Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_D.pdf: 35688895 bytes, checksum: dc0574f3ff57450c0d5ff8840699f5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Venenos animais são fontes de substâncias neuroativas, algumas capazes de provocar paralisia e convulsão em mamíferos, com visível ação no sistema nervoso central (SNC). O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) é composto por neurotoxinas que causam, experimentalmente, permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma entidade tanto física, quanto molecular, composta pelos microvasos sanguíneos cerebrais, pelos pés astrocitários e pericitos adjacentes engajados no controle do tráfego de moléculas na interface sangue-cérebro. A BHE, embora imprescindível à manutenção da homeostase no SNC, pode representar um obstáculo ao acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. Nossa proposta foi investigar a ação sistêmica do PNV após 15 min, 2 e 5 h da injeção i.v. em ratos Wistar adultos através de: (1) alterações na expressão das proteínas juncionais, de efluxo e transportador de glicose da BHE; (2) alterações na expressão da proteína conexina-43 (constituinte das junções comunicantes) e da proteína fosfatase pPP2A, uma vez que a fosforilação de resíduos de tirosina das proteínas juncionais tem papel no controle da integridade paracelular; (3) ativação de vias neuronais e sua modulação pelo óxido nítrico (NO). (4) Reação inflamatória e gliose reativa de astrócitos in vivo e in vitro e sua possível modulação pelo NO, (5) Purificação e identificação de toxinas do PNV com ação na BHE. A expressão das proteínas juncionais encontrava-se diminuída aos 15 min e 2 h, porém às 5 h pós-PNV a expressão das proteínas investigadas estava total ou parcialmente recuperada, sugerindo ser esse um dos mecanismos de abertura da BHE. Igualmente, a expressão da proteína de efluxo aumentou indicando mecanismo de clearance do agente tóxico. A expressão da conexina-43, e da pPP2A estavam aumentadas aos 15 min e diminuída às 5 h da injeção do PNV, mostrando não só que as comunicações célula-célula e o mecanismo de adesão célulacélula foram afetados, mas também que as alterações podem ser transitórias. Ademais, vias neuronais foram ativadas em áreas motoras e em núcleos do hipotálamo o que explicaria o comprometimento motor (convulsão, paralisia) e os sinais neurovegetativos (sialorréia, hipertensão, estresse respiratório, edema pulmonar, anúria) vistos em animais envenenados. Muitas dessas vias apontam modulação nitrérgica dos sinais tóxicos do envenenamento, uma vez que a inibição da síntese de NO pelo 7- nitroindazol (7-NI) diminuiu a ativação neuronal em algumas áreas e exacerbou em outras. Os astrócitos incubados com PNV, corroborando com estudos in vivo, expressaram citocinas pró-inflamatórias e apresentaram gliose reativa, porém a inibição da síntese do NO atenuou esses efeitos, confirmando que o NO tem um importante papel nos efeitos do PNV. Toxinas F8a-1 e F10a-1, purificadas do PNV, foram identificadas como responsáveis pela permeabilização da BHE, embora não esteja excluída a contribuição de outros componentes. O entendimento da ação do PNV e de suas toxinas no tecido neural e na BHE pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para uso clínico e em pesquisa. / Abstract: Animal venoms are source of neuroactive substances, some of them able to provoke paralysis and convulsion in mammals, indicating action on the central nervous system (CNS). The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV) is composed of neurotoxins that cause, experimentally, blood-brain barrier (BBB) permeabilization. The BBB is both a physical and molecular entity, constituted by the cerebral microvessels and surrounding astrocytic end-feet and pericytes, all involved in the control of the traffic of molecules at the blood-brain interface. Even so the BBB presence is essential for the maintenance of CNS homeostasis; it also represents an obstacle for the therapeutical drugs access into the neural microenvironment. Our proposal was to investigate acute changes (15 min, 2 and 5 h) after PNV i.v. injection in adult Wistar rats through evaluation of the: (1) alterations in the expression of the BBB-junctional proteins, -efflux proteins, and -glucose transporter; (2) alterations in the expression of connexin-43 protein (gap junctions constituent) and protein phosphatase 2A (pPP2A, since phosphorylation of tyrosine residues from junctional proteins plays a role in controlling junctional integrity); (3) activation of neuronal pathways and its modulation by the nitric oxide (NO). (4) In vivo and in vitro astrocytes inflammatory reaction and reactive gliosis after incubation with PNV and its possible modulation by NO. (5) Purification and determination of BBB-acting from toxins PNV. The expression of the junctional proteins was diminished at 15 min and 2 h post-PNV exposure; however at 5 h the expression of most of the proteins investigated was total or partially recovered, suggesting that this might be one of the BBB opening mechanisms. Similarly, the venom increased the efflux protein expression, indicating ongoing clearance of toxic agents from the neural tissue. The expression of both connexin-43 and pPP2A increased after 15 min and diminished after 5 h of PNV injection, showing not only that cell-cell communication and cell-cell adhesion mechanism were affected, but that these alterations were transitory. Activated neuronal pathways have been observed in brain motor areas and hypothalamic nucleus, explaining the motor impairment (convulsion, paralysis) and neurovegetative signs (salivation, hypertension, respiratory stress, pulmonary edema, anuria) observed in the envenomed animals. Many of these neuronal pathways point to a nitrergic modulation of the envenomed toxic signs, since that NO synthesis inhibition by 7-nitroindazol (7-NI) decreased the neuronal activation in some areas and enhanced in others. The astrocytes incubated with PNV, in agreement with in vivo studies, expressed pro-inflammatory cytokines and presented reactive gliosis, however the pretreatment with 7- NI attenuated these effects, confirming that NO have an important role in the PNV effects. The F8a-1 and F10a-1 toxins, fractionated from the crude PNV, were identified as responsible by BBB permeabilization; despite, other venom components contribution can not be discarded. The understanding of the action of the venom of Phoneutria nigriventer and its toxins in the neural tissue and BBB can contribute for the development of useful tools for clinical and research purposes. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Smetana_JulianaHelenaCosta_D.pdf: 8660811 bytes, checksum: cb33e97d4c49fdce1e29094a2f6089cc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer. As fosfatases, enzimas que removem grupamentos fosfato dos substratos de quinases, dependem principalmente de subunidades regulatórias para definir sua especificidade. As fosfatases do tipo 2A constituem a subfamília PPP, que é formada por PP2A, PP4 e PP6. PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65/A). Em levedura, as fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42. A proteína Tip41 foi identificada como um parceiro de interação de Tap42 e regulador da via da quinase TOR em levedura. A homóloga de Tap42 em mamíferos, chamada de a4, está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento, migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A. A homóloga em mamíferos de Tip41, chamada TIPRL, é uma proteína ainda pouco caracterizada. Este trabalho teve como objetivo analisar a função das proteínas a4 e TIPRL humanas e esclarecer seu papel na regulação de fosfatases 2A. A caracterização estrutural de a4 e Tap42, usando dados de SAXS, dicroísmo circular e proteólise limitada, mostrou que essas proteínas apresentam um domínio N-terminal compacto formado por a-hélices e um domínio C-terminal desestruturado. Em uma triagem de interações com a proteína TIPRL humana, identificamos as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c como seus parceiros de interação, assim como os fatores de transcrição MafB e TAF10. Ao contrário do esperado a partir do modelo de levedura, a4 e TIPRL não interagem diretamente, mas formam um complexo ternário com PP2Ac. Uma triagem de substratos de fosfatases 2A regulador por TIPRL identificou os fatores de splicing SF2/ASF e SF2p32. Nossos resultados sugerem um modelo estrutural para a regulação das fosfatases 2A por a4 e mostram que TIPRL é um novo regulador comum dessas fosfatases com funções na regulação da expressão gênica. / Abstract: Cells respond constantly to a variety of stimuli, which are interpreted and integrated through signaling networks, giving rise to biological responses. Defects in this circuitry are a cause of many diseases, including cancer. Protein phosphatases are enzymes which remove phosphate groups from kinase substrates, relying mainly on regulatory subunits for their substrate specificity. Type 2A phosphatases belong to the PPP subfamily, which is formed by PP2A, PP4 and PP6. PP2A is the major soluble serine/threonine phosphatase in animal cells and is found predominantly as a heterotrimer composed of a catalytic (C), a regulatory (B, B', B'' or B''') and a scaffold (PR65/A) subunit. Type 2A phosphatases play a major role in the yeast TOR signaling pathway through their interaction with the essential protein Tap42. Tip41 was identified as a Tap42 interacting protein and regulator of the TOR pathway. a4, the mammalian orthologue of Tap42, regulates many cellular processes such as differentiation, development, cell migration and apoptosis as a conserved type 2A phosphatase regulator. TIPRL, the mammalian orthologue of Tip41, is still poorly characterized. The objective of the present work was to analyse the function of a4 and TIPRL and improve the understanding of their role as type 2A phosphatase regulators. The structural characterization of a4 using SAXS analyses, circular dichroism and limited proteolysis, showed that these proteins are formed by an a-helical N-terminal domain and an unfolded C-terminal domain. A screen for TIPRL interacting proteins identified PP2Ac, PP4c and PP6c and also the transcription factors MafB and TAF10. Unlike their yeast conterparts, a4 and TIPRL do not interact directly, but rather form a ternary complex with PP2A. A search for type 2A phosphatase substrates regulated by TIPRL identified the splicing factor SF2/ASF and its regulatory protein SF2p32. Our results suggest a structural model for the regulation of type 2A phosphatases by a4 and show that TIPRL is a novel common regulator of these phosphatases which functions in regulation of gene expression. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular