Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2827_1.pdf: 3255075 bytes, checksum: 22005ee118cfc8ca27010124cd458070 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras vêm sendo utilizadas como sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse biotecnológico. Dentre as diversas aplicações das proteínas heterólogas, as produzidas com finalidade terapêutica e para diagnóstico clínico vêm recebendo grande destaque, como por exemplo, a lectina frutalina e a oncoproteína E7 do Papilomavírus Humano (HPV). A frutalina, lectina extraída das sementes da fruta-pão, tem sido descrita como importante ferramenta no diagnóstico do câncer devido ao seu tropismo com células tumorais. Enquanto, a oncoproteína viral do HPV, E7, por ser encontrada em células tumorais relacionadas à infecção pelo HPV, torna-se um importante alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra esta infecção. Neste trabalho utilizamos as leveduras Pichia pastoris KM71H e Pichia pastoris GS115 como sistemas de expressão para a produção das proteínas frutalina e E7 do HPV16, respectivamente. A influência da fonte de carbono e do estresse iônico na produção da enzima β-galactosidase pela Kluyveromyces lactis DSM 3795 foi avaliada em diferentes condições de cultivo. Neste trabalho os níveis de frutalina recombinante (13,4 mg.L-1), obtidos pelo processo de batelada alimentada, foi 4 vezes maior que em testes com frascos aerados e a suplementação com elementos traços permitiu o aumento de 2.5 vezes na produção da proteína recombinante. Enquanto, o gene de E7 do HPV16 foi corretamente clonado e integrado ao genoma da P.pastoris GS115, sendo produzido 218,9mg.L-1 da proteína E7 com o peso molecular de 27KDa. A avaliação da influência da fonte de carbono e do estresse iônico na atividade da enzima β-galactosidase pela K. lactis DSM 3795 permitiu selecionar a lactose como a fonte de carbono ideal, pois favoreceu maior atividade específica da enzima (271,0 U.mg-1). Enquanto que, os cátions Na+, K+, Mg2+ potencializaram a atividade da enzima (410,4; 440,1; and 734.71 U.mg-1, respectivamente), o Ca2+ inibiu parcialmente a produção da β-galactosidase. Por fim, apesar da P. pastoris ter se mostrado um sistema eficiente para a produção de proteína heterólogas, ela ainda apresenta algumas limitações. Dessa maneira, o desenvolver estratégias que permitam a otimização de vetores para a produção dessas proteínas, representa um importante alvo no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico, prevenção e tratamento do câncer

Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos δ, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas. / In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the δ elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.

A descoberta das monoxigenases de polissacarídeos líticas dependentes de cobre (LPMOs), que agem em sinergismo com outras enzimas na desconstrução da celulose, gerou um grande interesse da comunidade científica por seu potencial de aplicação na produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos. A busca por essas proteínas auxiliares em microrganismos surgiu como uma estratégia promissora, pois há grande diversidade de isoformas e disponibilidade de sequências genômicas dessas proteínas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo expressar LPMOs recombinantes de origem bacteriana em levedura Komagataella phafii. Foram obtidos clones de K. phafii transformados com 6 genes selecionados a partir de banco de dados. Análises da cinética de expressão proteica por técnica de western blot indicaram secreção apenas da LPMO de 25 kDa codificada pelo gene de Thermobifida fusca YX. Ensaios de produção da LPMO de T. fusca foram realizados em biorreator de 1L e Erlenmeyers de 250 mL e 1000 mL. Nos ensaios em Erlenmeyers houve a detecção da proteína, confirmada por SDS-PAGE e western blot, acompanhado de um alto crescimento microbiano. No ensaio em biorreator não houve detecção da proteína de interesse e o crescimento microbiano foi baixo. Com a confirmação da expressão da LPMO nos ensaios em Erlenmeyers, estes foram parcialmente purificados e avaliados por gel de proteínas e western blot. Os resultados obtidos mostram que o sistema de expressão de K. phafii foi eficiente, expressando a LPMO de T. fusca. / The discovery of copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenase (LPMOs), auxiliary proteins which act in synergy with other enzymes on the cellulose degradation, generated a great interest from the scientific community due to their potential application in biofuels production from lignocellulosic residues. The search for these auxiliary proteins in microorganisms has emerged as a promising strategy because there is a great diversity of isoforms and availability of genomic sequences. Thus, the present work aimed to express bacterial LPMOs in Komagataella phafii. Clones of K. phafii transformed with 6 genes selected from database were obtained. Analysis of protein expression kinetics by western blot technique showed accumulation only of the LPMO of 25 kDa coded by the gene from Thermobifida fusca YX. Production of LPMO from T. fusca was tested in 1 L bioreactor and 250 mL and 1000 mL Erlenmeyer flasks. In Erlenmeyer flasks experiments, there was protein detection, confirmed by SDS-PAGE and western blot, and a high microbial growth. In the bioreactor assay, there was no target protein detection, and microbial growth was low. After confirmation of LPMO expression in Erlenmeyer flasks assays, protein were partially purified and confirmed by protein gel and western blot. Results obtained showed that the expression system of K. phafii was effective, expressing the LPMO from T. fusca.

Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos δ, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas. / In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the δ elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-11T18:07:04Z No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-17T18:15:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-17T18:15:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T18:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Phenylalanine ammonia lyase (PAL) catalyzes the non-oxidative deamination of L-Phe. It is an important enzyme in the production of enantio-pure mixtures of phenylalanine. Besides being important in plant secondary metabolism, PAL has also been used both for industrial applications as in the treatment of leukemia and phenylketonuria. The PAL have high similarity with histidine ammonia lyase (HAL) and it is believed that the PAL originated from HAL. Use of HAL termini sequences, previously obtained from the metagenome of Poraquê Lake (03°57' S, 63°10' W) to produce an engineered enzyme. The HAL assembled from them had its catalytic core exchanged by one which was designed from the previously described PAL sequences. Thus, We aim to shift the HAL activity making it active in the presence of phenylalanine through an easy protocol. Our phylogenetic analysis shows a clear division between plant and fungal PALs, and showed that recombination played a key role in the separation of these groups. In addition, We also observed that PAL catalytic core is conserved despite positive selection operating in protein termini. The recombinant enzyme, mPAL_c1, was produced in insoluble form and was refolded in vitro. mPAL_c1, when using L-Phe as substrate, has a TOPT. of 30°C (at pH 7.5 with 2mM MnCl2), KM of 55μM and Kcat/KM of 0.01633 mM-1s-1. The activity of mPAL_c1 showed about 30% of activity of commercial PAL from Rhodotorula toruloides at 2 mM L-Phe. Activation of mPAL_c1 was tested through substrate concentration rising from 2 mM to 5 mM of L-Phe, and its activity was almost 5 times higher. The results still suggest a histidine ammonia lyase remnant activity. The low catalytic rates are justified due to protein aggregation and misfolding, detected by size exclusion chromatography and by circular dichroism. In summary, our protocol has proved to be useful in protein design. / A fenilalanina amônia liase (PAL) catalisa a desaminação não oxidativa de L-Phe. Ela é uma enzima importante na produção de misturas enântio-puras de fenilalanina. Além de ser importante no metabolismo secundário vegetal, a PAL também tem sido utilizada tanto para aplicações industriais quanto no tratamento de leucemia e fenilcetonúria. As PAL apresentam alta similaridade com as histidina amônia liases (HAL) e acredita-se que as PAL se originaram das HAL. Utilizamos sequências das extremidades de uma HAL, previamente obtidas do metagenoma do Lago Poraquê (03°57' S e 63°10' W) para produção de uma enzima engenheirada. A HAL montada a partir delas teve seu núcleo catalítico trocado por um que foi desenhado a partir de sequências de PAL previamente descritas. Desta forma visamos deslocar as atividades da HAL tornando-a ativa em presença de fenilalanina por meio de um protocolo simplificado. As nossas análises filogenéticas revelam uma divisão clara entre PALs vegetais e fúngicas, e mostram que a recombinação teve um papel fundamental na separação destes grupos. Além disto, também observamos que o núcleo catalítico da enzima é conservado, com relação às extremidades. A enzima recombinante, mPAL_c1, foi produzida sob forma insolúvel e reenovelada in vitro. A mPAL_c1 tendo como substrato a L-Phe, possui uma Topt. de 30°C num pH de 7,5 com 2mM de MnCl2 e um KM de 55μM, VMáx de 15mU e Kcat/KM de 0,01633 mM-1s-1. A atividade da mPAL_c1 se mostrou cerca de 30% da atividade da PAL comercial de Rhodotorula toruloides a 2 mM de L-Phe. A ativação pelo substrato foi de quase 5 vezes quando a concentração de L-Phe foi elevada de 2mM até 5mM. Os resultados sugerem um resquício de atividade de histidina amônia-liase. As baixas taxas catalíticas se justificam devido à agregação e misfolding proteicos, detectados pela cromatografia de exclusão molecular e pelo dicroísmo circular. Por fim, o protocolo estabelecido neste estudo se mostrou útil para a engenharia de proteínas.