Les souvenirs sont encodés dans le cerveau grâce aux configurations uniques de vastes réseaux neuronaux. Chaque connexion dans ces circuits est apte à être modifiée. Ces changements durables s’opèrent au niveau des synapses grâce à une synthèse de protéines de novo et génèrent ce qu’on nomme des traces mnésiques. Plusieurs preuves indiquent que, dans certaines formes de plasticité synaptique à long terme, cette synthèse a lieu dans les dendrites près des synapses activées plutôt que dans le corps cellulaire. Cependant, les mécanismes qui régulent cette traduction de protéines demeurent encore nébuleux. La phase d’initiation de la traduction est une étape limitante et hautement régulée qui, selon plusieurs chercheurs, constitue la cible principale des mécanismes de régulation de la traduction dans la plasticité synaptique à long terme. Le présent projet de recherche infirme cette hypothèse dans une certaine forme de plasticité synaptique, la dépression à long terme dépendante des récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR-LTD). À l’aide d’enregistrements électrophysiologiques de neurones hippocampiques en culture couplés à des inhibiteurs pharmacologiques, nous montrons que la régulation de la traduction implique les étapes de l’élongation et de la terminaison et non celle de l’initiation. De plus, nous démontrons grâce à des stratégies de knockdown d’expression d’ARN que la protéine de liaison d’ARNm Staufen 2 joue un rôle déterminant dans la mGluR-LTD induite en cultures. Dans leur ensemble, les résultats de la présente étude viennent appuyer un modèle de régulation de la traduction locale de protéines qui est indépendante de l’initiation. / Memories are encoded in the unique configurations of the vast neuronal networks of the brain. Each of these connections possesses the ability to be modified. Such long-lasting changes at the synapse often require the synthesis of new proteins that create what we call memory traces. Evidence suggests that the signal-induced activation of translation in some forms of synaptic plasticity occurs locally, at the activated synapses, rather than in the soma. However, the mechanisms regulating local and rapid de novo protein synthesis are poorly understood. The initiation step of translation is a highly regulated step and is believed to be the main target of control. The present research project challenges this view for a certain form of long-term synaptic plasticity, metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression (mGluR-LTD). We show, using electrophysiological recordings of dissociated hippocampal neurons in cultures coupled to pharmacological inhibitors, that translation regulation depends on elongation and termination, rather than initiation. Moreover, by exploiting RNA knockdown strategies, we demonstrate that the RNA-binding protein Staufen 2 plays a crucial role in mGluR-LTD induced in cultures. Altogether, the findings of the present study support a model of translation regulation that is downstream of initiation.

Title: Effect of protein (amino acid) ingestion on muscle protein synthesis following resistance exercise. Purpose: The main objective of this thesis is to verify the three basic factors of the amount, type and timing of protein intake based on scientific studies and literature, to provide the most objective and accurate information and procedure on the methodology of nutrition and supplementation associated with the intake of protein / amino acids after strength training and how it all affects muscle synthesis. Summery: The theoretical part of the thesis, discusses the factors affecting muscle protein synthesis, which stimulate growth and tissue regeneration, based on optimal stress response. Logically, it starts from general, i.e. the explanation of terms such as muscle tissue, the stimulation of muscle tissue and its manifestations and changes, nutrition factors and muscle stimulation, the mechanism of dietary factors (proteins/amino acids), specificity of protein/ amino acids in their application to answer the three key issues, which are summarized in the section named scientific studies, which focuses on the effect of intake of protein/ amino acids, in relationship to the efficiency of protein synthesis after strength training. The section summarizes, in detail, the questions of timing,...

Estudos em animais mostram que a desnutrição proteica intrauterina pode acarretar redistribuição do fluxo sanguíneo intraútero, podendo promover modificações permanentes na estrutura e funcionalidade de alguns órgãos, o que ocasiona modificações no metabolismo. Além disso, a desnutrição intrauterina pode afetar a secreção de hormônios que atuam no crescimento fetal, podendo conduzir à restrição do crescimento intrauterino. Esse fenômeno pode parcialmente ser explicado pela hipótese da programação fetal, na qual é sugerido que ocorra uma adaptação metabólica e fisiológica do feto a uma condição intrauterina adversa, que pode induzir o desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis na vida adulta. Neste contexto, pesquisas com suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) têm verificado a capacidade desses nutrientes promoverem a síntese proteica mesmo em condições catabólicas, por meio da ativação de uma via bioquímica intracelular intercedida pela proteína quinase Alvo da Rapamicina em Mamíferos (mTOR), a qual está envolvida no estímulo à etapa de tradução proteica. Assim, o presente trabalho avaliou o efeito da suplementação de BCAA em proles submetidas à desnutrição proteica materna. Para tanto, ratas Wistar foram acasaladas com ratos adultos de mesma raça. Uma vez constatada a gravidez, as matrizes foram distribuídas em grupos de acordo com a dieta que seria fornecida no decorrer da gestação: CON (20% proteína); VAL/ISO (5% proteína + 2% VAL + 2% ISO); AAE (5% proteína + 4% AAE); e BCAA (5% proteína + 4% BCAA). O protocolo de restrição proteica materna adotado causou redução no crescimento corporal e na massa de órgãos das proles. Embora a suplementação com VAL/ISO e AAE não tenha recuperado os efeitos mediados pela deficiência de proteína, foi constatado que a suplementação com BCAA reverteu parte do déficit observado no crescimento das proles, uma vez que foi eficaz em minimizar ou mesmo em restaurar plenamente diversos parâmetros como peso de órgãos, massa de gordura da carcaça e parâmetros indicativos do estado nutricional proteico, como as concentrações de proteína e RNA hepáticas e musculares. Estes efeitos podem parcialmente ser explicados pelo estímulo induzido pela suplementação com BCAA, na via de sinalização da mTOR, considerando que foi verificado no fígado das proles de matrizes que receberam esta suplementação, aumento na fosforilação desta proteína (P < 0,05), a qual é responsável por desencadear uma cascata de eventos biomoleculares que culminam, em última instância, no acréscimo da síntese proteica. Diante disto, torna-se relevante a realização de pesquisas que avaliem em longo prazo, os efeitos da suplementação com BCAA em proles submetidas à dieta materna restrita em proteína. / Animal studies show that intrauterine malnutrition may cause redistribution of blood flow in uterus, which may promote permanent changes in structure and function of some organs, which causes changes in metabolism. Furthermore, intrauterine malnutrition can affect the secretion of hormones that act on fetal growth and may lead to intrauterine growth restriction. This phenomenon can partly be explained by the hypothesis of fetal programming, which is suggested that occur a metabolic and physiological adaptation of the fetus to an adverse intrauterine condition, which can induce the development of chronic diseases in later life. In this context, researches with supplementation of branched chain amino acids (BCAA), especially leucine, have verified the ability of these nutrients to promote protein synthesis in catabolic conditions, through the activation of an intracellular biochemical pathway interceded by protein kinase Mammalian Target of Rapamycin (mTOR), which is involved in the stimulating of protein translation stage. Thus, this study evaluated the effect of BCAA supplementation in offspring subjected to maternal protein-restrict diet. To this, Wistar rats were mated with adult rats of the same race. Once was confirmed the pregnancy, the pregnants were distributed into groups according to the diet that would be provided during pregnancy: CON (20% protein); VAL/ISO (5% protein + 2% + 2% VAL/ISO), AAE (5% protein + 4% EAA) and BCAA (5% protein + 4% BCAA). The protocol adopted maternal protein restriction caused a reduction in body growth and weight of the offspring\'s organs. Although supplementation with VAL/ISO and AAE has not recovered the effects mediated by protein deficiency, it was found that supplementation with BCAA has reversed part of the deficit observed in the growth of the offspring, since it was effective in minimizing or even fully restoring various parameters such as organ weight, carcass fat mass and parameters indicative of nutritional protein, such as the concentrations of protein and RNA in liver and muscle. These effects may be partially explained by the stimulation induced by BCAA supplementation on the mTOR signaling pathway, considering that was verified in the liver of the offspring from dams that received this supplementation augment on the phosphorylation of this protein (P < 0,05), which is responsible for triggering a cascade of molecular events that culminate, ultimately, in increased protein synthesis. Given this, it becomes relevant to conducting research to assess long-term effects of supplementation with BCAA in offspring subjected to maternal protein-restricted diet.

Objetivou-se avaliar a utilização de ureia encapsulada de liberação Lenta nas dietas de vacas em lactação e seus efeitos sobre o consumo e digestibilidade aparente total da matéria seca e dos nutrientes, fermentação ruminal, produção microbiana ruminal, produção e composição do leite, e as concentrações de parâmetros sangüíneos. Foram utilizadas 16 vacas da raça Holandesa com produção média de 30,0 kg/dia, agrupadas em 4 quadrados latinos 4x4 balanceados e contemporâneos, recebendo as dietas experimentais: 1) Controle (CT), ração sem a inclusão de ureia; 2) Ureia pecuária (UP), com a utilização de 1,0% de UP na ração, baseada na matéria seca (MS); 3) Ureia encapsulada 1 (UE1), com a utilização de 1,0% de UE1 na ração, baseada na MS; e 4) Ureia encapsulada 2 (UE2), com a utilização de 1,0% de UE2 na ração, baseada na MS. O volumoso utilizado foi a silagem de milho, em relação de 50:50 (relação volumoso:concentrado). A produção de leite e o consumo de matéria seca foram mensurados diariamente durante todo o período experimental. As amostras utilizadas para análise da composição do leite foram coletadas no 16&ordm; dia de cada período experimental, sendo provenientes das duas ordenhas diárias. As amostras de sangue foram coletadas em tubos vacuolizados por punção da veia e/ou artéria coccígea. As amostras de líquido ruminal foram coletadas com a utilização de sonda esofágica três horas após a alimentação matinal. A digestibilidade foi determinada por meio de indicador interno FDAi. Não houve diferença para consumo de matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta, extrato etéreo, fibra em detergente neutro e nutrientes digestíveis totais. Foi observado aumento na digestibilidade da proteína bruta e nos nutrientes digestíveis totais observados nos animais submetidos às dietas contendo ureia quando comparados aos animais alimentados com a dieta controle. Não houve efeito das dietas experimentais sobre o pH e concentração de amônia ruminal. Foi observado aumento nas concentrações totais de ácidos graxos de cadeia curta e do ácido propiônico nos animais tratados com a dieta controle quando comparados aos animais alimentados com as dietas com inclusão de ureia, mas não foi observada alteração na relação acetato:propionato e na proporção molar dos ácidos graxos de cadeia curta. Também não foi observada diferença na síntese e na eficiência de síntese de proteína microbiana. Não houve diferença para o consumo de compostos nitrogenados totais, e nas excreções de compostos nitrogenados na urina, no balanço de nitrogênio e na eficiência de utilização do nitrogênio. Foi observado aumento na excreção de compostos nitrogenados no leite e nas fezes nos animais tratados com a ração controle quando comparados aos animais tratados com as dietas com ureia. Também foi observado aumento na produção de leite, e na produção de gordura e lactose nos animais tratados com a dieta controle quando comparados aos animais tratados com as dietas contendo ureia. Não houve diferença para as concentrações sanguíneas de glicose, ureia, e nitrogênio ureico. A utilização de ureia na alimentação de vacas em lactação, apesar de ter reduzido a produção de leite, não influenciou a produção de leite corrigida para 3,5% de gordura, e a sua composição. Nas condições em que os animais foram avaliados neste estudo não foi observada diferença no desempenho e metabolismo entre as vacas suplementadas com ureia, seja encapsulada ou não. / The aim was to evaluate the use of polymer-coated slow release urea (PCU) in rations for lactating cows by evaluating its effects on consumption and nutrient digestibility, ruminal fermentation, rumen microbial yield, production and milk composition, and concentrations of blood parameters. To perform this experiment were used 16 Holstein cows with average production of 30.0 kg/day, divided into four 4x4 balanced and contemporary latin squares, receiving the experimental diets: 1) Control (CT) diet without the addition of urea, 2) Feedgrade Urea (FGU), with the use of PCU 1.0% in the diet based on dry matter (DM), 3) PCU 1, with the use of PCU1 1.0% of the diet, based on DM, and 4) PCU 2 , with the use of 1.0% PCU2 in the diet, based on DM. The forage used was corn silage in a ratio of 50:50 (forage:concentrate ratio). Milk production (MP) and dry matter intake (DMI) were measured daily throughout the experimental period. The samples used to analyze the composition of milk were collected on the 16th day of each experimental period, and from the two daily milkings. Blood samples were collected in tubes vacuolated by vein puncture and/or coccygeal artery. The rumen fluid samples were collected with the use of esophageal probe three hours after the morning feeding. The digestibility was determined by means of the internal marker indigestible acid detergent fiber. There was no difference for DMI, organic matter, crude protein, ether extract, neutral detergent fiber and total digestible nutrients. There was a increase in the digestibility of crude protein and total digestible nutrients in animals treated with urea diets compared to animals fed the control diet. There was no effect on pH and ruminal ammonia. An increase in concentrations of total short-chain fatty acid and propionic acid was observed in animals treated with the control diet compared to animals fed diets with inclusion of urea. There was no change in acetate: propionate ratio and the molar ratio of short-chain fatty acids. There was no difference in the synthesis and efficiency of synthesis of microbial proteins. There was no difference in consumption of total nitrogen compounds, and nitrogen compounds excretion in urine, nitrogen balance and nitrogen use efficiency. There was an increase in the excretion of nitrogenous compounds in milk and feces in animals treated with the control diet compared to animals treated with urea rations. Was observed an increase in milk production and total fat and lactose production in animals treated with the control diets compared to animals treated with urea rations. There was no difference in blood concentrations of glucose, urea and urea nitrogen. The use of urea in the feeding of dairy cows, despite the lower milk production, did not influenced fat corrected milk yield (3,5%) and its composition. Under conditions in which animals were evaluated in this study there was no difference in performance and metabolism between cows supplemented with urea, polymer-coated slow release or not.

Estudos sugerem que o exercício de força e a suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada apresentam potencial anabólico e anti-proteolítico, exercendo de forma sinérgica efeitos positivos sobre o remodelamento muscular. Diante disso, esse estudo teve como objetivo comparar os efeitos da suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e leucina isolada sobre as vias de síntese proteica muscular após uma sessão de exercício de força. Foi conduzido um estudo transversal, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. Dezoito sujeitos do gênero masculino, sedentários e com idade entre 18-30 anos foram divididos em três grupos experimentais: BCAA (BCAA: 3,3 g leucina + 2,4 g de isoleucina + 2,4 g de valina), leucina (LEU: 3,2 g de leucina + 4,8 g de alanina) e placebo (PLA: 8 g de alanina). Os grupos foram submetidos a uma sessão exercício de força (extensão de joelho) composta por 8 séries de 8-10 repetições (85% de 1RM ) com 2 minutos de intervalo entre as séries e receberam intervenção nutricional imediatamente após o término da sessão. Imediatamente antes, imediatamente após, 30, 60, 90 e 120 minutos após o término da sessão os voluntários realizaram coletas de sangue. Os voluntários foram submetidos a biópsias musculares para análises de expressão proteica proteica (p-p70S6KThr389, p-4E-BP1Thr37/46, p-peIF4E Ser209) no período basal (pré), 1 e 2 horas após o término da sessão de exercício. As amostras de sangue foram utilizadas para medir os níveis plasmáticos de insulina, glicose, perfil lipídico e citocinas (TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-10). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para o perfil lipídico e os níveis plasmáticos de glicemia. A concentração plasmática de insulina aumentou significativamente nos grupos BCAA e LEU 60 minutos após a ingestão em comparação ao PLA. Para os valores de citocinas musculares, foi encontrada diferença significativa entre BCAA e Estudos sugerem que o exercício de força e a suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada apresentam potencial anabólico e anti-proteolítico, exercendo de forma sinérgica efeitos positivos sobre o remodelamento muscular. Diante disso, esse estudo teve como objetivo comparar os efeitos da suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e leucina isolada sobre as vias de síntese proteica muscular após uma sessão de exercício de força. Foi conduzido um estudo transversal, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. Dezoito sujeitos do gênero masculino, sedentários e com idade entre 18-30 anos foram divididos em três grupos experimentais: BCAA (BCAA: 3,3 g leucina + 2,4 g de isoleucina + 2,4 g de valina), leucina (LEU: 3,2 g de leucina + 4,8 g de alanina) e placebo (PLA: 8 g de alanina). Os grupos foram submetidos a uma sessão exercício de força (extensão de joelho) composta por 8 séries de 8-10 repetições (85% de 1RM ) com 2 minutos de intervalo entre as séries e receberam intervenção nutricional imediatamente após o término da sessão. Imediatamente antes, imediatamente após, 30, 60, 90 e 120 minutos após o término da sessão os voluntários realizaram coletas de sangue. Os voluntários foram submetidos a biópsias musculares para análises de expressão proteica proteica (p-p70S6KThr389, p-4E-BP1Thr37/46, p-peIF4E Ser209) no período basal (pré), 1 e 2 horas após o término da sessão de exercício. As amostras de sangue foram utilizadas para medir os níveis plasmáticos de insulina, glicose, perfil lipídico e citocinas (TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-10). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para o perfil lipídico e os níveis plasmáticos de glicemia. A concentração plasmática de insulina aumentou significativamente nos grupos BCAA e LEU 60 minutos após a ingestão em comparação ao PLA. Para os valores de citocinas musculares, foi encontrada diferença significativa entre BCAA e Estudos sugerem que o exercício de força e a suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada apresentam potencial anabólico e anti-proteolítico, exercendo de forma sinérgica efeitos positivos sobre o remodelamento muscular. Diante disso, esse estudo teve como objetivo comparar os efeitos da suplementação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e leucina isolada sobre as vias de síntese proteica muscular após uma sessão de exercício de força. Foi conduzido um estudo transversal, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. Dezoito sujeitos do gênero masculino, sedentários e com idade entre 18-30 anos foram divididos em três grupos experimentais: BCAA (BCAA: 3,3 g leucina + 2,4 g de isoleucina + 2,4 g de valina), leucina (LEU: 3,2 g de leucina + 4,8 g de alanina) e placebo (PLA: 8 g de alanina). Os grupos foram submetidos a uma sessão exercício de força (extensão de joelho) composta por 8 séries de 8-10 repetições (85% de 1RM ) com 2 minutos de intervalo entre as séries e receberam intervenção nutricional imediatamente após o término da sessão. Imediatamente antes, imediatamente após, 30, 60, 90 e 120 minutos após o término da sessão os voluntários realizaram coletas de sangue. Os voluntários foram submetidos a biópsias musculares para análises de expressão proteica proteica (p-p70S6KThr389, p-4E-BP1Thr37/46, p-peIF4E Ser209) no período basal (pré), 1 e 2 horas após o término da sessão de exercício. As amostras de sangue foram utilizadas para medir os níveis plasmáticos de insulina, glicose, perfil lipídico e citocinas (TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-10). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para o perfil lipídico e os níveis plasmáticos de glicemia. A concentração plasmática de insulina aumentou significativamente nos grupos BCAA e LEU 60 minutos após a ingestão em comparação ao PLA. Para os valores de citocinas musculares, foi encontrada diferença significativa entre BCAA e LEU comparado ao PLA para a concentração de IL-10 entre o momento 60 e 120 minutos após. Nesse mesmo período de tempo, também foi encontrada diferença significativa entre LEU e BCAA para a concentração de IL-1. Para os valores de citocinas plasmáticas, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos em todos momentos analisados. A suplementação de BCAA e LEU aumentou significativamente a expressão p-4E-BP1Thr37/46 120 minutos após comparado ao PLA no mesmo tempo. A expressão de p-p70S6kThr389 foi significativamente aumentada nos grupos BCAA e LEU 60 e 120 minutos após quando comparado com o PLA no mesmo tempo. A expressão de p-eIF4ESer209 encontrou-se significativamente aumentada após 60 minutos apenas no grupo LEU quando comparado ao PLA. Porém, 120 minutos após encontrou-se significativamente elevada em ambos grupos comparado ao PLA. Por meio dos resultados, podemos concluir que a suplementação de BCAA e leucina associadas ao exercício de força possuem efeitos semelhantes sobre o balanço inflamatório e sobre as vias de sinalização de síntese proteica muscular aumentando a fosforilação de efetores da cascata de sinalização da via Akt/mTOR / Studies suggest that resistance exercise and branched chain amino acids supplementation have potential anabolic and anti-proteolytic, synergistically exerting positive effects on muscle remodeling. Therefore, this study aimed to compare the effects of branched chain amino acids (BCAA) and leucine isolated supplementation on muscle remodeling pathways after a resistance exercise. A cross-sectional, a randomized, double-blind, placebo-controlled trial was conducted. Eighteen male sedentary subjects were aged 18-30 years were divided into three experimental groups: BCAA (BCAA: leucine + 3.3 g 2.4 g 2.4 g isoleucine + valine), leucine (LEU : 3.2 g of leucine + alanine 4.8 g) and placebo (PLA: 8 g of alanine). Both groups underwent a session of resistance exercise (knee extension) that consists of 8 sets of 8-10 repetitions (85% of 1RM) with 2 minutes rest between sets and received nutritional intervention immediately after the session. Immediately before, immediately after, 30, 60, 90 and 120 minutes after the end of the session the blood samples were assessed. Muscle biopsies were collected for analysis of protein expression (p-p70S6KThr389, p-4E-BP1Thr37/46, p-peIF4ESer209, MAFbx and MURF-1) at baseline (pre), 1 and 2 hours after end of the exercise session. The blood samples were used to measure serum levels of insulin, glucose, lipid and cytokine (TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 and IL-10). No significant differences between groups were observed for the lipid profile and plasma glucose. The plasma insulin increased significantly in the groups BCAA and leucine 60 minutes after ingestion compared to PLA. For values of muscular cytokines, significant difference was found between BCAA and LEU compared to PLA for the concentration of IL-10 between the time 60 and 120 minutes after. In that same time period, also found significant differences between LEU and BCAA for the concentration of IL-1. For values of plasma cytokines, no significant differences between groups were observed at all time points analyzed. BCAA and LEU supplementation significantly increased the expression of p-4E-BP1Thr37/46 120 minutes after the resistance exercise compared to PLA at the same time point. The expression of p-p70S6KThr389 was significantly increased in BCAA and LEU groups 60 and 120 minutes after resistance exercise compared to PLA at the same time point. The expression of p-peIF4ESer209 p70S6KThr389 was significantly increased after 60 minutes only on LEU group compared to PLA at the same time point. However, 120 minutes after the expression was significantly elevated in both groups compared to PLA. Through the results, we can conclude that the BCAA and leucine supplementation associated with strength exercise have similar effects on the balance of inflammatory and signaling pathways of muscle protein synthesis by increasing the phosphorylation of effectors of the signaling cascade of Akt / mTOR

Les protéines SREBP-1 sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle dans la régulation du métabolisme lipidique. Plus récemment des études faites in vitro (myotubes humains en culture primaire) et in vivo (muscle tibial de souris) ont montré que la surexpression de SREBP-1a ou SREBP-1c induit une atrophie musculaire et bloque la différenciation musculaire, en inhibant notamment l’expression des protéines structurales du muscle squelettique et des facteurs de la différenciation musculaire (MRFs). Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont eu pour but de décrypter le mécanisme de l’atrophie induite par SREBP-1 et de déterminer comment les protéines SIRT1 pourraient réguler ce facteur de transcription. L’atrophie musculaire résulte d’un déséquilibre entre la quantité de protéines synthétisées et dégradées. Dans nos études, nous montrons que SREBP-1 régule la synthèse protéique et la dégradation protéique, respectivement via le contrôle négatif de l’expression des MRFs et via le contrôle de l’expression des atrogènes, MuRF1 et Atrogin-1. Dans le muscle squelettique, nous démontrons que la désacétylase SIRT1 régule l’activité transcriptionnelle de SREBP-1. Les protéines SREBP-1 et SIRT1 étant toutes deux impliquées dans la régulation du métabolisme lipidique, nous mettons en évidence une nouvelle voie de signalisation reliant le métabolisme énergétique et nutritionnel avec l’activité transcriptionnelle de SREBP-1 dans le muscle. Étant donné le rôle de SIRT1 et SREBP-1 dans le métabolisme lipidique et musculaire, nous nous sommes intéressés au rôle des phospholipides et plus particulièrement des céramides dans la régulation de la masse musculaire.Nos études montrent que la régulation de la quantité de céramides par la cytokine TNFα régule la masse musculaire. Ainsi, nos travaux mettent en évidence de nouveaux liens entre le métabolisme lipidique et la régulation de la masse et du métabolisme musculaire. / SREBP-1 transcription factors are involved in lipid metabolism regulation. Recently, in vitro and in vivo studies have shown that SREBP-1a or SREBP-1c overexpression induce muscular atrophy and block muscular differentiation, notably by inhibiting structural proteins and Myogenics Regulatory Factors (MRFs) expression. The aims of this work are the mecanism determination of the muscular atrophy induced by SREBP-1 overexpression and the elucidation of the role of SIRT1 proteins on SREBP-1 regulation.The muscular atrophy results from an imbalance between the amount of synthesized and degraded proteins. In our studies, we shown that SREBP-1 regulates protein synthesis and protein degradation, respectively via a negative control of MRFs expression and via a control of atrogenes expression, MuRF1 and Atrogin-1. In skeletal muscle, we shown that SIRT1 desacetylase enzyme regulates SREBP-1 transcription activity. Because of SREBP-1 and SIRT1 proteins involvement in lipid metabolism regulation, our results suggest a new signalisation pathway linking energetic metabolism and SREBP-1 transcriptionnal activity in muscle. As SIRT1 and SREBP-1 have a role on lipid and muscular metabolism, we took an interest in phospholipids involvement and more specifically in ceramides involvement in muscle mass regulation. Our studies shown that the regulation of the amount of ceramids by the TNFα regulates muscle mass. Thus, our work allows to identify new links between lipid metabolism and muscle mass and metabolism regulation.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do teor de proteína bruta (PB) e da fonte nitrogenada da dieta para vacas lactantes, utilizando cana-de-açúcar como volumoso sobre a síntese de proteína microbiana, composição da fração nitrogenada do leite, balanço nitrogenado e parâmetros metabólicos sangüíneos. Foram utilizadas 12 vacas Holandesas com média de 235 dias em lactação, agrupadas em três quadrados latinos contemporâneos 4x4, com período experimental de 21 dias, sendo 14 para adaptação as dietas e os 7 últimos para coletas. Os animais foram alimentados com rações isoenergéticas (1,29 Mcal/Kg de MS), com duas fontes nitrogenadas principais (farelo de soja e uréia) e dois teores de PB (14,5 e 16,0 %) na ração: A) 14,21% de PB e farelo de soja (FS) como fonte nitrogenada principal, com 65% de PDR, B) 15,57% de PB e FS, com 65% PDR, C) 14,23% de PB e Ureia, com 70% de PDR, D) 15,62% de PB e Uréia, com 70% PDR. Para a determinação da contagem de células somáticas e de nitrogênio ureico no leite (NUL) foram coletadas amostras de leite do 14&ordm; ao 18&ordm; dia de cada período. Para a determinação dos teores de proteína bruta, nitrogênio não protéico, nitrogênio não caseinoso, proteína verdadeira, caseína e proteína do soro do leite, foram coletadas amostras de leite do 18&ordm; ao 21&ordm; dia de cada período. Para a determinação da síntese de proteína microbiana foram coletadas amostras de leite e amostras spot de urina no 15&ordm; dia de cada período. A coleta de sangue foi realizada no 16&ordm; dia de cada período. Houve interação entre fonte nitrogenada e teor de PB da dieta sobre o NUL (mg/dL) e tendência de interação entre fonte nitrogenada e teor de PB da dieta sobre a excreção total de urina (L/dia) (P = 0,052) e proteína verdadeira do leite do leite (%) (P = 0,06). A excreção total de urina (L/dia), o NUL e a uréia no soro foram maiores para as dietas com 16% de PB, independentemente da fonte nitrogenada. As dietas com uréia como fonte nitrogenada principal apresentaram maior concentração de albumina sangüínea (g/L). Houve maior eficiência nitrogenada para as dietas com 14,5% de PB. / The aim of this study was to evaluate effects of crude protein (CP) content and dietary nitrogen source for lactating cows using cane sugar as forage on microbial protein synthesis, composition of milk nitrogen fraction, nitrogen balance and blood parameters. Twelve Holstein cows (235 days in milk) were allocated in three Latin squares balanced 4x4, with a trial period of 21 days where 14 days were for diet adaptation and the last seven for sample collection. The animals receive isocaloric diets (1.29 Mcal / kg DM), with two major nitrogen sources (soybean meal and urea) and two crude protein levels (14.5 and 16.0%): A) 14.21% CP, soybean meal (SBM) as the main nitrogen source, with 65% PDR, B) 15.57% CP as SBM and 65% PDR, C) 14.23% CP and urea as the main nitrogen source, with 70% PDR, D) 15.62% CP as urea and 70% PDR. To determine the somatic cell count and milk urea nitrogen, milk samples were collected from day 14th to 18th of each period. To determine crude protein, non-protein nitrogen, non-casein nitrogen, true protein, casein and whey protein, milk samples were collected from day18th to 21st of each period. To determine microbial protein synthesis milk and spot urine samples were collected at day 15th of each period. Blood collection was performed on the 16th day of each period. There was interaction between nitrogen source and diet protein content on milk urea nitrogen (MUN), and interaction tendency on urine excretion (L/day) (P = 0.052) and milk true protein (%) (P =0.06). Total urine excretion (liters/day), MUN and urea in blood serum were higher for diets with 16% CP, regardless of nitrogen source. Diets with urea as main nitrogen source had higher concentration of blood albumin (g/L). There was higher nitrogen efficiency for diets with 14.5% CP.

Objetivou-se avaliar a utilização de ureia encapsulada de liberação Lenta nas dietas de vacas em lactação e seus efeitos sobre o consumo e digestibilidade aparente total da matéria seca e dos nutrientes, fermentação ruminal, produção microbiana ruminal, produção e composição do leite, e as concentrações de parâmetros sangüíneos. Foram utilizadas 16 vacas da raça Holandesa com produção média de 30,0 kg/dia, agrupadas em 4 quadrados latinos 4x4 balanceados e contemporâneos, recebendo as dietas experimentais: 1) Controle (CT), ração sem a inclusão de ureia; 2) Ureia pecuária (UP), com a utilização de 1,0% de UP na ração, baseada na matéria seca (MS); 3) Ureia encapsulada 1 (UE1), com a utilização de 1,0% de UE1 na ração, baseada na MS; e 4) Ureia encapsulada 2 (UE2), com a utilização de 1,0% de UE2 na ração, baseada na MS. O volumoso utilizado foi a silagem de milho, em relação de 50:50 (relação volumoso:concentrado). A produção de leite e o consumo de matéria seca foram mensurados diariamente durante todo o período experimental. As amostras utilizadas para análise da composição do leite foram coletadas no 16&ordm; dia de cada período experimental, sendo provenientes das duas ordenhas diárias. As amostras de sangue foram coletadas em tubos vacuolizados por punção da veia e/ou artéria coccígea. As amostras de líquido ruminal foram coletadas com a utilização de sonda esofágica três horas após a alimentação matinal. A digestibilidade foi determinada por meio de indicador interno FDAi. Não houve diferença para consumo de matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta, extrato etéreo, fibra em detergente neutro e nutrientes digestíveis totais. Foi observado aumento na digestibilidade da proteína bruta e nos nutrientes digestíveis totais observados nos animais submetidos às dietas contendo ureia quando comparados aos animais alimentados com a dieta controle. Não houve efeito das dietas experimentais sobre o pH e concentração de amônia ruminal. Foi observado aumento nas concentrações totais de ácidos graxos de cadeia curta e do ácido propiônico nos animais tratados com a dieta controle quando comparados aos animais alimentados com as dietas com inclusão de ureia, mas não foi observada alteração na relação acetato:propionato e na proporção molar dos ácidos graxos de cadeia curta. Também não foi observada diferença na síntese e na eficiência de síntese de proteína microbiana. Não houve diferença para o consumo de compostos nitrogenados totais, e nas excreções de compostos nitrogenados na urina, no balanço de nitrogênio e na eficiência de utilização do nitrogênio. Foi observado aumento na excreção de compostos nitrogenados no leite e nas fezes nos animais tratados com a ração controle quando comparados aos animais tratados com as dietas com ureia. Também foi observado aumento na produção de leite, e na produção de gordura e lactose nos animais tratados com a dieta controle quando comparados aos animais tratados com as dietas contendo ureia. Não houve diferença para as concentrações sanguíneas de glicose, ureia, e nitrogênio ureico. A utilização de ureia na alimentação de vacas em lactação, apesar de ter reduzido a produção de leite, não influenciou a produção de leite corrigida para 3,5% de gordura, e a sua composição. Nas condições em que os animais foram avaliados neste estudo não foi observada diferença no desempenho e metabolismo entre as vacas suplementadas com ureia, seja encapsulada ou não. / The aim was to evaluate the use of polymer-coated slow release urea (PCU) in rations for lactating cows by evaluating its effects on consumption and nutrient digestibility, ruminal fermentation, rumen microbial yield, production and milk composition, and concentrations of blood parameters. To perform this experiment were used 16 Holstein cows with average production of 30.0 kg/day, divided into four 4x4 balanced and contemporary latin squares, receiving the experimental diets: 1) Control (CT) diet without the addition of urea, 2) Feedgrade Urea (FGU), with the use of PCU 1.0% in the diet based on dry matter (DM), 3) PCU 1, with the use of PCU1 1.0% of the diet, based on DM, and 4) PCU 2 , with the use of 1.0% PCU2 in the diet, based on DM. The forage used was corn silage in a ratio of 50:50 (forage:concentrate ratio). Milk production (MP) and dry matter intake (DMI) were measured daily throughout the experimental period. The samples used to analyze the composition of milk were collected on the 16th day of each experimental period, and from the two daily milkings. Blood samples were collected in tubes vacuolated by vein puncture and/or coccygeal artery. The rumen fluid samples were collected with the use of esophageal probe three hours after the morning feeding. The digestibility was determined by means of the internal marker indigestible acid detergent fiber. There was no difference for DMI, organic matter, crude protein, ether extract, neutral detergent fiber and total digestible nutrients. There was a increase in the digestibility of crude protein and total digestible nutrients in animals treated with urea diets compared to animals fed the control diet. There was no effect on pH and ruminal ammonia. An increase in concentrations of total short-chain fatty acid and propionic acid was observed in animals treated with the control diet compared to animals fed diets with inclusion of urea. There was no change in acetate: propionate ratio and the molar ratio of short-chain fatty acids. There was no difference in the synthesis and efficiency of synthesis of microbial proteins. There was no difference in consumption of total nitrogen compounds, and nitrogen compounds excretion in urine, nitrogen balance and nitrogen use efficiency. There was an increase in the excretion of nitrogenous compounds in milk and feces in animals treated with the control diet compared to animals treated with urea rations. Was observed an increase in milk production and total fat and lactose production in animals treated with the control diets compared to animals treated with urea rations. There was no difference in blood concentrations of glucose, urea and urea nitrogen. The use of urea in the feeding of dairy cows, despite the lower milk production, did not influenced fat corrected milk yield (3,5%) and its composition. Under conditions in which animals were evaluated in this study there was no difference in performance and metabolism between cows supplemented with urea, polymer-coated slow release or not.

Cell-free protein synthesis (CFPS) is a powerful protein expression platform where protein synthesis machinery is borrowed from living organisms. Target proteins are synthesized in a reaction tube together with cell extract, amino acids, energy source, and DNA. This reaction is versatile, and dynamic optimizations of the reaction conditions can be performed. The "œopen" nature of CFPS makes it a compelling candidate for many technologies and applications. This dissertation reports new and innovative applications of CFPS including 1) enzyme encapsulation in a virus-like particle, 2) detection of endocrine disrupting chemicals in the presence of blood and urine, and 3) expression of a multi-disulfide bond therapeutic protein. Two major limitations of enzymes are their instability and recycling difficulty. To overcome these limitations, we report the first enzyme encapsulation in the CFPS by immobilizing in a virus-like particle using an RNA aptamer. This technique allows simple and fast enzyme production and encapsulation We demonstrate, for the first time, the Rapid Adaptable Portable In vitro Detection biosensor platform (RAPID) for detecting endocrine disrupting chemicals (EDCs) in human blood and urine samples. Current living cell-based assays can take a week to detect EDCs, but RAPID requires only 2 hours. It utilizes the versatile nature of CFPS for biosensor protein complex production and EDC detection. Biotherapeutic protein expression in E. coli suffers from inclusion body formation, insolubility, and mis-folding. Since CFPS is not restricted by a cell wall, dynamic optimization can take place during the protein synthesis process. We report the first expression of full-length tissue plasminogen activator (tPA) using CFPS. These research works demonstrate the powerful and versatile nature of the CFPS.

Cell-free protein synthesis is an emerging technology that has many applications. The open nature of this system makes it a compelling technology that can be manipulated to answer many needs that are unavailable in other systems. This dissertation reports on engineering this technology for: 1) sense codon emancipation for incorporation of multiple unnatural amino acids; 2) expressing a hard-to-express anticancer biotherapeutic and introducing a just-add-water system; 3) a biosensing ligand that interacts with nuclear hormone receptors. Emancipating sense codons toward a minimized genetic code is of significant interest to science and engineering. A promising approach to sense codon emancipation is the targeted in vitro removal of native tRNA. Here we introduce a new in-vitro or "cell-free" approach to emancipate sense codons via efficient and affordable degradation of endogenous tRNA using RNase-coated superparamagnetic beads. The presented method removes greater than 99% of tRNA in cell lysates, while preserving cell-free protein synthesis activity. The resulting tRNA-depleted lysate is compatible with in vitro-transcribed synthetic tRNA for the production of peptides and proteins. Biotherapeutics have many promising applications, such as anti-cancer treatments, immune suppression, and vaccines. However, due to their biological nature, some biotherapeutics can be challenging to rapidly express and screen for activity through traditional recombinant methods. In this work, we demonstrate the use of cell-free systems for the expression and direct screening of the difficult-to-express cytotoxic protein onconase. Using cell-free systems, onconase can be rapidly expressed in soluble, active form. Furthermore, the open nature of the reaction environment allows for direct and immediate downstream characterization without the need of purification. Also, we report the ability of a "just-add-water" lyophilized cell-fee system to produce onconase. Here we introduce a Rapid Adaptable Portable In-vitro Detection biosensor platform (RAPID) for detecting ligands that interact with nuclear hormone receptors (NHRs). The biosensor is based on an engineered, allosterically-activated fusion protein, which contains the ligand binding domain from a target NHR. The presented RAPID biosensor platform is significantly faster and less labor intensive than commonly available technologies, making it a promising tool for detecting environmental EDC contamination and screening potential NHR-targeted pharmaceuticals.