Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2011. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-08-17T01:12:42Z No. of bitstreams: 2 furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-09-22T18:10:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-22T18:10:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) furg - dissertao maria angelica dos reis garrido pereira.pdf: 911472 bytes, checksum: 983e6452fd9febc8f8a9a026e1fce50b (MD5) Previous issue date: 2011 / O bijupirá (Rachycentron canadum) é um peixe marinho que apresenta bom potencial para seu cultivo. Muitas pesquisas demonstram os efeitos benéficos do probiótico Bacillus spp. na aquicultura, porém não há estudos sobre os efeitos de probióticos em sistemas de recirculação de água (SRA). Este trabalho analisa os efeitos do probiótico Bacillus spp. na performance de larvas de bijupirá criadas em SRA. O experimento foi realizado na Universidade Virginia Tech (EUA). As larvas foram estocadas em dois SRA independentes entre si - tratamento probiótico (TP) e tratamento controle (TC) - na densidade de 15 larvas/L, durante 26 dias após a eclosão. Um dos sistemas (TP) recebeu a adição de probiótico comercial composto por B. subtilis, B. licheniformis e B. pumilus diretamente na água e via alimento vivo, conforme o fabricante. As análises de microbiologia e qualidade de água foram feitas diariamente por medição de parâmetros físico e químicos e plaqueamento em meio de cultura para contagem de Bacillus totais e Vibrio totais. Ao final do experimento foram realizados biometria e contagem total dos animais, teste de resistência ao estresse salino e fixação de larvas para imunohistoquímica do timo para avaliar a expressão dos complexos multirreceptores de antígenos CD3 e CD4 de linfócitos T e morfometria do rim cefálico. A sobrevivência foi similar e de 14,9±2,4% e 15,1±0,9% para TP e TC respectivamente. O peso final foi de 170±10 mg para TP e 160±10 mg TC, não havendo diferença estatística entre os tratamentos. Na microbiologia da água não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos na contagem de víbrios totais (TP: 3.366±522 UFC/mL; TC: 4.964±902 UFC/mL). Na contagem de Bacillus totais os tratamentos diferiram estatisticamente, sendo maior a concentração no TP pela adição dos Bacillus spp. (901±88 UFC/mL e 61±24 UFC/mL). O teste de estresse por salinidade demonstrou uma maior resistência ao estresse salino pelas larvas do tratamento probiótico. A análise imunohistoquímica mostrou uma maior expressão de CD4 no timo em PT (TP: 43,7 ± 6,16% CD4 células/mm²; TC: 25,4 ± 3,5% CD4 células/mm²), o que pode indicar uma melhor resposta imune contra patógenos. A análise morfométrica do rim cefálico indica que este órgão é maior no TP (TP: 0,97 ± 0,33 milímetros; TC: 0,69 ± 0,22 milímetros), provavelmente devido a um aumento na quantidade de linfócitos B. Estes resultados indicam que o probiótico utilizado em um sistema de recirculação de água é efetivo quanto à imunoestimulação e aumenta a resistência ao estresse salino. / Cobia (Rachycentron canadum) is a marine finfish with good potential for mariculture. The aim of this study was to analyze the effects of probiotic Bacillus spp. on the performance of cobia larvae reared in a recirculating aquaculture system (RAS). Many studies have demonstrated the beneficial effects of probiotic Bacillus spp. in aquaculture, but there are no studies on the effects of probiotics in RAS, requiring research on their effectiveness, since in open systems the beneficial effects are already known. The trial was conducted at Virginia Tech VSAREC (USA). Larvae were stocked into two independent RAS - probiotic treatment and control - at a density of 15 larvae L-1, for 26 days after hatching. One of the systems (Probiotic treatment) received the addition of a commercial probiotic consisting of Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus directly into the water and by live feed, according to the manufacturer. At the end of the experiment we performed biometrics, larvae counts, stress test and larvae were fixed for morphometric analysis of head kidney and for immunohistochemistry of thymus to evaluate the phenotypic expression of complex antigens CD3 and CD4 in T-lymphocytes. Survival and final weight had no significant difference between groups. The analysis of water microbiology had no significant differences between treatments in total counts of Vibrio, but in the total count of Bacillus treatments differed statistically, with a higher concentration in Probiotic treatment because of the addition of Bacillus spp. in this group. The salinity stress test was expressed by stress sensitivity index (SSI), which demonstrated a greater resistance to salt stress by larvae of probiotic treatment. Immunohistochemical analysis showed a higher expression of CD4 in Probiotic treatment, which may indicate better immune response against pathogens. The morphometric analysis of head kidney indicates that this organ is larger in Probiotic treatment, probably due to an increase in the quantity of B-lymphocytes. These results indicate that Bacillus spp. probiotics used in RAS may stimulate the immune system and increase the general stress resistance of cobia larvae.

Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos δ, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas. / In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the δ elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.

Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos δ, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas. / In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the δ elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.