Wirbeltierskelette stehen seit langem im Fokus vieler wissenschaftlicher Disziplinen sowie kultureller Überlieferungen, und dies hängt wahrscheinlich mit der erstaunlichen Fähigkeit des Skeletts zusammen, den Tod zu überdauern und der Zersetzung zu widerstehen. Es ist diese Widerstandsfähigkeit des Knochens, die es uns ermöglicht, Evolution der Wirbeltiere anhand des Fossilberichts zu analysieren. Knochengewebe macht heute den Großteil der Wirbeltierskelette aus, doch über den evolutionären Ursprung von Knochen ist wenig bekannt, insbesondere was seine zelluläre Zusammensetzung angeht. Das übergreifende Thema dieser Arbeit ist es, die Evolution von mineralisiertem Gewebe mit besonderem Schwerpunkt auf Knochengewebe besser zu verstehen. Dies geschieht durch verschiedene Methoden von der traditionellen externen Morphologie über die Histologie bis hin zur Röntgen-Computertomographie und schließlich durch die Entwicklung der neuartigen fokussierten Ionenstrahl-Tomographie-Technik (FIB-SEM). Mit Hilfe dieser Methoden wird versucht, die Mikrostruktur fossilen Knochens zu verstehen und aus ihr abzuleiten, wie die heute erkennbarenMorphologien und Physiologien des Knochens entstanden sind. Die zweite Hälfte dieser Arbeit befasst sich mit Paläopathologien und wie sie unser Verständnis der normalen Physiologie durch die Dokumentation pathologisch veränderter Fossilien erweitern können. / Vertebrate skeletons have long been the focus of many scientific disciplines as well as cultural lore, and this is likely due to the amazing ability for the skeleton to survive death and decomposition. It is this resiliency of bone that allows us to to analyze the evolution of vertebrate life in the fossil record. Bone tissue makes up the majority of vertebrate skeletons today, yet little is known about its developmental origins, particularly when it comes to the cellular composition. In this thesis the overarching theme is to better understand the evolution of mineralized tissue with a particular emphasis on bone tissue. This is done through several methodologies from traditional external morphology, to histology, to X-ray computer tomography, and finally with a development of a novel focused ion beam (FIB-SEM) tomography technique. These methods are all employed as an attempt to understand the microstructure of fossil bone from early jawless vertebrates to amniotes and thus deduce how the morphologies and physiologies ascribed to bone today have come about. The second half of this thesis deals with osseous paleopathologies and how they can inform our understanding of normal physiology through the documentation of aberrant fossils.

Die Anordnung von Tiergenomen in topologisch assoziierten Domänen (TADs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Genen. Diese TADs sind Bereiche mit erhöhter Interaktion, die durch kontaktarme Zonen getrennt sind. In Wirbeltieren erfolgt die Bildung von TADs durch die Bindung von Kohäsin und CTCF (CCCTC-bindender Faktor) im Rahmen eines dynamischen Prozesses namens Loop-Extrusion. Dieser Prozess erzeugt Chromatinschleifen, die gestoppt werden, wenn sie auf CTCF-Proteine in einer spezifischen Ausrichtung treffen. Obwohl CTCF in den meisten Bilaterien stark konserviert ist, wurde seine globale architektonische Funktion in Fliegen bisher nicht erforscht. In dieser Studie wurde ein innovativer Ansatz entwickelt, um die evolutionären Aspekte der CTCF-vermittelten 3D-Chromatinorganisation zu untersuchen. Die Auswirkungen des Austauschs von CTCF-Orthologen innerhalb der Bilateriengruppe auf Lebensfähigkeit, Phänotypen, Genexpression, Genomarchitektur und genomweite Bindungsmuster wurden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die nicht-vertebraten Chordatiere C. robusta, unabhängig von der Anwesenheit von CTCF, keine herkömmlichen TAD-Strukturen aufweisen. Dennoch kann das Ciona-Ortholog als Transkriptionsfaktor fungieren, um die Expression bestimmter Gene und die Lebensfähigkeit wiederherzustellen, die bei vollständigem CTCF-Verlust in embryonalen Stammzellen der Maus dysreguliert sind. Dies deutet darauf hin, dass CTCF eine konservierte Rolle als Transkriptionsregulator hat, die über seine bekannte Funktion als architektonisches Protein in einigen Arten hinausgeht. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob CTCF in Ciona das Genom in seiner nativen Umgebung bindet und die Bindung von Kohäsin aufrechterhält. Die Unfähigkeit des CTCF-Orthologs der Maus, Chromatinschleifen im Genom der Fruchtfliege zu erzeugen, legt nahe, dass die Wirbeltier-Version von CTCF allein nicht für eine funktionelle Schleifen-Extrusion ausreicht. Es könnte notwendig sein, dass sie mit Fliegen-Kohäsin oder spezifischen Kofaktoren kompatibel ist. Die Studie zeigt auch subtile Unterschiede in den Bindungsmotiven von CTCF zwischen den Arten. Während die Orthologe der Chordatiere ähnliche Motivstrukturen aufweisen, zeigt das Fliegen-Ortholog eine abweichende Musterpräferenz. Diese Erkenntnisse verdeutlichen die evolutionären Verschiebungen in den Bindungsvorlieben von CTCF in pan-chordaten Linien. Zusammenfassend bietet diese Forschung wertvolle Einblicke in die evolutionäre Bewahrung und funktionelle Divergenz von CTCF-vermittelten Chromatin-Kontakten bei Bilaterien. Sie betont die Bedeutung artspezifischer Faktoren und koevolutionärer Dynamiken bei der Gestaltung der Chromatinorganisation und Genregulation. Weitere Untersuchungen an verschiedenen Arten sind entscheidend, um die Entstehung und Bewahrung der CTCF-vermittelten Chromatinarchitektur im Verlauf der Evolution genau zu verstehen. / The three-dimensional organization of animal genomes, known as topologically associating domains (TADs), is crucial for controlling gene activity. TADs are regions with increased genetic interactions, separated by zones with fewer contacts. In vertebrates, the formation of TADs involves a dynamic process called loop extrusion, where cohesin and CTCFs bind to the chromatin. This process creates chromatin loops, with cohesin complexes pausing when they encounter CTCF molecules in a specific orientation. However, although CTCF is highly conserved among bilaterian species, its vital role in organizing genomes spatially has not been observed in invertebrates like flies. This study investigates the chromatin structure in Ciona robusta, a chordate species situated evolutionarily between well-studied organisms like mice and fruit flies. A unique approach was developed to explore the evolution of CTCF as a mediator of three-dimensional chromatin organization. By swapping CTCF orthologs from representative species across the bilaterian group, the research examined their impact on viability, traits, gene expression, genome architecture, and binding patterns across the genome. The findings indicate that Ciona robusta, a non-vertebrate chordate, lacks typical TAD structures, even in the presence of CTCF. However, although the Ciona ortholog cannot create TADs in mouse embryonic stem cells, it can act as a transcription factor, restoring the expression of specific genes and viability in cases of complete CTCF loss. This suggests that CTCF serves a conserved role as a transcription regulator, beyond its recognized role as a structural component in some species. Furthermore, when the mouse ortholog of CTCF was introduced into the fruit fly genome, it failed to induce the formation of chromatin loops, suggesting that the vertebrate version of CTCF alone is insufficient for effective loop extrusion. Additionally, the study revealed subtle differences in CTCF's binding motif preferences between species. While chordate orthologs shared similar motif structures, the fly ortholog had a distinct pattern. These findings underscore the evolutionary changes in CTCF binding preferences among chordate lineages. In summary, this research offers valuable insights into the evolutionary preservation and functional differences in CTCF-mediated chromatin interactions in bilaterian species. It highlights the significance of species-specific factors and co-evolutionary dynamics in shaping chromatin organization and gene regulation.

Variationen in der Genexpression spielen eine zentrale Rolle bei der evolutionären Divergenz, die zur Speziation führt. Dies wird durch Veränderungen sowohl in nicht-kodierenden cis-wirkenden regulatorischen Elementen (CREs) wie Promotoren und Enhancern als auch in trans-wirkenden regulatorischen Elementen bestimmt. Veränderungen in den regulatorischen Sequenzen können Entwicklungsmuster verändern und wirken als eine der treibenden Kräfte der Evolution der Genexpression. Hier untersuche ich die Anwendung der Einzelzell-Multiomik in der evolutionären vergleichenden Genomik, wobei der Schwerpunkt auf den funktionellen Auswirkungen der Divergenz bei cis-regulatorischen Elementen liegt. Unter Verwendung von Hybrid-Embryonen von Drosophila melanogaster und sechellia generiere ich ein diploides Referenzgenom und führe allelspezifische Einzelzellanalysen von scRNA-seq und scATAC-seq durch. Zusammen können diese beiden komplimentären Ansätze einen integrativen Überblick über die Transkription und die Zugänglichkeit des Chromatins liefern, wodurch CREs identifiziert und mit allelspezifischen Veränderungen in den Genen, die sie regulieren, in Verbindung gebracht werden können. Die computergestützte Rekonstruktion verschiedener Zellidentitäten durch Clustering einzelner Zellen ermöglicht es uns auch zu untersuchen, wie sich das Allel-Ungleichgewicht während der Zelltyp-Spezifikation räumlich verändern kann. Im Gegensatz zu früheren Forschungsarbeiten stelle ich fest, dass Gene, die an der Entwicklung und Musterbildung beteiligt sind, ein unterschiedliches allelisches Ungleichgewicht in der Expression und Zugänglichkeit über die Zelltypen hinweg aufweisen. Diese Arbeit zeigt das Potenzial der Kombination von Einzelzell-Multiomik und artübergreifenden Vergleichen in der vergleichenden Genomik und wirft ein neues Licht auf die Rolle von cis-regulatorischen Elementen in der adaptiven Evolution. / Variation in gene expression plays a pivotal role in the evolutionary divergence that leads to speciation. This is determined by changes in both non-coding cis-acting regulatory elements (CREs) like promoters and enhancers, as well as trans-acting regulatory elements. Changes in regulatory sequences can alter developmental patterns, acting as one of the driving forces behind gene expression evolution. However, poor sequence conservation of CREs makes it challenging to identify them and link changes in regulatory sequences to new phenotypes. Here, I explore the application of single cell multiomics in evolutionary comparative genomics, with a focus on functional effects of divergence in cis-regulatory elements. Using hybrid embryos of Drosophila melanogaster and Drosophila sechellia, I generate a diploid reference genome and conduct single cell allele-specific analysis of scRNA-seq and scATAC-seq data. Together, these two assays can provide an integrative read-out of transcription and chromatin accessibility, allowing CREs to be identified and linked to allele-specific changes (allelic imbalance) in the genes they regulate. The computational reconstruction of different cell identities via single cell clustering also allows us to investigate how allelic imbalance may vary spatially during cell-type specification. In contrast to previous research, I find that genes involved in development and patterning display differential allelic imbalance in expression and accessibility across cell types. In addition, I investigate the role of neurodevelopmental allelic imbalance in the sechellia lineage and identify candidate genes for sechellia-specific adaptations. While highlighting current computational limitations, this thesis demonstrates the potential of combining single cell multiomics and cross-species comparisons in comparative genomics and shedding new light on the role of cis-regulatory elements and mechanisms of adaptive evolution.

Angelerfolg hängt vom Fischverhalten ab und selektiver Fang aufgrund vererbbarer Verhaltensmerkmale kann sich auf Fischpopulationen auswirken. Die anglerische Vulnerabilität ergibt sich aus einer Kombination aus dem Zustand des Fisches, dem Zusammentreffen mit dem Fanggerät und den Eigenschaften desselben. Höhere Aktivität sollte die Begegnungswahrscheinlichkeit mit dem Fanggerät und dadurch die Vulnerabilität steigern. Ziel dieser Arbeit war es zu verstehen, wie Bewegungsmuster die Vulnerabilität durch die Angelfischerei beeinflussen. Dazu habe ich das Verhalten von vier Arten (Karpfen, Cyprinuscarpio, Schleie, Tinca tinca, Barsch, Perca fluviatilis, und Hecht, Esox lucius) in einem See mittels akustischer Telemetrie gemessen. Zudem habe ich verhaltensselektives Angeln auf Benthivore (Karpfen und Schleie) von festen Plätzen mit dem mobilen Angeln auf einen aktiven Raubfisch (Barsch) und einen Lauerjäger (Hecht) verglichen. Barsche wurden gezielt von freiwilligen, unterschiedlich versierten Anglern in GPS-überwachten Booten beangelt, um zu verstehen, wie Anglerfähigkeiten verhaltensbasierte Selektion beeinflussen. Für die individuell wiederholbare Aktivität von Karpfen, Schleie und Barsch lag keine Angelselektivität vor, da das Zusammentreffen mit Fanggeräten in keinem Zusammenhang mit der Vulnerabilität stand. Beim Barsch hingegen hing die Vulnerabilität mit der Habitatwahl zusammen. Die Geschicklichkeit der Angler verstärkte die Selektion durch höhere Mortalität. Für große Hechte mit großem Aktionsradius kann ein auf Begegnungen basierender Mechanismus nicht ausgeschlossen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wichtigsten Verhaltensweisen, die die Vulnerabilität durch die Angelfischerei ausmachen und nach denen eine Selektion erwartet wird, häufig erst nach dem Zusammentreffen von Fisch und Fischer stattfinden. Jedoch kann die Bedeutung dieser Fisch-Fischer Begegnungen für die Vulnerabilität art- und fischereispezifisch sein. / Capturing fish by angling depends on fish behaviour. Selective capture based on heritable behaviours may have ramifications for fish populations and fishing communities, but the behavioural components of angling vulnerability are unclear. Conceptually, vulnerability derives from a combination of a fish’s internal state, gear encounter rate and gear quality. Accordingly, greater activity or space use is expected to increase vulnerability via elevated encounter rates with fishing gear. However, behaviourally selective angling may also interact with angler behaviour (e.g. skill). My aim was to understand the role of fish movement and space use in driving angling vulnerability. I measured the behaviour and angling vulnerability of four species (viz. carp, Cyprinus carpio, tench, Tinca tinca, perch, Perca fluviatilis, and northern pike, Esox lucius) using whole-lake high resolution acoustic telemetry. Perch were targeted by variably skilled anglers in GPS tracked boats to understand how skill affects selection. I have therefore contrasted behaviourally selective angling of benthivores (carp and tench) targeted from fixed angling sites, an active top predator (perch) targeted by searching anglers and an ambush predator (northern pike) targeted by searching anglers. Angling was unselective for repeatable carp, tench or perch activity and movement as encounter was unrelated to vulnerability. Vulnerability related to perch habitat choice as shown by a latitudinal division of captured and uncaptured perch and high skilled anglers only strengthened selection via greater enacted mortality. Finally, large pike with greater space use were most vulnerable to angling and an encounter based mechanism cannot be ruled out. In conclusion, the key behaviours distinguishing angling vulnerability, upon which selection should be expected, frequently operate after a fish-fisher encounter, but the importance of fish-fisher encounters for vulnerability may be species and fishery specific.

Die Arbeit beschreibt ein stochastisches Simulationsprogramm zur Modellierung von Honigbienenpopulationen unter Zuchtbedingungen. Dieses Programm wurde neu implementiert um unterschiedliche Selektionsstrategien zu evaluieren und zu optimieren. In einer ersten Studie wurde untersucht, inwiefern die Vorhersagen, die das Programm trifft, vom verwendeten genetischen Modell abhängt. Hierbei wurde festgestellt, dass das Finite-Locus-Modell dem Infinitesimalmodell in Langzeitstudien vorzuziehen ist. Eine zweite Studie beleuchtete die Bedeutung der sicheren Anpaarung auf Belegstellen für die Honigbienenzucht. Hier zeigten die Simulationen, dass die Zucht mit Anpaarungskontrolle derjenigen mit freier Paarung von Königinnen deutlich überlegen ist. Schließlich wurde in einer finalen Studie der Frage nachgegangen, wie erfolgreiche Zuchtprogramme bei der Honigbiene langfristig nachhaltig zu gestalten sind. Hierbei sind kurzfristiger genetischer Zugewinn und langfristige Inzuchtvermeidung gegeneinander abzuwägen. Durch umfangreiche Simulationen konnten für verschiedene Ausgangspopulationen Empfehlungen für eine optimale Zuchtintensität auf mütterlicher und väterlicher Seite gefunden werden. / The present work describes a stochastic simulation program for modelling honeybee populations under breeding conditions. The program was newly implemented to investigate and optimize different selection strategies. A first study evaluated in how far the program's predictions depend on the underlying genetic model. It was found that the finite locus model rather than the infinitesimal model should be used for long-term investigations. A second study shed light into the importance of controlled mating for honeybee breeding. It was found that breeding schemes with controlled mating are far superior to free-mating alternatives. Ultimately, a final study examined how successful breeding strategies can be designed so that they are sustainable in the long term. For this, short-term genetic progress has to be weighed against the avoidance of inbreeding in the long run. By extensive simulations, optimal selection intensities on the maternal and paternal paths could be determined for different sets of population parameters.

Hohe Telomeraseaktivität bedingt durch genomische TERT-Rearrangements definiert eine Gruppe an Hochrisiko-Neuroblastompatienten mit ungünstiger Prognose. Das Abzielen auf Telomerase ist ein hochpriorisierter Ansatzpunkt in der Therapie, für die es bislang keine klinisch erfolgreichen Inhibitoren gibt. Der Einsatz von epigenetisch wirksamen Histondeacetylase Inhibitoren (HDACi) stellt dabei eine interessante Therapieoption dar. In TERT-rearrangierten Neuroblastomzellen erzielte die Behandlung mit verschiedenen pan-, Klasse I oder spezifischen HDAC1/2 Inhibitoren eine Supprimierung der TERT mRNA Expression und der Telomeraseaktivität. RNA-Interferenz Studien bestätigten, dass HDAC1 und HDAC2 die TERT Expression positiv regulieren. Die transiente Überexpression von TERT zeigte einen partiellen Rescue des HDACi-bedingten anti-proliferativen Effekts. Der präventive und therapeutische Einsatz von HDACi Panobinostat verlangsamte das Xenografttumorwachstum, die TERT-Expression und Telomeraseaktivität in subkutanen NMRI-Foxn1nu/nu Mausmodellen des TERT-rearrangierten Neuroblastoms bei klinisch relevanten Dosen. Dies zeigt das translationale Potential und die klinische Durchführbarkeit der Panobinostat-Behandlung. ChIP Sequenzierung und Methylierungsanalyse zeigten keine bedeutenden Unterschiede der Histonmodifikationen und der Methylierung von CpG Dinukleotiden am TERT Lokus nach Panobinostatbehandlung. Die Inhibierung der de novo RNA Synthese zeigte, dass die Stabilität des TERT mRNA Transkripts nach Panobinostatbehandlung verringert war. Dies deutet darauf hin, dass die reduzierte Transkriptstabilität der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die hohe Telomeraseaktivität in TERT-rearrangierten Neuroblastommodellen durch den Einsatz zugelassener HDACi supprimiert werden kann. / Telomerase activation by genomic TERT-rearrangements defines a subgroup of high-risk neuroblastomas with adverse outcome. Accordingly, telomerase activity presents a high-priority drug target with no currently available clinical inhibitors. It was assessed whether telomerase activity could be inhibited through histone deacetylase (HDAC) inhibition in models of TERT-rearranged neuroblastoma. Treatment with a panel of seven pan-, class I- or specific HDAC1/2 inhibitors suppressed TERT mRNA expression and telomerase activity in TERT-rearranged neuroblastoma cells at clinically achievable concentrations. RNA interference-based studies confirmed that HDAC1 and HDAC2 positively regulate TERT transcript levels. Enforced TERT expression partly rescued the anti-proliferative effect of HDAC inhibition indicating a causal role of TERT suppression in the HDAC inhibitormediated tumor-suppressive phenotype. Panobinostat treatment, in preventive and therapeutic settings, considerably attenuated tumor growth in subcutaneous TERT-rearranged neuroblastoma xenograft models in NMRI-Foxn1nu/nu mice and suppressed TERT transcript levels and telomerase activity at clinically relevant doses, thus demonstrating translational potential and clinical feasibility. ChIP sequencing detected no major differences in the chromatin context of the TERT locus between HDAC inhibitor-treated and control cells. Likewise, HDAC inhibition did not substantially alter the methylation profile in the TERT region. Blocking de novo RNA synthesis, however, reduced TERT mRNA transcript levels in HDAC inhibitor-treated cells, suggesting reduced TERT transcript stability as the underlying molecular mechanism. In summary, high-level telomerase activity caused by genomic rearrangements in neuroblastoma models is suppressed by treatment with clinically approved HDAC inhibitors, suggesting indirect druggability and a potential molecular rationale for therapeutic intervention.

Der mitteleuropäische Wasserfroschkomplex umfasst Pelophylax lessonae (Genotyp LL), Pelophylax ridibundus (RR) und deren Hybriden Pelophylax esculentus (LR), der sich hemiklonal durch Rückkreuzen mit LL in lessonae-esculentus (L-E)-Populationen oder RR in ridibundus-esculentus (R-E)-Populationen reproduziert. Außerdem können Hybriden in reine Hybridpopulationen (E) bilden, in denen triploide Individuen die Elternarten funktionell ersetzen. Bislang ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die der klonalen Gametenbildung in der Keimbahn der Hybridform zugrunde liegen. In dieser Studie wurden erstmalig 160 Gene der Elternarten untersucht, die an der Gametenbildung beteiligt sind. Zusätzlich wurden 131 SNPs von 52 dieser Gene von 652 Wasserfröschen aus 26 Populationen analysiert. Im Ergebnis wurden 14 SNPs von 10 Genen entdeckt, deren Frequenzen mit dem Populationssystem assoziiert waren. In Übereinstimmung mit ihren Funktionen könnten diese Gene im Zusammenheng mit den system-spezifischen hybridogenetischen Reproduktionsmodi stehen. Sowohl transkriptomische als auch SNP-Daten lieferten Hinweise auf genetische Introgression, d. h. einen Transfer lessonae-spezifischer Allelen in den ridibundus-Genpool oder umgekehrt. Außerdem wurde bei P. lessonae eine kryptische genetische Diversität beobachtet. SNP-Analysen ergaben auch, dass LR-Individuen aus E-Populationen eine höhere genetische Ähnlichkeit mit LR-Individuen aus R-E als aus L-E-Populationen aufweisen. Diese Ergebnisse werfen die Frage nach dem Ursprung der E-Populationen auf, von denen bisher angenommen wurde, dass sie aus L-E-Populationen hervorgegangen sind. Die neuen molekularen Daten stehen mit den hemiklonalen Fortpflanzungsmodi von P. esculentus im Einklang und unterstreichen, dass diese wahrscheinlich auf komplexen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Genen und Faktoren basieren. / The Central European water frog complex comprises Pelophylax lessonae (genotype LL), Pelophylax ridibundus (RR), and their hybridogenetic hybrid Pelophylax esculentus (LR), which reproduces by backcrossing with LL in lessonae-esculentus (L-E) populations or RR in ridibundus-esculentus (R-E) populations. In addition, hybrids are able to reproduce in all-hybrid (E) populations in which triploid individuals functionally replace the parental species. To date, little is known about the molecular mechanisms underlying clonal gamete formation in the hybrid germline. In this study, 160 genes from P. lessonae and P. ridibundus known to be involved in gametogenesis were characterized for the first time. In addition, 131 single nucleotide polymorphisms (SNP) from 52 of these genes were analyzed, derived from 652 water frogs of 26 populations. As a result of logistic regressions, 14 SNPs of 10 genes were detected whose frequencies were associated with the population system. Consistent with their functions during gametogenesis, these genes can be considered as candidates associated with the system-specific hybridogenetic modes, i.e. clonal inheritance of the L and/or R genomes. Both transcriptomic and SNP data provided evidence for genetic introgression, i.e. a transfer of lessonae-specific alleles into the ridibundus gene pool or vice versa. In addition, cryptic genetic diversity was observed in P. lessonae. SNP analysis also revealed that LR individuals from E populations exhibit higher genetic similarity to LR individuals from R-E than L-E populations where triploid frogs do not occur. These findings raise the question of the origin of E populations, which were previously thought to have arisen from L-E populations after the emergence of triploid hybrids. The new molecular data are consistent with the reproductive modes of P. esculentus and emphasize that clonal inheritance is most likely caused by complex interactions of different genes and genetic factors.

Die physische Nähe zwischen Genpromotoren und regulatorischen Elementen (Enhancer) spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression, um präzise räumliche und zeitliche Genexpressionmuster während der Embryogenese zu erzeugen. Abhängig von der Aktivität der Zielgene lassen sich zwei Typen von Interaktionen unterscheiden. Zum einen führen dynamische Enhancer-Promoter Interaktionen unmittelbar zur Genexpression, wohingegen in anderen Fällen stabile Interaktionen bereits vor der Genexpression existieren. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der stabilen Interaktion zwischen dem Shh Gen und dem Extremitätenenhancer, der ZRS, während der Embryonalentwicklung in der Maus untersucht. Der Verlust der konstitutiven Transkription, die den ZRS Enhancer abdeckt, führte zu einer Verschiebung innerhalb der Shh-ZRS Kontakte und einer moderaten Reduzierung der Shh Genexpression. Im Gegensatz dazu führte die Mutation von CTCF Bindungsstellen, die den ZRS Enhancer umgeben, zu einem Verlust der stabilen Shh-ZRS Interaktion und einem 50%igen Rückgang in der Shh Genexpression. Dieser Expressionsverlust hatte jedoch keine phänotypischen Auswirkungen in den Deletionsmutanten, was darauf hindeutet, dass die restliche Genaktivität und Enhancer-Promotor-Interaktion über einen zusätzlichen, CTCF-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Erst die kombinierte Deletion von CTCF-Bindungsmotiven und einem hypomorphen ZRS-Allel führte zu einem fast vollständigen Expressionsverlust von Shh und damit zu einem schweren Funktionsverlust und Gliedmaßen-Agenesie. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die stabile Chromatinstruktur am Shh Locus von mehreren Komponenten getragen wird und die physicalische Interaktion zwischen Enhancern und Promotern für eine robuste Transkription während der Embryonalentwicklung benötigt werden. / Long-range gene regulation involves physical proximity between enhancers and promoters to generate precise patterns of gene expression in space and time. However, in some cases proximity coincides with gene activation, whereas in others preformed topologies already exist before activation. In this study, we investigate the preformed configuration underlying the regulation of the Shh gene by its unique limb enhancer, the ZRS, in vivo during mouse development. Abrogating the constitutive transcription covering the ZRS region led to a shift within the Shh-ZRS contacts and a moderate reduction in Shh transcription. Deletion of the CTCF binding sites around the ZRS resulted in a loss of the Shh-ZRS preformed interaction and a 50% decrease in Shh expression but no phenotype, suggesting an additional, CTCF-independent mechanism of promoter-enhancer communication. This residual activity, however, was diminished by combining the loss of CTCF binding with a hypomorphic ZRS allele resulting in severe Shh loss-of-function and digit agenesis. Our results indicate that the preformed chromatin structure of the Shh locus is sustained by multiple components and acts to reinforce enhancer-promoter communication for robust transcription.

Die biotechnologischen Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichen eine immer detailliertere Untersuchung von genetischen und molekularen Markern mit multiplen komplexen Traits. Allerdings liefern vorhandene statistische Methoden für diese komplexen Analysen oft keine valide Inferenz. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit ist, zwei neue statistische Methoden für Assoziationsstudien von genetischen Markern mit multiplen Phänotypen zu entwickeln, effizient und robust zu implementieren, und im Vergleich zu existierenden statistischen Methoden zu evaluieren. Der erste Ansatz, C-JAMP (Copula-based Joint Analysis of Multiple Phenotypes), ermöglicht die Assoziation von genetischen Varianten mit multiplen Traits in einem gemeinsamen Copula Modell zu untersuchen. Der zweite Ansatz, CIEE (Causal Inference using Estimating Equations), ermöglicht direkte genetische Effekte zu schätzen und testen. C-JAMP wird in dieser Arbeit für Assoziationsstudien von seltenen genetischen Varianten mit quantitativen Traits evaluiert, und CIEE für Assoziationsstudien von häufigen genetischen Varianten mit quantitativen Traits und Ereigniszeiten. Die Ergebnisse von umfangreichen Simulationsstudien zeigen, dass beide Methoden unverzerrte und effiziente Parameterschätzer liefern und die statistische Power von Assoziationstests im Vergleich zu existierenden Methoden erhöhen können - welche ihrerseits oft keine valide Inferenz liefern. Für das zweite Ziel dieser Arbeit, neue genetische und transkriptomische Marker für kardiometabolische Traits zu identifizieren, werden zwei Studien mit genom- und transkriptomweiten Daten mit C-JAMP und CIEE analysiert. In den Analysen werden mehrere neue Kandidatenmarker und -gene für Blutdruck und Adipositas identifiziert. Dies unterstreicht den Wert, neue statistische Methoden zu entwickeln, evaluieren, und implementieren. Für beide entwickelten Methoden sind R Pakete verfügbar, die ihre Anwendung in zukünftigen Studien ermöglichen. / In recent years, the biotechnological advancements have allowed to investigate associations of genetic and molecular markers with multiple complex phenotypes in much greater depth. However, for the analysis of such complex datasets, available statistical methods often don’t yield valid inference. The first aim of this thesis is to develop two novel statistical methods for association analyses of genetic markers with multiple phenotypes, to implement them in a computationally efficient and robust manner so that they can be used for large-scale analyses, and evaluate them in comparison to existing statistical approaches under realistic scenarios. The first approach, called the copula-based joint analysis of multiple phenotypes (C-JAMP) method, allows investigating genetic associations with multiple traits in a joint copula model and is evaluated for genetic association analyses of rare genetic variants with quantitative traits. The second approach, called the causal inference using estimating equations (CIEE) method, allows estimating and testing direct genetic effects in directed acyclic graphs, and is evaluated for association analyses of common genetic variants with quantitative and time-to-event traits. The results of extensive simulation studies show that both approaches yield unbiased and efficient parameter estimators and can improve the power of association tests in comparison to existing approaches, which yield invalid inference in many scenarios. For the second goal of this thesis, to identify novel genetic and transcriptomic markers associated with cardiometabolic traits, C-JAMP and CIEE are applied in two large-scale studies including genome- and transcriptome-wide data. In the analyses, several novel candidate markers and genes are identified, which highlights the merit of developing, evaluating, and implementing novel statistical approaches. R packages are available for both methods and enable their application in future studies.

Kürzlich wurde mithilfe von Ribo-seq Experimenten die Translation hunderter Mikroproteine in menschlichen Herzen entdeckt. Diese blieben zuvor aufgrund ihrer geringen Größe (< 100 Aminosäuren) unentdeckt, und ihre physiologische Rolle ist noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Promotionsarbeit ist es, potentielle Funktionen dieser neuartigen Mikroproteine zu entschlüsseln. Dabei sollen insbesondere die Aufklärung ihrer evolutionären Konservierungssignatur, subzellulären Lokalisierung und ihres Proteininteraktoms helfen. Die Konservierungsanalyse ergab, dass fast 90% der Mikroproteine nur in Primaten konserviert ist. Weiterhin konnte ich die Produktion von Mikroproteine in vitro und in vivo nachweisen, die subzelluläre Lokalisierung von 92 Mikroproteinen definieren, und Interaktionspartner für 60 Mikroproteine identifizieren. Dutzende dieser Mikroproteine lokalisieren in Mitochondrien. Dazu gehörte ein im Herzen angereichertes Mikroprotein, das aufgrund der Interaktions- und Lokalisationsdaten einen neuartigen Modulator der mitochondrialen Proteintranslation darstellen könnte. Der Interaktom-Screen zeigte außerdem, dass evolutionär junge Mikroproteine ähnliche Interaktionsfähigkeiten wie konservierte Kandidaten haben. Schließlich wurden kurze Sequenzmotive identifiziert, die Mikroprotein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, wodurch junge Mikroproteine mit zellulären Prozessen – wie z.B. Endozytose und Spleißen – in Verbindung gebracht werden konnten. Zusammenfassend wurde die Produktion vieler kleiner Proteine im menschlichen Herzen bestätigt, von denen die meisten lediglich in Primaten konserviert sind. Zusätzlich verknüpften umfangreiche Lokalisierungs- und Interaktionsdaten mehrere Mikroproteine mit Prozessen wie Spleißen, Endozytose und mitochondrialer Translation. Weitere Untersuchungen dieses zuvor verborgenen Teils des Herzproteoms werden zu einem besseren Verständnis von evolutionär jungen Proteinen und kardiologischen Prozessen beitragen. / Recently, the active translation of hundreds of previously unknown microproteins was detected using ribosome profiling on tissues of human hearts. They had remained undetected due to their small size (< 100 amino acids), and their physiological roles are still largely unknown. This dissertation aims to investigate these novel microproteins and validate their translation by independent methods. Particularly, elucidating their conservation signature, subcellular localization, and protein interactome shall aid in deciphering their potential biological role. Conservation analysis revealed that sequence conservation of almost 90% of microproteins was restricted to primates. I next confirmed microprotein production in vitro and in vivo by in vitro translation assays and mass spectrometry-based approaches, defined the subcellular localization of 92 microproteins, and identified significant interaction partners for 60 candidates. Dozens of these microproteins localized to the mitochondrion. These included a novel cardiac-enriched microprotein that may present a novel modulator of mitochondrial protein translation based on its interaction profile and subcellular localization. The interactome screen further revealed that evolutionarily young microproteins have similar interaction capacities to conserved candidates. Finally, it allowed identifying short linear motifs that may mediate microprotein-protein interactions and implicated several young microproteins in distinct cellular processes such as endocytosis and splicing. I conclude that many novel small proteins are produced in the human heart, most of which exhibit poor sequence conservation. I provide a substantial resource of microprotein localization and interaction data that links several to cellular processes such as splicing, endocytosis, and mitochondrial translation. Further investigation into this hidden part of the cardiac proteome will contribute to our understanding of recently evolved proteins and heart biology.