Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-12-14T16:15:48Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Evelyn de Oliveira - 2016.pdf: 6056199 bytes, checksum: af631b615e5b34b3435e2b9dbad44431 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-12-14T16:33:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Evelyn de Oliveira - 2016.pdf: 6056199 bytes, checksum: af631b615e5b34b3435e2b9dbad44431 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-14T16:33:34Z (GMT). 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Therefore, we used 12 clinically healthy captive animals. The samples were collected from the jugular vein into appropriate blood tubes. The blood analysis was carried out immediately after colletion and in others two different times to check the storage effects (M0 - immediate analysis, M2 - 24 hours after collection, M3 - 48 hours post-collection). Biochemical analysis was performed a week after the harvest. Electrophoresis was carried out in agarose gel support. The mean and standard deviation of haematological variables of samples processed soon after harvest were: RBC (2.07 x 106/uL ± 0.40); packed cell volume (38.08 % ± 5.93); hemoglobin (11.33 g/dL ± 2.15); VCM (186.52 fL ± 21.72); MCHC (29.68 g/dL ± 2.56); MCH (55.08 pcg ± 5.94); total leukocytes (8142/uL ± 2,441); neutrophils (5913/uL ± 2168); lymphocytes (1460/uL ± 740); eosinophils (522/uL ± 385); monocytes (247/uL ± 176); platelets (123.458/uL ± 31.362) and total plasma proteins (6.23 g/dL ± 0.49). The mean and standard deviation corresponding to biochemical analysis was: albumin (3.29 g/dL ± 0.33); ALT (15.49 IU/L ± 7.98); amylase (1037.92 IU/L ± 149.04); AST (21.12 IU/L ± 7.50); total cholesterol (62.79 mg/dL ± 20.08); HDL cholesterol (14.73 mg/dL ± 4.98); LDL cholesterol (26.60 mg/dL ± 11.05); VLDL cholesterol (2.14 mg/dL ± 1.06); CK (111.61 IU/L ± 70.16); creatinine (1.05 mg/dL ± 0.37); iron (194.64 µg/dL ± 81.17); GGT (65.18 IU/L ± 54.57); glucose (103.71 mg/dL ± 29.63); globulins (2.76 g/dl ± 0.36); lipase (28.80 IU/L ± 5.11); PST (6.05 g/dL ± 0.56); triglycerides (10.71 mg/dL ± 5.29); urea (53.46 mg/dL ± 18.28). The results of the electrophoresis led to six protein bands which are classified as albumin (2.60 g/dL ± 0.33), alpha-1 (0.33 g/dL ± 0.07), alpha-2 (0, 50 g/dL ± 0.17), beta 1 (0.62 g/dL ± 0.17), beta 2 (1.50 g/dL ± 0.25) and gamma (1.88 g/dL ± 0.30). Therefore, we conclude that there are physiological changes in hematological and biochemical parameters of giant anteaters from different biomes. In these animals the electrophoretic pattern of the technique in agarose gel are six protein bands and the percentage of albumin is greater than the other fractions. This suggests that extrinsic factors such as climate, nutrition and management can affect these variables. Therefore, the results presented in this work can be used as laboratory parameters of healthiness in cerrado captive giant anteaters. / O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla), mamífero silvestre pertencente à superordem dos Xenarthras, é originário das Américas Central e do Sul. Atualmente, está classificado como espécie vulnerável, devido principalmente ao desmatamento, queimadas e atropelamento. A ausência de valores de referência para exames laboratoriais dificulta a avaliação desses animais, especialmente devido ao aumento na casuística de atendimento dessa espécie em instituições veterinárias. Dada à importância de tais dados, objetivou-se com este estudo estabelecer parâmetros hematológicos, bioquímicos e eletroforéticos para tamanduás-bandeiras de cativeiro do cerrado, bem como, saber quais os efeitos de estocagem nas amostras hematológicas nessa espécie em duas concentrações distintas de anticoagulante. Para isso, foram utilizados 12 animais de cativeiro clinicamente saudáveis. O sangue foi colhido da jugular e armazenado em tubos apropriados para cada tipo de exame. Os hemogramas foram realizados logo após as colheitas e em outros dois diferentes momentos para verificação dos efeitos de estocagem (M0 – análise imediata, M2 – 24 horas pós-colheita, M3 – 48 horas pós-colheita). As análises bioquímicas foram executadas uma semana após as colheitas. A eletroforese foi feita no suporte de gel de agarose. A média e o desvio padrão das variáveis hematológicas das amostras processadas logo após a colheita foram: hemácias (2,07 x106/µL ± 0,40); volume globular (38,08 % ± 5,93); hemoglobina (11,33 g/dL ± 2,15); VCM (186,52 fL ± 21,72); CHCM (29,68 g/dL ± 2,56); HCM (55,08 pcg ± 5,94); leucócitos totais (8.142/µL ± 2.441); neutrófilos (5.913/µL ± 2.168); linfócitos (1.460/µL ± 740); eosinófilos (522/µL ± 385); monócitos (247/µL ± 176); plaquetas (123.458/µL ± 31.362) e proteínas plasmáticas totais (6,23 g/dL ± 0,49). As médias e o desvio padrão correspondentes às análises bioquímicas foram: albumina (3,29 g/dL ± 0,33); ALT (15,49 UI/L ± 7,98); amilase (1037,92 UI/L ± 149,04); AST (21,12 UI/L ± 7,50); colesterol total (62,79 mg/dL ± 20,08); colesterol HDL (14,73 mg/dL ± 4,98); colesterol LDL (26,60 mg/dL ± 11,05); colesterol VLDL (2,14 mg/dL ± 1,06); CK (111,61 UI/L ± 70,16); creatinina (1,05 mg/dL ± 0,37); ferro (194,64 µg/dL ± 81,17); GGT (65,18 UI/L ± 54,57); glicose (103,71 mg/dL ± 29,63); globulinas (2,76 g/dL ± 0,36); lipase (28,80 UI/L ± 5,11); PST (6,05 g/dL ± 0,56); triglicerídeos (10,71 mg/dL ± 5,29); ureia (53,46 mg/dL ± 18,28). Os resultados da eletroforese permitiram o fracionamento de seis bandas proteicas, classificadas como albumina (2,60 g/dL ± 0,33), alfa-1 (0,33 g/dL ± 0,07), alfa-2 (0,50 g/dL ± 0,17), beta-1 (0,62 g/dL ± 0,17), beta-2 (1,50 g/dL ± 0,25) e gama (1,88 g/dL ± 0,30). Portanto, é possível concluir que existem variações fisiológicas dos parâmetros hematológicos e bioquímicos tamanduás-bandeiras de biomas diferentes. Nestes animais, o padrão eletroforético em gel de agarose são seis bandas proteicas e a porcentagem de albumina é a maior delas. Este fato sugere que fatores extrínsecos como o clima, a nutrição e o manejo possam interferir nessas variáveis. Por isso, propor valores de referências obtidos de espécies análogas é necessário. Os resultados apresentados pelo presente trabalho podem ser utilizados como parâmetros laboratoriais de higidez em tamanduás-bandeiras de cativeiro do cerrado

Idealizou-se o presente ensaio com o objetivo de padronizar o perfil hematológico, bioquímico, eletroforético (proteinograma sérico) e quantificação das células linfocitárias CD4, CD5, CD8 por citometria de fluxo de cães da raça Golden Retrivier normais (grupos GR) e de cães distróficos (grupos GRMD). Para tanto, considerou-se a divisão dos grupos de acordo com a idade dos animais, desde o nascimento até a idade adulta, compondo assim seis grupos, sendo eles GR I, II, III e GRMD I, II, III. No presente projeto realizamos os estudos eletroforéticos de cães pertencentes a todos os grupos, estudos hematológicos e bioquímicos dos cães pertencentes aos grupos GR II, III, GRMD II e III, imunofenotipagem linfocitária dos grupos GR III e GRMD III. Os resultados eritroleucométricos e trombométricos obtidos para os cães pertencentes aos grupos GR II e GR III apresentaram valores médios dentro normalidade. Com relação aos cães pertencentes aos grupos GRMD III, observamos que o eritrograma se encontra dentro dos valores de referência. Contudo, considerando o leucograma, os valores médios (3,79/ mm3) referentes à mensuração de basófilos apresentaram-se acima dos valores de normalidade, variando de 0 a 159/mm3. Ademais, considerando os valores máximos, alguns animais pertencentes ao grupo em questão, apresentaram leucocitose com neutrofilia sem desvio à esquerda, além de trombocitose, monocitose e linfopenia, no momento das coletas. As dosagens bioquímicas séricas de todos os cães afetados apresentaram valores médios acima dos valores de normalidade para a dosagem de AST, ALT e CK. Para o estudo das proteínas séricas, a técnica SDS-PAGE permitiu o fracionamento de vinte e três proteínas, cujos pesos moleculares variaram de 16.000 a 260.000 daltons em todos os grupos estudados. Destas, foi possível identificar nominalmente doze frações protéicas: IgA (PM 142.000 Da), proteína C-reativa (PM122.000 Da), ceruloplasmina (PM 110.000 Da), fosforilase (PM 95.000 Da), transferrina (PM 82.000 Da), hemopexina (PM 78.000 Da), albumina (PM 66.000 Da), alfa1 antitripsina (PM 62.000 Da), IgG de cadeia pesada (PM 55.000 Da), haptoglobina (PM 45.000 Da), glicoproteína ácida (PM 40.000 Da) e IgG de cadeia leve (PM 23.000 Da). As demais proteínas foram identificadas pelos respectivos pesos moleculares. Não foi possível identificar nominalmente as frações protéicas de pesos moleculares 260.000 Da, 230.000 Da, 180.000 Da, 165.000 Da, 158.000 Da, 91.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 28.000 Da e 16.000 Da. Dentre essas proteínas foi possível observar que a proteína de peso molecular 91.000 Da foi encontrada apenas nos grupos GR I e GRMD I não sendo identificada nos outros grupos estudados. Considerando as alterações encontradas com relação às proteínas de fase aguda, evidenciamos as respostas de fase aguda frente às lesões musculares que ocorrem progressivamente em cães distróficos, principalmente em animais distróficos jovens, podendo inferir que os mesmos apresentaram alterações protéicas perante a injúria tecidual como é relatado em vários processos inflamatórios relacionados com outras patologias. Da mesma forma, os animais afetados pela distrofia, possuem alterações imunoglobulínicas quando comparados a animais normais. Com relação a imunofenotipagem linfocitária foi confeccionado um histograma das populações de linfócitos CD4+, CD5+ e CD8+ a partir da região do gate de linfócitos. Todos os animais afetados pela distrofia apresentaram porcentagem significativamente maior com relação à população linfocitária CD4+ e CD5+ quando comparados aos cães normais. Desta forma, podemos inferir que o processo progressivo da distrofia, esta relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência de distrofina o músculo fica mais susceptível á lesões, sendo que na sua ocorrência, há liberação de citocinas que estimulam as células hepáticas a secretarem as proteínas de fase aguda e a promoverem uma co-estimulação de linfócitos T. Assim, podemos sugerir que os resultados encontrados em nosso trabalho são conseqüências da resposta inflamatória gerada pela lesão muscular. Esperamos com esse estudo, fornecer mais informações sobre a fisiopatogenia da doença, bem como promover um maior entendimento sobre a avaliação imunológica e resposta inflamatória neste modelo de estudo. Ademais, que os valores de base encontrados possam auxiliar na avaliação de possíveis reações nos testes pré-clínicos, facilitando assim, o entendimento das reações benéficas ou adversas para validar e explicar o mecanismo de ação de uma terapia celular, gênica ou mesmo medicamentosa / Devised to test this in order to standardize the hematological, biochemical, electrophoretic (Serum protein) and quantification of CD4 lymphocyte cells, CD5, CD8 by flow cytometry of Golden Retriever dogs normal (group GR) and dogs dystrophic (GRMD groups). To this end, we considered the division of groups according to age of animals, from birth to adulthood, thus composing six groups, as Gr I, II, III and GRMD I, II, III. In this project we performed electrophoretic studies of dogs belonging to all groups, haematological and biochemical studies of dogs belonging to the groups GR II, III, II and III GRMD, lymphocyte immunophenotyping in groups III and GR GRMD III. The results obtained for trombometric, erythometric and dogs belonging to the groups and GR II GR III showed mean values within normal limits. With respect to dogs belonging to groups III GRMD, we observed that the erythrocyte is within the reference values. However, considering the WBC, the mean (3.79 / mm3) relating to the measurement of basophils were above normal values, ranging from 0 to 159/mm3. Moreover, considering the maximum, some animals belonging to the group in question had leukocytosis with neutrophilia without left shift, and thrombocytosis, monocytosis and lymphopenia at the time of collection. The biochemical serum of all affected dogs had mean values above the normal range for the determination of AST, ALT and CK. For the study of proteins, SDS-PAGE technique allowed the fractionation of twenty-three proteins whose molecular weights ranged from 16,000 to 260,000 daltons in all groups. These could be identified by name twelve fractions: IgA (PM 142,000 Da), C-reactive protein (PM122.000 Da), ceruloplasmin (PM 110,000 Da), phosphorylase (95,000 Da PM), transferrin (82,000 Da PM), hemopexin (PM 78 000 Da), albumin (66,000 Da PM), alpha1 antitrypsin (PM 62,000 Da), IgG heavy chain (55,000 Da PM), haptoglobin (PM 45,000 Da), glycoprotein (PM 40,000 Da) and IgG light chain (PM 23 000 Da). The other proteins were identified by their molecular weights. We could not identify by name the protein fractions of molecular weight 260,000 Da, 230,000 Da, 180,000 Da, 165,000 Da, 158,000 Da, 91,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 28,000 Da and 16,000 Da. Among these proteins was observed that the protein molecular weight of 91,000 Da was found only in groups GR I and GRMD I was not identified in other groups. Considering the changes found with relation to acute phase proteins, we noted the acute phase response in the face of muscle injuries that occur gradually in dystrophic dogs, especially in young dystrophic animals, which may infer that they had abnormal protein before tissue injury as reported in many inflammatory-related pathologies. Likewise, animals affected by muscular dystrophy, alterations immunoglobulin when compared to normal animals. With respect to lymphocyte immunophenotyping was made a histogram of the populations of CD4, CD5 and CD8 from the region of the gate of lymphocytes. All animals affected by muscular dystrophy showed significantly higher percentage with respect to CD4 and CD5 lymphocyte population compared to normal dogs. Thus, we can infer that the process of progressive muscular dystrophy, is associated with changes in cell populations that make up the immune system of patients, because due to the absence of dystrophin, the muscle is more susceptible to damage, and its occurrence , a release of cytokines that stimulate liver cells to secrete acute phase proteins and promote a co-stimulation of T lymphocytes Thus, we suggest that the findings in our study are consequences of the inflammatory response generated by muscle injury.We hope that this study, provide more information about the pathophysiolgy of the disease, and promote a greater understanding of the immune and inflammatory responde assessment in this study model. Moreover, the base values found could help in assessing possible responses in preclinical testing, aiding the understanding of the beneficial or adverse reactions to validate and explain the mechanism of action of a cell therapy, gene or drug treatments

Idealizou-se o presente ensaio com o objetivo de padronizar o perfil hematológico, bioquímico, eletroforético (proteinograma sérico) e quantificação das células linfocitárias CD4, CD5, CD8 por citometria de fluxo de cães da raça Golden Retrivier normais (grupos GR) e de cães distróficos (grupos GRMD). Para tanto, considerou-se a divisão dos grupos de acordo com a idade dos animais, desde o nascimento até a idade adulta, compondo assim seis grupos, sendo eles GR I, II, III e GRMD I, II, III. No presente projeto realizamos os estudos eletroforéticos de cães pertencentes a todos os grupos, estudos hematológicos e bioquímicos dos cães pertencentes aos grupos GR II, III, GRMD II e III, imunofenotipagem linfocitária dos grupos GR III e GRMD III. Os resultados eritroleucométricos e trombométricos obtidos para os cães pertencentes aos grupos GR II e GR III apresentaram valores médios dentro normalidade. Com relação aos cães pertencentes aos grupos GRMD III, observamos que o eritrograma se encontra dentro dos valores de referência. Contudo, considerando o leucograma, os valores médios (3,79/ mm3) referentes à mensuração de basófilos apresentaram-se acima dos valores de normalidade, variando de 0 a 159/mm3. Ademais, considerando os valores máximos, alguns animais pertencentes ao grupo em questão, apresentaram leucocitose com neutrofilia sem desvio à esquerda, além de trombocitose, monocitose e linfopenia, no momento das coletas. As dosagens bioquímicas séricas de todos os cães afetados apresentaram valores médios acima dos valores de normalidade para a dosagem de AST, ALT e CK. Para o estudo das proteínas séricas, a técnica SDS-PAGE permitiu o fracionamento de vinte e três proteínas, cujos pesos moleculares variaram de 16.000 a 260.000 daltons em todos os grupos estudados. Destas, foi possível identificar nominalmente doze frações protéicas: IgA (PM 142.000 Da), proteína C-reativa (PM122.000 Da), ceruloplasmina (PM 110.000 Da), fosforilase (PM 95.000 Da), transferrina (PM 82.000 Da), hemopexina (PM 78.000 Da), albumina (PM 66.000 Da), alfa1 antitripsina (PM 62.000 Da), IgG de cadeia pesada (PM 55.000 Da), haptoglobina (PM 45.000 Da), glicoproteína ácida (PM 40.000 Da) e IgG de cadeia leve (PM 23.000 Da). As demais proteínas foram identificadas pelos respectivos pesos moleculares. Não foi possível identificar nominalmente as frações protéicas de pesos moleculares 260.000 Da, 230.000 Da, 180.000 Da, 165.000 Da, 158.000 Da, 91.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 28.000 Da e 16.000 Da. Dentre essas proteínas foi possível observar que a proteína de peso molecular 91.000 Da foi encontrada apenas nos grupos GR I e GRMD I não sendo identificada nos outros grupos estudados. Considerando as alterações encontradas com relação às proteínas de fase aguda, evidenciamos as respostas de fase aguda frente às lesões musculares que ocorrem progressivamente em cães distróficos, principalmente em animais distróficos jovens, podendo inferir que os mesmos apresentaram alterações protéicas perante a injúria tecidual como é relatado em vários processos inflamatórios relacionados com outras patologias. Da mesma forma, os animais afetados pela distrofia, possuem alterações imunoglobulínicas quando comparados a animais normais. Com relação a imunofenotipagem linfocitária foi confeccionado um histograma das populações de linfócitos CD4+, CD5+ e CD8+ a partir da região do gate de linfócitos. Todos os animais afetados pela distrofia apresentaram porcentagem significativamente maior com relação à população linfocitária CD4+ e CD5+ quando comparados aos cães normais. Desta forma, podemos inferir que o processo progressivo da distrofia, esta relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência de distrofina o músculo fica mais susceptível á lesões, sendo que na sua ocorrência, há liberação de citocinas que estimulam as células hepáticas a secretarem as proteínas de fase aguda e a promoverem uma co-estimulação de linfócitos T. Assim, podemos sugerir que os resultados encontrados em nosso trabalho são conseqüências da resposta inflamatória gerada pela lesão muscular. Esperamos com esse estudo, fornecer mais informações sobre a fisiopatogenia da doença, bem como promover um maior entendimento sobre a avaliação imunológica e resposta inflamatória neste modelo de estudo. Ademais, que os valores de base encontrados possam auxiliar na avaliação de possíveis reações nos testes pré-clínicos, facilitando assim, o entendimento das reações benéficas ou adversas para validar e explicar o mecanismo de ação de uma terapia celular, gênica ou mesmo medicamentosa / Devised to test this in order to standardize the hematological, biochemical, electrophoretic (Serum protein) and quantification of CD4 lymphocyte cells, CD5, CD8 by flow cytometry of Golden Retriever dogs normal (group GR) and dogs dystrophic (GRMD groups). To this end, we considered the division of groups according to age of animals, from birth to adulthood, thus composing six groups, as Gr I, II, III and GRMD I, II, III. In this project we performed electrophoretic studies of dogs belonging to all groups, haematological and biochemical studies of dogs belonging to the groups GR II, III, II and III GRMD, lymphocyte immunophenotyping in groups III and GR GRMD III. The results obtained for trombometric, erythometric and dogs belonging to the groups and GR II GR III showed mean values within normal limits. With respect to dogs belonging to groups III GRMD, we observed that the erythrocyte is within the reference values. However, considering the WBC, the mean (3.79 / mm3) relating to the measurement of basophils were above normal values, ranging from 0 to 159/mm3. Moreover, considering the maximum, some animals belonging to the group in question had leukocytosis with neutrophilia without left shift, and thrombocytosis, monocytosis and lymphopenia at the time of collection. The biochemical serum of all affected dogs had mean values above the normal range for the determination of AST, ALT and CK. For the study of proteins, SDS-PAGE technique allowed the fractionation of twenty-three proteins whose molecular weights ranged from 16,000 to 260,000 daltons in all groups. These could be identified by name twelve fractions: IgA (PM 142,000 Da), C-reactive protein (PM122.000 Da), ceruloplasmin (PM 110,000 Da), phosphorylase (95,000 Da PM), transferrin (82,000 Da PM), hemopexin (PM 78 000 Da), albumin (66,000 Da PM), alpha1 antitrypsin (PM 62,000 Da), IgG heavy chain (55,000 Da PM), haptoglobin (PM 45,000 Da), glycoprotein (PM 40,000 Da) and IgG light chain (PM 23 000 Da). The other proteins were identified by their molecular weights. We could not identify by name the protein fractions of molecular weight 260,000 Da, 230,000 Da, 180,000 Da, 165,000 Da, 158,000 Da, 91,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 28,000 Da and 16,000 Da. Among these proteins was observed that the protein molecular weight of 91,000 Da was found only in groups GR I and GRMD I was not identified in other groups. Considering the changes found with relation to acute phase proteins, we noted the acute phase response in the face of muscle injuries that occur gradually in dystrophic dogs, especially in young dystrophic animals, which may infer that they had abnormal protein before tissue injury as reported in many inflammatory-related pathologies. Likewise, animals affected by muscular dystrophy, alterations immunoglobulin when compared to normal animals. With respect to lymphocyte immunophenotyping was made a histogram of the populations of CD4, CD5 and CD8 from the region of the gate of lymphocytes. All animals affected by muscular dystrophy showed significantly higher percentage with respect to CD4 and CD5 lymphocyte population compared to normal dogs. Thus, we can infer that the process of progressive muscular dystrophy, is associated with changes in cell populations that make up the immune system of patients, because due to the absence of dystrophin, the muscle is more susceptible to damage, and its occurrence , a release of cytokines that stimulate liver cells to secrete acute phase proteins and promote a co-stimulation of T lymphocytes Thus, we suggest that the findings in our study are consequences of the inflammatory response generated by muscle injury.We hope that this study, provide more information about the pathophysiolgy of the disease, and promote a greater understanding of the immune and inflammatory responde assessment in this study model. Moreover, the base values found could help in assessing possible responses in preclinical testing, aiding the understanding of the beneficial or adverse reactions to validate and explain the mechanism of action of a cell therapy, gene or drug treatments