Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Methoden zur Diagnostik der Aspergillose bei Greifvögeln, um neue Erkenntnisse über die Aussagekraft dieser nicht invasiven Diagnostika zu gewinnen. In der ersten Studie wurden bei ausschließlich Aspergillose-positiven Falken (Falco spp.) (n = 110) spezifische Röntgenzeichen an digital erstellten Röntgenbildern systematisch ermittelt und mit den typischen Röntgenzeichen von Papageien mit Erkrankungen des unteren Respirationstrakts verglichen. In der zweiten Studie wurden gesunde (n = 73) und an Aspergillose erkrankte (n = 32) Jagdfalken (Falco spp.) mittels Serumelektrophorese untersucht, Referenzwerte für die gesunden Falken erstellt und mit den Werten der erkrankten Falken verglichen. In beiden Studien stammten die Tiere aus dem Patientengut derselben Klinik. Bei der Auswertung von Röntgenbildern Aspergillose-positiver Falken wurden hauptsächlich subtile Röntgenzeichen beschrieben. Von den 110 Tieren waren 29 (26,4 %) radiologisch vollkommen unauffällig. Die am häufigsten beschriebenen Befunde waren inhomogene Verschattungen des Lungenfeldes (38,2 % laterolateral [ll]) und strichförmige Verschattungen der kaudalen Lungengrenze (30,0 % ll) sowie inhomogene (34,5 % ll; 29,1 % ventrodorsal [vd]) und streifige (26,4 % ll) Verschattungen der Luftsäcke, aber auch eine schlechte Abgrenzbarkeit des Herzschattens in der laterolateralen Projektion (42,7 %). Im Vergleich zu an Papageien mittels konventioneller Projektionsradiographie durchgeführten Studien war der Anteil an subtilen Röntgenzeichen geringer und der Anteil an massiven Röntgenzeichen größer. Verglichen mit Referenzwerten diverser Greifvogelspezies aus der Literatur zeigten die Referenzwerte der gesunden Falken dieser Studie unter Verwendung des hochauflösenden Elektrophoresesystems SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, Frankreich) relativ niedrige Gesamtproteinwerte und relativ hohe Präalbuminwerte auf. Bei den 32 Serumproben der an Aspergillose erkrankten Falken ließ sich im Gegensatz zu den 73 Serumproben der gesunden Falken ein signifikant erniedrigter Totalalbuminwert (Albumin + Präalbumin) sowie ein hoch signifikant erniedrigter Präalbuminwert mittels Serumelektrophorese feststellen. Obwohl die Falken meist schon in frühen Krankheitsstadien vorgestellt wurden und die Diagnostik in diesen Stadien besonders schwierig ist, konnten mit beiden Untersuchungsmethoden von gesunden Tieren differierende Befunde erhoben werden. Diese in Zusammenhang mit Aspergillose erhobenen Befunde wichen jedoch teilweise deutlich von den in der Literatur beschriebenen „typischen“ Befunden bei an Aspergillose erkrankten Vögeln ab. Dies kann damit erklärt werden, dass die meisten vergleichbaren Studien an als Heimtiere gehaltenen Papageien oder gefangen gehaltenen Zoovögeln (von Falken abweichende Haltungsform, Anatomie und Physiologie sowie Leistungsniveau) und mit unterschiedlicher Technik (digitale versus konventionelle Projektionsradiographie, unterschiedliche Elektrophoresesysteme und Verwendung von Serum anstelle von Plasma) durchgeführt wurden. Die digitale Projektionsradiographie kann aufgrund ihrer schonenden, einfachen und schnellen Durchführbarkeit sowohl den Vogelmedizin spezialisierten Institutionen als auch den Kleintierpraktikern uneingeschränkt empfohlen werden. Die Proteinelektrophorese kann bis zum heutigen Zeitpunkt nur bedingt für den Praktiker, wohl aber für spezialisierte Institutionen bei Beachtung aller Besonderheiten als zusätzliches Diagnostikum empfohlen werden. / The present study concentrates on two methods for diagnosing birds of prey with aspergillosis with the intent to increase the knowledge of the validity of these non-invasive diagnostic methods. In the first study, specific radiographic signs of digitally created radiographs of falcons (Falco spp.) which were exclusively positive for aspergillosis (n = 110) were systematically analyzed and compared to the typical radiographic signs of parrots with diseases of the lower respiratory tract. In the second study, healthy falcons (n = 73) and falcons affected with aspergillosis (n = 32) (Falco spp.) were examined by using serum protein electrophoresis in order to create reference values for healthy falcons and compare them with the values of the affected falcons. In both studies, the animals were patients of the same clinic. While evaluating the radiographs of the falcons with aspergillosis, mainly subtle radiographic signs were described. Radiographically within normal limits were 29 (26.4%) of the 110 animals. The most commonly reported findings were inhomogeneous increased radiodensity of the lung area (38.2% laterolateral [ll]), line-shaped shadowings of the caudal lung border (II 30.0%) as well as an inhomogeneous (34.5% ll, 29.1% ventrodorsal [vd]) and streaky (26.4% II) radiodensity of the air sacs, but also a poor delineation of the cardiac silhouette in the laterolateral projection (42.7%). Compared to studies performed on parrots by conventional radiography, the portion of subtle radiographic signs was lower and the portion of severe signs was higher. Compared to reference values of various raptor species from the literature, this study, which made use of the high-resolution electrophoresis SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, France), revealed relatively low values for total proteins and relatively high values for prealbumin in the reference values of the healthy falcons. The 32 serum samples of the falcons suffering from aspergillosis showed a significantly reduced total albumin (albumin + prealbumin) level and a highly significantly reduced prealbumin level compared to the 73 serum samples of healthy falcons. Although the falcons were for the most part already brought to the clinic in one of the early stages of the disease, when diagnosing aspergillosis is particularly difficult, both examination methods revealed different results for the healthy and diseased animals. However, the findings related to aspergillosis were in some cases significantly different from those described in the literature as the \"typical\" findings in birds suffering from aspergillosis. This can be explained by the fact that most of the comparable studies were conducted with parrots held as pets or with captive zoo birds (when husbandry, anatomy and physiology, as well as performance level are different from falcons) and with a different technique (digital versus conventional radiography, different electrophoresis systems and the use of serum instead of plasma). The digital radiography can be fully recommended for specialized medical institutions for avian medicine as well as for small animal practitioners because of its easy, rapid and gentle feasibility. To date, the protein electrophoresis can only be recommended with restrictions for practitioners, however for specialized institutions, it can be useful as additional diagnostic tool if all its specific features are taken into account.

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Methoden zur Diagnostik der Aspergillose bei Greifvögeln, um neue Erkenntnisse über die Aussagekraft dieser nicht invasiven Diagnostika zu gewinnen. In der ersten Studie wurden bei ausschließlich Aspergillose-positiven Falken (Falco spp.) (n = 110) spezifische Röntgenzeichen an digital erstellten Röntgenbildern systematisch ermittelt und mit den typischen Röntgenzeichen von Papageien mit Erkrankungen des unteren Respirationstrakts verglichen. In der zweiten Studie wurden gesunde (n = 73) und an Aspergillose erkrankte (n = 32) Jagdfalken (Falco spp.) mittels Serumelektrophorese untersucht, Referenzwerte für die gesunden Falken erstellt und mit den Werten der erkrankten Falken verglichen. In beiden Studien stammten die Tiere aus dem Patientengut derselben Klinik. Bei der Auswertung von Röntgenbildern Aspergillose-positiver Falken wurden hauptsächlich subtile Röntgenzeichen beschrieben. Von den 110 Tieren waren 29 (26,4 %) radiologisch vollkommen unauffällig. Die am häufigsten beschriebenen Befunde waren inhomogene Verschattungen des Lungenfeldes (38,2 % laterolateral [ll]) und strichförmige Verschattungen der kaudalen Lungengrenze (30,0 % ll) sowie inhomogene (34,5 % ll; 29,1 % ventrodorsal [vd]) und streifige (26,4 % ll) Verschattungen der Luftsäcke, aber auch eine schlechte Abgrenzbarkeit des Herzschattens in der laterolateralen Projektion (42,7 %). Im Vergleich zu an Papageien mittels konventioneller Projektionsradiographie durchgeführten Studien war der Anteil an subtilen Röntgenzeichen geringer und der Anteil an massiven Röntgenzeichen größer. Verglichen mit Referenzwerten diverser Greifvogelspezies aus der Literatur zeigten die Referenzwerte der gesunden Falken dieser Studie unter Verwendung des hochauflösenden Elektrophoresesystems SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, Frankreich) relativ niedrige Gesamtproteinwerte und relativ hohe Präalbuminwerte auf. Bei den 32 Serumproben der an Aspergillose erkrankten Falken ließ sich im Gegensatz zu den 73 Serumproben der gesunden Falken ein signifikant erniedrigter Totalalbuminwert (Albumin + Präalbumin) sowie ein hoch signifikant erniedrigter Präalbuminwert mittels Serumelektrophorese feststellen. Obwohl die Falken meist schon in frühen Krankheitsstadien vorgestellt wurden und die Diagnostik in diesen Stadien besonders schwierig ist, konnten mit beiden Untersuchungsmethoden von gesunden Tieren differierende Befunde erhoben werden. Diese in Zusammenhang mit Aspergillose erhobenen Befunde wichen jedoch teilweise deutlich von den in der Literatur beschriebenen „typischen“ Befunden bei an Aspergillose erkrankten Vögeln ab. Dies kann damit erklärt werden, dass die meisten vergleichbaren Studien an als Heimtiere gehaltenen Papageien oder gefangen gehaltenen Zoovögeln (von Falken abweichende Haltungsform, Anatomie und Physiologie sowie Leistungsniveau) und mit unterschiedlicher Technik (digitale versus konventionelle Projektionsradiographie, unterschiedliche Elektrophoresesysteme und Verwendung von Serum anstelle von Plasma) durchgeführt wurden. Die digitale Projektionsradiographie kann aufgrund ihrer schonenden, einfachen und schnellen Durchführbarkeit sowohl den Vogelmedizin spezialisierten Institutionen als auch den Kleintierpraktikern uneingeschränkt empfohlen werden. Die Proteinelektrophorese kann bis zum heutigen Zeitpunkt nur bedingt für den Praktiker, wohl aber für spezialisierte Institutionen bei Beachtung aller Besonderheiten als zusätzliches Diagnostikum empfohlen werden. / The present study concentrates on two methods for diagnosing birds of prey with aspergillosis with the intent to increase the knowledge of the validity of these non-invasive diagnostic methods. In the first study, specific radiographic signs of digitally created radiographs of falcons (Falco spp.) which were exclusively positive for aspergillosis (n = 110) were systematically analyzed and compared to the typical radiographic signs of parrots with diseases of the lower respiratory tract. In the second study, healthy falcons (n = 73) and falcons affected with aspergillosis (n = 32) (Falco spp.) were examined by using serum protein electrophoresis in order to create reference values for healthy falcons and compare them with the values of the affected falcons. In both studies, the animals were patients of the same clinic. While evaluating the radiographs of the falcons with aspergillosis, mainly subtle radiographic signs were described. Radiographically within normal limits were 29 (26.4%) of the 110 animals. The most commonly reported findings were inhomogeneous increased radiodensity of the lung area (38.2% laterolateral [ll]), line-shaped shadowings of the caudal lung border (II 30.0%) as well as an inhomogeneous (34.5% ll, 29.1% ventrodorsal [vd]) and streaky (26.4% II) radiodensity of the air sacs, but also a poor delineation of the cardiac silhouette in the laterolateral projection (42.7%). Compared to studies performed on parrots by conventional radiography, the portion of subtle radiographic signs was lower and the portion of severe signs was higher. Compared to reference values of various raptor species from the literature, this study, which made use of the high-resolution electrophoresis SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, France), revealed relatively low values for total proteins and relatively high values for prealbumin in the reference values of the healthy falcons. The 32 serum samples of the falcons suffering from aspergillosis showed a significantly reduced total albumin (albumin + prealbumin) level and a highly significantly reduced prealbumin level compared to the 73 serum samples of healthy falcons. Although the falcons were for the most part already brought to the clinic in one of the early stages of the disease, when diagnosing aspergillosis is particularly difficult, both examination methods revealed different results for the healthy and diseased animals. However, the findings related to aspergillosis were in some cases significantly different from those described in the literature as the \"typical\" findings in birds suffering from aspergillosis. This can be explained by the fact that most of the comparable studies were conducted with parrots held as pets or with captive zoo birds (when husbandry, anatomy and physiology, as well as performance level are different from falcons) and with a different technique (digital versus conventional radiography, different electrophoresis systems and the use of serum instead of plasma). The digital radiography can be fully recommended for specialized medical institutions for avian medicine as well as for small animal practitioners because of its easy, rapid and gentle feasibility. To date, the protein electrophoresis can only be recommended with restrictions for practitioners, however for specialized institutions, it can be useful as additional diagnostic tool if all its specific features are taken into account.

Mitochondriopathien sind Multisystemerkrankungen die durch verschiedene Defekte in den Energie (ATP) produzierenden Stoffwechselwegen der Mitochondrien verursacht sind. Will man Mitochondriopathien auf molekularer Ebene diagnostizieren, stößt man auf folgende Schwierigkeiten: (A) Ungefähr 1000 Gene sind an der Biogenese des Mitochondriums beteiligt. Die Dysfunktion jedes einzelnen dieser Gene kann potentiell zur Mitochondriopathie führen. (B) Mitochondriale Proteine werden durch zwei Genome, durch die mitochondriale und durch die nukleäre DNA kodiert. (C) Die klinischen Symptome der Patienten weisen selten auf die molekulare Diagnose, da der Phänotyp oft nur auf einem sekundären Energiemangel beruht. In der Regel besteht keine sichere Genotyp-Phänotyp-Relation. Mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden lassen sich bei nur 20% der Patienten Mutationen finden. Wir wollten daher eine neue Screening-Methode entwickeln, mit deren Hilfe wir hoffen, die Aufspürungsrate für mitochondriale Mutationen zu erhöhen. Die Gesamtheit der Proteine einer Organelle oder einer ganzen Zelle (ihr "Proteom") stellt das Verbindungsglied zwischen Geno- und Phänotyp dar. Aus diesem Grunde wollten wir das mitochondriale Proteom von gesunden Kontrollpersonen und von Patienten mit Mitochondriopathien untersuchen. Protein-Muster, die zwischen diesen beiden Gruppen abweichen, könnten die Aufmerksamkeit auf Gene und Proteine richten, die an der Entstehung des Krankheits-Phänotyps beteiligt sind. Um solch eine vergleichende Studie durchzuführen, muß zunächst eine Referenzkarte des normalen mitochondrialen Proteoms erstellt werden. In meinem Dissertationsprojekt habe ich diese grundlegende Arbeit durchgeführt und zahlreiche Proteine auf der Proteomkarte menschlicher Mitochondrien identifiziert, die aus Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellen gewonnen worden waren. Ich wählte diese Zellsorte als Untersuchungsmaterial, da sie nicht nur einfach von Patienten gewonnen werden, sondern auch potentiell permanent wachsen kann. Dies erlaubt die Züchtung einer hohen Zellzahl ohne übermäßigen Aufwand. Ich optimierte ein Protokoll zur Zentrifugation in einem hybriden Gradienten, mit dem genug gereinigte Mitochondrien aus 108 Zellen gewonnen werden konnten. Für die Referenzkarte benutzte ich die lymphoblastoide Zellline einer gesunden Kontrollperson. Die Methode der Wahl zur Proteinidentifikation in Proteom-Projekten ist die zweidimensionale Proteinelektrophorese gekoppelt mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ich entdeckte mehr als 400 Punkte in meinem silbergefärbten zweidimensionalen Gel und analysierte die 141 stärksten Punkte nach in-gel Trypsin-Verdau und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie in einem Verfahren, das als "Peptide Mass Fingerprinting" (Peptidmassen-Fingerabdruck) bezeichnet wird. Mit Hilfe entsprechender Datenbanken konnte ich schließlich 115 verschiedene Proteinpunkte (entsprechen 95 verschiedenen Proteinen) identifizieren. 90 dieser Punkte (entsprechend 74 verschiedenen Proteinen) waren sicher mitochondrialer Herkunft und sind Komponenten aller wesentlichen im Mitochondrium lokalisierten Stoffwechselwege. 16 der 74 identifizierten mitochondrialen Proteine gehören zur Atmungskette. Obwohl 18 mitochondriale Proteine in der Datenbank SWISS-PROT als "Membran-assoziiert" annotiert sind, identifizierte ich nur vier Proteine mit sicheren Transmembrandomänen. Ich entdeckte keine der 13 durch die mitochondriale DNA kodierten Proteine, die alle stark hydrophobe Membranproteine sind. Andere Forscher sind bei dem Versuch diese Proteine zu identifizieren, auf die gleichen Schwierigkeiten gestoßen. Mit meiner Dissertationsarbeit habe ich unsere eigene Datenbank und Referenzkarte des mitochondrialen Proteoms lyphoblastoider Zellen erstellt. Diese Daten ermöglichen nun die Analyse des mitochondrialen Proteoms von Patienten. Meine weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet werden sich nun auf die genetische Variabilität des Proteoms gesunder Kontrollpersonen und auf das Proteom der Patienten mit Mitochondriopathien beziehen. / Mitochondrial disorders are multisystem diseases that can be caused by any defect in the energy (ATP) generating pathways in the mitochondria. The difficulty in diagnosing mitochondrial diseases on the molecular level arises from several obstacles: (A) About 1000 genes are involved in the biogenesis of mitochondria. The dysfunction of each of them may potentially cause mitochondriopathy. (B) The mitochondrial proteins are encoded by two genomes: the mitochondrial DNA and the nuclear DNA. (C) The clinical symptoms of the patients rarely suggest a molecular diagnosis since in most cases, the phenotype is a secondary phenomenon to energy depletion. Generally there is no genotype-phenotype relation. Based on current diagnostic methods in only 20% of the patients a mutation can be found. We therefore wanted to develop a new screening method by which we hope to increase the identification rate. Since the numerous proteins of an organelle or of a whole cell (its "proteome") connect the genotype with the phenotype, we set out to study the proteome of the mitochondrion in healthy individuals and in patients with mitochondrial diseases. Deviating protein patterns between the two individuals could direct the attention to disease-specific proteins and genes, which might be involved in the expression of a disease-phenotype. In order to perform such a comparison I first had to establish a normal reference map. In my dissertation project I performed this basic task and identified numerous mitochondrial proteins on the proteome-map of human mitochondria, which had been extracted from lymphoblastoid cells. I selected Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid cells as samples not only because they are easily obtained from patients, but also due to their potential permanent growth. This approach allows the cultivation of high cell numbers without excessive expenditure of work and cost. I optimized a protocol for hybrid gradient centrifugation, by which enough mitochondria can be purified from 108 cells. I used a cultured lymphoblastoid cell line from a normal control patient and isolated mitochondria from it by using hybrid gradient centrifugation. In proteomics the combination of the high-resolution two-dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is currently the method of choice for protein identification. I detected more than 400 spots in a silver-stained two-dimensional gel. I analyzed the 141 strongest spots of it by trypsin in gel digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry in a process termed "peptide mass fingerprinting". After database search, I finally identified 115 protein spots (corresponding to 95 different proteins), 90 of which (corresponding to 74 different proteins) are of confirmed mitochondrial origin. These identified proteins are components of the main biological pathways located in the mitochondrion. 16 of the 74 identified mitochondrial proteins belong to the respiratory chain. Despite the fact that 18 mitochondrial proteins are annotated in the SWISS-PROT-database as "membrane associated proteins", only four of them have clear transmembrane domains. None of the proteins encoded by the mitochondrial DNA could be detected. All of them are hydrophobic membrane proteins. A similar difficulty in resolving these proteins was encountered by other research groups. With my dissertation I established our own database and reference map of the mitochondrial proteome of lymphoblastoid cells. These data will facilitate the analysis of the mitochondrial proteome in patients. My future research based on this dissertation will mainly focus on the genetic variation of the proteome of healthy individuals and on patients with mitochondrial diseases.