Das CCAAT/Enhancer-Binding-Protein α (C/EBPα) ist ein Transkriptionsfaktor, der das Zellschicksal des hämatopoetischen Systems bestimmt. C/EBPα reguliert die Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen und bestimmt die myelomonozytäre Zelldifferenzierung. C/EBPα besitzt zudem die Eigenschaft lymphoide Zellen in myeloischen Zellen zu transdifferenzieren. Die von C/EBPα induzierte lymphoid-myeloische Transdifferenzierung kann als Modellsystem dienen, um die Vorgänge der Linienfestlegung, der zellulären Plastizität sowie der Funktionen von C/EBPα in der Zelldifferenzierung und Leukämogenese zu untersuchen. C/EBPα ist ein unstrukturiertes Protein, das seine Funktionen durch wechselnde Proteininteraktionen ausübt. Intrinsisch unstrukturierte Proteine, wie C/EBPα, sind prädestiniert an schwachen, multivalenten und hochdynamischen Proteininteraktionen teilzunehmen. Solche Inter-aktionen werden hauptsächlich durch kurze lineare Motive der Protein-Primärstruktur vermittelt. Motiv-basierte Proteininteraktionen sind mit den herkömmlichen Methoden der Interaktom-Analyse schwer zu analysieren. Die Anwendung der neuartigen Biotin-Ligase basierten TurboID Methode mit schneller Enzym-Kinetik ermöglichte nun die Analyse eines dynamischen C/EBPα Interaktoms während der lymphoid-myeloiden Transdifferenzierung. Es wurde festgestellt, dass sich die Proteinexpression der meisten C/EBPα interagierenden Proteine während der Transdifferenzierung kaum änderte, trotz erheblicher Änderungen des C/EBPα Interaktoms, was eine Regulation durch alternative Mechanismen nahelegt. Es wurden mehrere epigenetische Komplexe gefunden, einschließlich Mediator, SWI/SNF und CAF-1, die als mögliche Verbindung zwischen Interaktom, Transkriptom, Chromatinstruktur und Phänotyp in Betracht gezogen werden können. / The CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα) is a key lineage-instructive transcription factor in the haematopoietic system. C/EBPα regulates the self-renewal of haematopoietic stem cells and is one of the main determinants of myeloid commitment. C/EBPα induces transdifferentiation of B cells into myeloid cells. C/EBPα-induced lymphoid-myeloid transdifferentiation may serve as a model system to study lineage commitment and cellular plasticity as well as address open questions related to functions of C/EBPα in differentiation and leukaemogenesis. C/EBPα is an intrinsically disordered protein that exerts its functions through protein interactions. Intrinsically disordered proteins (IDPs) engage in highly dynamic, weak, and multivalent protein interactions, which are mediated by short linear motifs (SLiMs). SLiMs-based protein interactions are difficult to analyse by conventional methods of interactome analysis. However, to understand the connection between the C/EBPα interactome and its functions, analysis in the cellular context is required. The application of the novel biotin ligase TurboID with faster kinetics enabled the analysis of the dynamic interactome of C/EBPα in the process of lymphoid-myeloid transdifferentiation. For most of the interacting proteins, the protein level did not change, yet variable interactions were found, indicating regulated interactions. TurboID identified changes in the composition of the SWI/SNF complex during transdifferentiation, including the exchange of subunits specific for BAF and PBAF subcomplexes, Brg1 and Brm ATPases, and cell type-specific subunits. The analysis also identified the interaction pattern of the histone demethylase Kdm6b and functional assays confirmed its role in transdifferentiation. TurboID enabled the comparative analysis of the interactomes of C/EBPα isoforms and mutants, that alter the balance between differentiation and proliferation and its oncogenic functions.

Kürzlich wurde mithilfe von Ribo-seq Experimenten die Translation hunderter Mikroproteine in menschlichen Herzen entdeckt. Diese blieben zuvor aufgrund ihrer geringen Größe (< 100 Aminosäuren) unentdeckt, und ihre physiologische Rolle ist noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Promotionsarbeit ist es, potentielle Funktionen dieser neuartigen Mikroproteine zu entschlüsseln. Dabei sollen insbesondere die Aufklärung ihrer evolutionären Konservierungssignatur, subzellulären Lokalisierung und ihres Proteininteraktoms helfen. Die Konservierungsanalyse ergab, dass fast 90% der Mikroproteine nur in Primaten konserviert ist. Weiterhin konnte ich die Produktion von Mikroproteine in vitro und in vivo nachweisen, die subzelluläre Lokalisierung von 92 Mikroproteinen definieren, und Interaktionspartner für 60 Mikroproteine identifizieren. Dutzende dieser Mikroproteine lokalisieren in Mitochondrien. Dazu gehörte ein im Herzen angereichertes Mikroprotein, das aufgrund der Interaktions- und Lokalisationsdaten einen neuartigen Modulator der mitochondrialen Proteintranslation darstellen könnte. Der Interaktom-Screen zeigte außerdem, dass evolutionär junge Mikroproteine ähnliche Interaktionsfähigkeiten wie konservierte Kandidaten haben. Schließlich wurden kurze Sequenzmotive identifiziert, die Mikroprotein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, wodurch junge Mikroproteine mit zellulären Prozessen – wie z.B. Endozytose und Spleißen – in Verbindung gebracht werden konnten. Zusammenfassend wurde die Produktion vieler kleiner Proteine im menschlichen Herzen bestätigt, von denen die meisten lediglich in Primaten konserviert sind. Zusätzlich verknüpften umfangreiche Lokalisierungs- und Interaktionsdaten mehrere Mikroproteine mit Prozessen wie Spleißen, Endozytose und mitochondrialer Translation. Weitere Untersuchungen dieses zuvor verborgenen Teils des Herzproteoms werden zu einem besseren Verständnis von evolutionär jungen Proteinen und kardiologischen Prozessen beitragen. / Recently, the active translation of hundreds of previously unknown microproteins was detected using ribosome profiling on tissues of human hearts. They had remained undetected due to their small size (< 100 amino acids), and their physiological roles are still largely unknown. This dissertation aims to investigate these novel microproteins and validate their translation by independent methods. Particularly, elucidating their conservation signature, subcellular localization, and protein interactome shall aid in deciphering their potential biological role. Conservation analysis revealed that sequence conservation of almost 90% of microproteins was restricted to primates. I next confirmed microprotein production in vitro and in vivo by in vitro translation assays and mass spectrometry-based approaches, defined the subcellular localization of 92 microproteins, and identified significant interaction partners for 60 candidates. Dozens of these microproteins localized to the mitochondrion. These included a novel cardiac-enriched microprotein that may present a novel modulator of mitochondrial protein translation based on its interaction profile and subcellular localization. The interactome screen further revealed that evolutionarily young microproteins have similar interaction capacities to conserved candidates. Finally, it allowed identifying short linear motifs that may mediate microprotein-protein interactions and implicated several young microproteins in distinct cellular processes such as endocytosis and splicing. I conclude that many novel small proteins are produced in the human heart, most of which exhibit poor sequence conservation. I provide a substantial resource of microprotein localization and interaction data that links several to cellular processes such as splicing, endocytosis, and mitochondrial translation. Further investigation into this hidden part of the cardiac proteome will contribute to our understanding of recently evolved proteins and heart biology.