PRAT-C2 In elektrophysiologischen Untersuchungen heterolog exprimierter PRAT-C2 Proben wurde eine Kationen-selektive Kanalaktivität mit einer dreifachen Porenstöchiometrie beobachtet. Durch Variation der experimentellen Parameter und eine detaillierte Analyse der Ergebnisse konnten seitenspezifische Eigenschaften des Kanals aufgedeckt werden, die auf eine ungleiche Ladungsverteilung hindeuten. Auf der Grundlage von Strukturvorhersagen wurde ein Topologiemodell mit vier transmembranen alpha-Helices für PRAT-C2.2 aus Arabidopsis thaliana erstellt. Die zum Stroma und Intermembranraum exponierten Sequenzabschnitte weisen eine sehr unterschiedliche Verteilung geladener Aminosäuren auf. Das Schaltverhalten des Kanals wurde sowohl durch das Signalpeptid eines chloroplastidären als auch eines mitochondrialen Präproteins beeinflusst. Trotz einer Reaktion auf den spezifischen Antikörper gegen PRAT-C2.1 wurden Hinweise dafür erbracht, dass es sich bei der Kanalaktivität um eine porenbildende Kontamination aus dem bakteriellen Expressionssystem handelte. Tic110 Durch den Vergleich der Eigenschaften von Tic110, aufgereinigt aus Chloroplasten von Pisum sativum, und einer verkürzten, heterolog exprimierten Form konnte gezeigt werden, dass der porenbildende Sequenzabschnitt jenseits der ersten 96 Aminosäuren liegt. Die Kanalaktivität zeichnete sich durch ein charakteristisches Schaltverhalten aus, wobei die Schaltfrequenz durch eine Wechselwirkung mit Ca2 -Ionen beeinflusst wurde. Tic110 zeigte eine Präferenz gegenüber Kationen, die jedoch von der Konformation des Kanals abhängig war und in Anwesenheit zweiwertiger Kationen abnahm. Cu2 -Ionen führten ab Konzentrationen von 2 mM zu einem kompletten Stromblock. Ob dieser Effekt auf der Bildung einer Disulfidbrücke basiert und damit biochemische Ergebnisse bekräftigt werden, die eine Regulation durch das Thioredoxin-System im Chloroplasten vermuten lassen, konnte anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht eindeutig geklärt werden.

Menschliche Mitochondrien enthalten etwa 1500 bis 2000 Proteine. Die meisten dieser Proteine werden im Zellkern kodiert und im Zytoplasma synthetisiert, und müssen daher über eine spezielle Maschinerie in die Mitochondrien transportiert werden. Obwohl mittlerweile viele Details über die Wirkungsweise dieser Proteinschleusen bekannt sind, wurden einige wichtige Aspekte des Proteinimports noch nicht ausreichend untersucht. Zum einen ist nicht bekannt, ob die einzelnen Importkomplexe einen Einfluss auf die mitochondrienvermittelte Apoptose haben. Weiterhin ist offen, welche genaue Rolle der Mitochondrienimport in der Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae spielt. Außerdem ist unklar, ob Faktoren des Importapparates für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Morphologie notwendig sind. Um diese Fragestellungen zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit permanente Zelllinien hergestellt, in denen die Expression einzelner am Mitochondrienimport beteiligter Proteine mittels RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert werden kann. Mithilfe dieser Zelllinien wurde getestet, ob die proapoptotischen Proteine Bax und Bak die Importmaschinerie benötigen, um in die äußere Mitochondrienmembran zu gelangen. Die Präsenz der beiden proapoptotischen Proteine in Mitochondrien während der Apoptose ist sehr entscheidend, da Bax und Bak in den Mitochondrien oligomerisieren und damit weitere Schritte der Apoptose einleiten. Im Widerspruch zu früheren Publikationen konnte hier gezeigt werden, dass die Translokation von Bax und Bak in die äußere Mitochondrienmembran unabhängig von Proteinimportfaktoren erfolgt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss mitochondrialer Importproteine auf die Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae. Das Neisserienprotein PorB transloziert während der Infektion in die Mitochondrien der Wirtszelle und induziert Apoptose. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von PorB zu bestimmten Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran wurde bisher angenommen, dass PorB diesen endogenen Proteinen auf ihrem Importweg in die äußere Mitochondrienmembran folgt. Überraschenderweise wurde im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, dass PorB nicht von allen Komplexen der Importmaschinerie in den Mitochondrien erkannt wird. Infolgedessen transloziert es in die innere Mitochondrienmembran und wirkt dadurch toxisch auf die Wirtszelle. In einem weiteren Projekt wurde untersucht, welche Rolle die Proteinimportkomplexe der äußeren mitochondrialen Membran in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienmorphologie spielen. Unter Verwendung der beschriebenen Zelllinien wurde entdeckt, dass in Abwesenheit des SAM (sorting and assembly) Importkomplexes die Struktur der inneren Mitochondrienmembran derangiert ist. Es wurden zudem Hinweise darauf gefunden, dass die Ursache für diesen Befund in einer Unterbrechung von Kontaktstellen zwischen den beiden Mitochondrienmembranen liegen könnte, für deren Aufrechterhaltung möglicherweise der SAM-Komplex verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlauben neue Einblicke in verschiedene Aspekte des Proteinimports in Mitochondrien. Zudem wurde mit der Entwicklung der stabilen Zelllinien ein neues Model geschaffen, anhand dessen in Zukunft weitere Detail des mitochondrialen Proteinimports erforscht werden können. / Human mitochondria comprise about 1500 to 2000 proteins. While only 13 proteins are encoded by the mitochondrial DNA the vast majority of mitochondrial proteins is encoded in the nucleus, synthesized in the cytosol, and translocated into mitochondria by a special protein import machinery. Although many details are now known about its function several important aspects of protein import in mitochondria were not unraveled yet. To begin with, the influence of the different mitochondrial import complexes on apoptosis is not known. Further, the exact role of the protein import machineries in mitochondria in the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae has not been clarified yet. Moreover, the question whether factors involved in protein import are required for the maintenance of the mitochondrial morphology is still unsolved. In order to address these open issues, permanent cell lines were generated within the frame of the present thesis in which the expression of single proteins implicated in mitochondrial import can be inhibited via RNA interference (RNAi). Using these cell lines, it was investigated whether the proapoptotic proteins Bax and Bak require the import machinery in order to gain access to the outer mitochondrial membrane. The presence of both proapoptotic proteins in mitochondria is essential during apoptosis as Bax and Bak oligomerize in the outer mitochondrial membrane leading to the execution of apoptosis. In contrast to earlier publications, results presented here prove that the translocation of Bax and Bak into the outer mitochondrial membrane occurs independent of its import machineries. The second part of this thesis explores the influence of mitochondrial import proteins on the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae. The neisserial protein PorB translocates into the mitochondria of host cells during infection and induces apoptosis. Because of structural similarities of PorB to a certain class of proteins in the outer mitochondrial membrane, it was assumed that PorB would follow the import pathway of these endogenous proteins into the outer mitochondrial membrane. Surprisingly, it was found within the present study that PorB is not recognized by all complexes implicated in this import pathway. As a consequence, it translocates into the inner mitochondrial membrane to exert its toxic effect on the host cell. In a further project, the role of import complexes of the outer mitochondrial membrane in the maintenance of the mitochondrial morphology was investigated. Using the described cell lines, it was found that in the absence of the SAM (sorting and assembly) import device, the structure of the inner mitochondrial membrane was disrupted. Further, evidence was found that the reason for this phenotype could be an interruption of contact sites between the two mitochondrial membranes, whose preservation possibly requires the SAM complex. The results presented here allow new insights into different aspects of mitochondrial protein import. Further, with the development of the stable cell lines a new model was generated that will allow future investigations on details about mitochondrial protein import.

Der "klassische" Importweg von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Kernrezeptoren oder viralen Proteinen in den Zellkern erfolgt in Abhängigkeit der Importine alpha und beta. Während nur ein Importin beta existiert, waren zu Beginn der Arbeiten zwei humane alpha-Importine bekannt. In der vorliegenden Arbeit wird die Identifikation, Klonierung und funktionelle Charakterisierung von vier neuen humanen alpha-Importinen beschrieben. Anhand ihrer Primärstruktur wurden die sechs alpha-Importine in drei Subfamilien unterteilt. Um die Hypothese zu testen, dass die verschiedenen Importin alpha Isoformen spezifische Funktionen ausüben und sich nicht vollständig gegenseitig ersetzen können, wurde zunächst ihre Expression auf RNA- und Proteinebene analysiert. Hier ließen sich differentielle Expressionsmuster in verschiedenen humanen Zellen und Geweben nachweisen. In vitro Analysen mit rekombinant exprimierten und aufgereinigten Proteinen deuteten daraufhin, dass die neu identifizierten Isoformen tatsächliche Importfunktion besitzen, dass sich jedoch die verschiedenen alpha-Importine in ihren Substratspezifitäten unterscheiden. Verschiedene neue Substrate der alpha-Importine wurden identifiziert und deren Importwege im Detail analysiert. Unterschiede in der Regulation der Expression der alpha-Importine in Abhängigkeit von Zellproliferation, Zelldifferenzierung bzw. in unterschiedlichen Diabetesmodellen der Ratte deuteten ebenfalls auf spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen hin. Die spezifische Inhibition der Importin alpha Expression in kultivierten HeLa-Zellen mittels RNA-Interferenz führte bei den meisten Isoformen zu einer ausgeprägten Inhibition der Zellproliferation, wodurch erstmals der Nachweis essentieller Funktionen verschiedener alpha-Importine in lebenden humanen Zellen erbracht wurde. In weiterführenden Experimenten sollen die Ursachen für die Inhibition der Zellproliferation bei Importin alpha-Mangel geklärt und die Bedeutung der unterschiedlichen alpha-Importine in vivo weiter analysiert werden. / The "classical" import of proteins like transcription factors, nuclear receptors or viral proteins into the nucleus depends on importins alpha and beta. While only one importin beta is known, two human alpha-importins had been described. In this study the identification, cloning and functional characterisation of four novel human alpha-importins is reported. Based on their primary structures the human alpha-importins can be grouped into three distinct subfamilies. To test the hypothesis that the various alpha-Importins differ in their specific functions and cannot substitute for each other first their expression at the RNA- and protein levels were analyzed. Differential expression patterns in various human cells and tissues could be demonstrated. In vitro analyses using recombinantly expressed and purified proteins indicated, that the newly identified isoforms posses import functions in deed. However, there was evidence for differences in their substrate specific import efficacies. New substrates of the alpha-importins were identified and their import pathways analyzed in detail. Differences in the expression regulation of the alpha-importins depending on cellular proliferation and differentiation as well as in different rat models of diabetes further pointed towards specific functions of the various alpha-importins. Specific expression inhibition of several isoforms of the importin alpha protein family in cultured HeLa-cells using RNA-interference technology caused a strong inhibition of cellular proliferation. This is the first proof for essential functions of different alpha-importins in living human cells. Future experiments shall identify the mechanisms involved in the cellular proliferation inhibition due to importin a deficiency and further analyze the role of the different alpha-importins in vivo.