDTA, fenantrolina, HgCl2 e CuCl2 e parcialmente inibida por ZnCl2, MnCl2 e SnCl2. A enzima foi parcialmente purificada através de cromatografia de gel filtração e troca iônica resultando num fator de purificação de 250. Um aumento gradativo do grau de hidrólise da proteína de soja foi observado à medida que se aumentou a razão enzima/substrato utilizada, assim como a redução da formação de espuma e o aumento da capacidade emulsificante de uma solução composta pelo hidrolisado de soja e óleo de soja, mesmo sob condições de alta temperatura e alta concentração de sal. Desta forma, esta protease apresenta potencial para aplicação como agente de modificação protéica de proteína de soja isolada.

Mesmo com o grande número de estudos relacionados à proteases do subtipo B e de como suas mutações podem interferir na estrutura, na resistência a inibidores e na eficiência catalítica da enzima, existe ainda uma lacuna de como as mudanças polimórficas de proteases de HIV de outros subtipos de HIV-1 interferem nesses fatores. Nesse contexto insere-se esse trabalho, que utilizou proteases de HIV-1 isoladas de pacientes brasileiros HIV-1 infectados com o subtipo F, e outros dois mutantes, sendo que um do subtipo F e outro do subtipo B para ensaios frente a seis inibidores comercialmente disponíveis: amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir e saquinavir. Nossos resultados experimentais revelam que os seis inibidores comerciais estudados são significantemente menos ativos para o subtipo F e para as mutantes quando comparados ao subtipo B. Além disso, os valores de vitalidade dessas proteases também são considerados maiores que os obtidos para a proteína selvagem do subtipo B. O acúmulo de mutações comumente detectadas e o polimorfismo natural tornam a protease selvagem do subtipo F cataliticamente suficiente para manter a viabilidade do vírus e garantir alto grau de resistência cruzada frente a todos os inibidores estudados. / Despite years of intense research around the world, HIV continues to represent considerable therapeutical challenge. In order to gain more insights into resistance of polymorphic mutations of existing HIV subtypes toward commercially available pharmaceutics, we studied inhibition of subtypes B and F HIV proteases (PRs) [native and two mutant enzymes clinically identified in Brazilian patients] by six commercial inhibitors (amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir). Our results show that all these inhibitors have significantly higher Ki values for the subtype F HIV PR (Fwt) and both mutant enzymes than that for the B subtype HIV PR (Bwt). Furthermore, the biochemical fitnesses of these proteases, or their vitalities, are also considerably higher than that of Bwt. The accumulation of commonly detected resistant mutations in HIV PRs with natural polymorphisms turns Fwt sufficiently catalytically active to guarantee the virus viability and confers it a large degree of cross resistance against all studied inhibitors.