An enzyme has been isolated from the fungus responsible for Dutch Elm Disease, Ophiostoma novo-ulmi, that stereoselectively catalyses the production of S ketoprofen from racemic ethyl ketoprofen. The enzyme has been cloned, over-expressed and mutated by Chiroscience, plc. The main aim, at the outset of this work, was to crystallise this enzyme and determine the three-dimensional crystallographic structure. A mutant form of the enzyme was purified to apparent homogeneity, by two different protocols, and subjected to numerous crystallisation trials. Trials were unsuccessful. Mass spectrometry of the purified sample revealed the presence of two protein species that differed by 832 Da. Analysis of the expression vector and N-terminal sequences of the two protein species revealed that they were both forms of the enzyme that differed by ten amino acids at the N-terminus. A further sample was supplied that contained only one form of the enzyme. This has been purified by the same two purification protocols and subjected to similar crystallisation trials. Needle like crystals have been grown. In order to collect X-ray diffraction data it has been necessary to carry out extensive crystallisation trials with the enzyme. In this respect the work developed into a study of crystallisation techniques and phenomena, which focused on uncoupling the processes of nucleation and growth and generally controlling nucleation. Crystals have been produced that diffract beyond 2.5 A and a native dataset has been collected at the Daresbury synchrotron source. Heavy atom derivatives have so far been nonisomorphous. An immobilised form of the enzyme has been produced by cross linking microcrystals with the bifunctional reagent glutaraldehyde. In this form the enzyme has increased stability towards temperature, pH and organic solvents. Amino acid sequence alignment and chemical analyses have suggested that the enzyme may belong to a superfamily of active serine hydrolases that include penicillin recognising proteins.The vanadium dependent bromoperoxidase from the macroalgae Corallina officinalis has been purified to homogeneity and crystallised. Native and derivative X-ray diffraction datasets have been collected and the structure solved by Multiple Isomorphous Replacement in collaboration with Dr M. Isupov and Dr A. Dalby. The molecule displays 23 point symmetry, which has not been observed in proteins to date. The molecule was crystallised in its dodecameric form, revealing the monomer to be a single domain a-helical protein with a four helix bundle as the main structural motif. The vanadium binding site is located at the end of this four helix bundle. The vanadium binding site of the chloroperoxidase from Cul. inaequalis is also located at the end of a four helix bundle. This illustrates that although there is limited amino acid sequence homology between the two enzymes they are structurally related. Purification

Not available / text

published_or_final_version / Medical Sciences / Master / Master of Medical Sciences

published_or_final_version / Zoology / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / Medicine / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / Zoology / Master / Master of Philosophy

Η πρωτεΐνη La περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό των ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και σύνδρομο Sjögren. Απαντάται σε μεγάλες ποσότητες μέσα στα κύτταρα, όπου υπό φυσιολογικές συνθήκες δεσμεύει τα πρόδρομα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ προστατεύοντάς τα από την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι μπορεί να δεσμεύεται σε μία πληθώρα κυτταρικών και ιικών mRNA ρυθμίζοντας τη μετάφρασή τους. Πρόσφατες έρευνες έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο της ανθρώπινης πρωτεΐνης ως RNA συνοδό (RNA chaperone) που συμβάλλει στην ορθή αναδίπλωση των μορίων RNA που δεσμεύει. Παρά το γεγονός ότι η La περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί σε μία ποικιλία ευκαρυωτικών οργανισμών. Σε όλους αυτούς τους οργανισμούς η πρωτεΐνη παρουσιάζει μία κοινή οργάνωση επικρατειών. Στο Ν-τελικό άκρο υπάρχει το εξαιρετικά συντηρημένο μοτίβο La motif, το οποίο ακολουθείται από ένα τουλάχιστον μοτίβο RNA αναγνώρισης (RRM) και ένα αρκετά μεταβλητό C-τελικό άκρο. Παρότι ο λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης έχει μελετηθεί επαρκώς, ελάχιστα είναι γνωστά για τη δομή της και τον τρόπο με τον οποίο δεσμεύεται στα φυσικά της υποστρώματα, όπως είναι τα πρόδρομα tRNA. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη τριών επιμέρους επικρατειών της πρωτεΐνης La του οργανισμού Dictyostelium discoideum, η οποία παρουσιάζει πολύ μεγάλη ομολογία και παρόμοια δομική οργάνωση με την ανθρώπινη πρωτεΐνη. Κάθε επικράτεια μελετάται ως προς τη δυνατότητα και τον τρόπο αλληλεπίδρασης με ομόλογα πρόδρομα tRNA του D. discoideum. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση των επικρατειών La motif, RRM1 και La motif-RRM1 και υπερέκφρασή τους σε βακτηριακά κύτταρα. Οι ανασυνδυασμένες επικράτειες απομονώθηκαν σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα δέσμευσης στα πρόδρομα tRNA, με Electrophoresis Mobility Shift Assay και Micro Scale Thermophoresis. Επιπλέον, με ανάλυση αποτυπώματος (footprinting) αποκαλύφθηκαν τα σημεία της αλληλεπίδρασης του κάθε τομέα επάνω στο μόριο του pre-tRNAArg. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η La χρησιμοποιεί τις διαφορετικές επικρατειές της για να αναγνωρίζει ξεχωριστά σημεία επάνω στο μόριο του pre-tRNA. Τέλος, με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR σε διάλυμα, επιβεβαιώθηκε ότι τόσο το La motif όσο και το RRM1 μπορούν να αναδιπλώνονται ανεξάρτητα σε μία διαμόρφωση που πιθανότατα διατηρούν και μέσα σε ολόκληρο το μόριο in vivo. / La is a highly abundant nuclear phosphoprotein. It was first described as an autoantigen found in the sera of patients suffering from systemic lupus erythematosus and Sjögren’s syndrome. Under normal conditions, La protein associates with the newly synthesized RNA polymerase III transcripts and protects them from exonucleases. It has also been reported that La associates with a variety of cellular and viral mRNAs and regulates their translation. Recent research has established the role of human La as an RNA chaperone that contributes to the proper folding of the associated RNA molecules. Although La was first described in human, homologs have been identified in a wide variety of eukaryotes. All these proteins share a common domain organization. The N-terminus of all known La proteins contains the highly conserved La motif. La motif is followed by a less conserved RNA Recognition motif (RRM) and a notably variable C-terminus. While the functional properties of La have been adequately investigated, information regarding the exact mode of binding and the structure remains elusive. This study focusses on the interaction between distinct domains of Dictyostelium discoideum La and homologous pre-tRNAs. La motif, RRM1 and La motif-RRM1 were cloned and overexpressed in E. coli. The recombinant domains were purified by affinity chromatography and subsequent FPLC. Each domain was assayed regarding its capacity to bind the pre-tRNA using Electrophoresis Mobility Shift Assay and Micro Scale Thermophoresis. Foot-printing analysis revealed the specific pre-tRNA recognition patterns for each domain. The results suggest that La uses its distinct domains to bind different sites of the pre-tRNA molecule. Finally, structural analysis based on solution NMR spectroscopy, confirmed the independent folding of the domains. Probably each domain preserves its tertiary structure in the wild type protein.

No description available.

No description available.

No description available.