Les ribonucléoprotéines Ro humaines sont constituées d'un des 4 ARNs hY et des protéines Ro60 et La, et probablement des protéines RoBP1, PTB et hnRNP K. Certaines maladies autoimmunes affectant les tissus conjonctifs sont caractérisées par la formation d'autoanticorps contre ces ribonucléoprotéines. Aucune fonction n'est attribuée aux RNPs Ro et leur rôle dans la pathogénèse des maladies qui sont associées aux anticorps ciblant ces RNPs reste indéfini. La protéine RoBP1 interagit spécifiquement avec les RNPs Ro contenant Ro60 et hY5.Les particularités biochimiques et immunologiques de ces RNPs Ro suggèrent une fonction particulière qui pourrait être découverte par une meilleure connaissance de la protéine RoBP1. Des travaux antérieurs tentant d'identifier l'homologue fonctionnel de RoBP1 chez la levure suggéraient l'existence de 2 gènes pouvant complémenter pour la perte de RoBP1 dans une souche de levure rendue dépendante de RoBP1. Nous avons confirmé la dépendance à RoBP 1 de cette souche. Cependant, les petites colonies sur milieu riche et l'absence de croissance sur milieu non-fermentable nous ont indiqué des déficiences respiratoires. Un rétrocroisement de cette souche avec une levure sauvage ne nous a pas permis de corriger ces déficiences. De plus, les tests de complémentation non concluants et l'absence de létalité des délétions des 2 gènes (UBC5 et CAF4) contredisent les travaux antérieurs. Donc, aucun homologue fonctionnel de RoBP1 n'est identifié chez la levure. Les gènes codants pour les ARNs hY semblent être présents en une seule copie par génome. Cependant, il existe une abondance de séquences homologues aux ARNs hY dans le génome humain.Les séquences répétées les plus représentées dans le génome proviennent des éléments transposables, dont le rétrotransposon L1. La machinerie de rétrotransposition de l'élément L1 peut être utilisée pour la mobilisation d'autres séquences, comme les éléments Alu, et cette rétrotransposition laisse des marques caractéristiques identifiables dans le génome. L'analyse approfondie des séquences hY génomiques pourrait permettre de découvrir leur origine. À l'aide d'outils bioinformatiques, nous avons identifié 966 pseudogènes dérivés des ARNs hY dispersés dans tous les chromosomes avec une préférence pour les régions riches en gènes. La conservation des séquences et la distribution génomique des pseudogènes hY sont similaires à ceux des éléments Alu et leur apparition serait survenue après la divergence des rongeurs et des primates. L'analyse des séquences nous a permis d'identifier plusieurs caractéristiques suggérant que les pseudogènes hY ont été mobilisés directement par la machinerie de rétrotransposition de L1: queue poly(A), duplications du site cible flanquant le pseudogène, et site d'insertion similaire au site consensus reconnu par l'endonucléase de l'élément L1. Nous avons identifié chez les pseudogènes hY certaines mutations ponctuelles spécifiques au niveau des sites de liaison aux protéines Ro60, La ou hnRNP K. Trois des protéines interagissant avec les RNPs Ro seraient impliquées dans l'épissage (PTB, hnRNP K et RoBP1). Des séquences homologues aux ARN hY se retrouvant dans des introns près de sites d'épissage pourraient recruter ces protéines et moduler l'épissage de l'intron. Nous avons introduit des séquences correspondant aux ARNs hY dans les introns de modèles d'épissage alternatif (hnRNP A1 et Bcl-x) pour vérifier leur impact sur l'épissage. Nous avons observé qu'une séquence hY3 en aval ou en amont de l'exon alternatif du modèle A1 favorise l'exclusion de cet exon; modulation qui est plus importante lorsque la séquence est dans l'orientation opposée au gène. Des expériences de compétition montrent cependant que cette modulation semble être indépendante de l'action d'un facteur agissant en trans . Dans certains cas, la modulation observée est atténuée par la présence dans le mélange d'épissage d'une séquence complémentaire. Contrairement au modèle A1, l'introduction de séquences hY3 introniques influence peu l'épissage in vitro et in vivo du mini-gène Bcl-x.

La phylogénie moléculaire reconstruit des relations de parenté entre unités évolutives, en se basant sur des changements structurels au niveau moléculaire (ADN, protéines). Elle constitue donc un outil précieux pour déchiffrer l'évolution spatio-temporelle de la biodiversité. Le présent travail examine l'histoire évolutive d'un groupe de criquets (Insecta: Orthoptera: Caelifera), par le biais de méthodes phylogénétiques (parcimonie, maximum de vraisemblance et bayésienne) et de datation, appliquées à l'étude de séquences d'ADN nucléaire et mitochondrial combinées. Dans un premier temps, nous étudions la sous-famille Melanoplinae (Orthoptera: Acrididae) et l'une de ses tribus, Podismini, pour éclaircir leur histoire évolutive, la resituer dans un contexte paléobiogéographique, et la mettre en relation avec la taxonomie existante. Dans un deuxième temps, les méthodes de reconstruction phylogénétiques et de datation sont appliquées à l'étude de la dynamique de l'évolution concertée au sein de l'espèce Podisma pedestris, en analysant le polymorphisme intra- et interindividuels de l'ADN ribosomal, i.e. gènes et pseudogènes d'ITS1.

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA. / Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) causes typhoid fever in humans and is considered as an important health problem. Most of our knowledge on the pathogenesis of this bacterium comes from an enteric fever model in mice caused by serovar Typhimurium. Few studies have examined the virulence factors unique to serovar Typhi or the possibility that pseudogenes harbored in its genome may be functional. stg fimbriae are found only within the serovar Typhi genome and contain a premature TAA stop codon in the stgC gene encoding the usher responsible for the assembly of fimbrial subunits at the bacterial surface. Thus, the stg fimbria has been classified among the list of non-functional pseudogenes. The objectives of this study were to assess the involvement of stg fimbriae during interaction with human cells, and then to evaluate the importance of the stgC pseudogene in fimbrial biogenesis. First, stg transcription was evaluated using a lacZ fusion. Despite low expression levels generally observed in rich medium, growth in minimal medium promoted transcription of the operon. Complete deletion of the stgABCD fimbrial operon from S. Typhi was performed by allelic exchange and was complemented on a plasmid. It has been shown that the presence of stg in S. Typhi, S. Typhimurium and E. coli contributes to increased adherence to human epithelial cells. In addition, the fimbriae seem to act as an anti-phagocytic structure during the interaction with macrophages. Thus, the stg operon appears to be functional despite its premature codon, as phenotypes were observed. The second part of this study involved testing the role of the stgC pseudogene in fimbrial biogenesis. Different variants of the operon were generated, cloned into an arabinose inducible vector, and then transformed into afimbriated E. coli strain ORN172. Translocation of the StgD subunit to the cell surface of the different mutants was evaluated using Western blot. This experiment demonstrated that stgC is essential for export of the StgD subunit to the cell surface. The addition of a 6-histidine tag at the C-terminal end of StgC confirmed the complete translation of the gene, despite the premature TAA stop codon. Peptide sequencing revealed the insertion of a tyrosine at this codon. A translational fusion with the green fluorescent protein demonstrated that approximately 0.8% of the mRNA can be translated to allow full production of the usher. This project allowed characterization of a virulence factor unique to S. Typhi and is a step closer towards better understanding of its pathogenesis mechanisms. This is the first demonstration in bacteria of the functionality of a gene which is interrupted by a premature TAA stop codon.

La biologie a connu une extraordinaire révolution avec l'arrivée de nombreux génomes entièrement séquencés. L'analyse de la quantité d'informations disponibles nécessite la création et l'utilisation d'outils informatiques automatisés. L'interprétation des données biologiques prend tout son sens à la lumière de l'évolution. En ce sens, les études évolutives sont incontestablement nécessaires pour donner un sens aux données biologiques. Dans ce contexte, le laboratoire développe des outils pour étudier l'évolution des génomes (et protéomes) à travers les mutations subies. Cette thèse porte sur l'étude spécifique des événements de pertes de gènes unitaires. Ces événements peuvent révéler des pertes de fonctions très instructives pour comprendre l'évolution des espèces. En premier lieu, j'ai développé l'outil GLADX qui mime l'expertise humaine afin d'étudier automatiquement et avec précision les événements de pertes de gènes unitaires. Ces études se basent sur la création et l'interprétation de données phylogénétiques, de BLAST, de prédictions protéiques, etc., dans un contexte automatisé. Ensuite, j'ai développé une stratégie utilisant l'outil GLADX pour étudier à grande échelle les pertes de gènes unitaires au cours de l'évolution du protéome humain. La stratégie utilise d'abord comme filtre l'analyse de groupes d'orthologues fabriqués par un outil de clustérisation à partir du protéome complet de nombreuses espèces. Cette analyse a permis de détecter 6237 pertes de gènes unitaires putatives dans la lignée humaine. L'étude approfondie de ces pertes avec GLADX a mis en évidence de nombreux problèmes liés à la qualité des données disponibles dans les bases de données. / Biology has undergone an extraordinary revolution with the appearance of numerous whole genomes sequenced. Analysis of the amount of information available requires creation and use of automated tools. The interpretation of biological data becomes meaningful in light of evolution. In view of all this, evolutionary studies are undoubtedly necessary to highlight the biological data. In this context, the laboratory develops tools to study the genomes (and proteomes) evolution through all the undergone mutations. The project of this thesis focuses specifically on the events of unitary gene losses. These events may reveal loss of functions very instructive for understanding the evolution of species. First, I developed the GLADX tool that mimics human expertise to automatically and accurately investigate the events of unitary gene losses. These studies are based on the creation and interpretation of phylogenetic data, BLAST, predictions of protein, etc., in an automated environment. Secondly, I developed a strategy using GLADX tool to study, at large-scale, the loss of unitary genes during the evolution of the human proteome. The strategy uses, in the first step, the analysis of orthologous groups produced by a clustering tool from complete proteomes of numerous species. This analysis used as a filter, allowed detecting 6237 putative losses in the human lineage. The study of these unitary gene loss cases has been deepened with GLADX and allowed to highlight many problems with the quality of available data in databases.

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA. / Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) causes typhoid fever in humans and is considered as an important health problem. Most of our knowledge on the pathogenesis of this bacterium comes from an enteric fever model in mice caused by serovar Typhimurium. Few studies have examined the virulence factors unique to serovar Typhi or the possibility that pseudogenes harbored in its genome may be functional. stg fimbriae are found only within the serovar Typhi genome and contain a premature TAA stop codon in the stgC gene encoding the usher responsible for the assembly of fimbrial subunits at the bacterial surface. Thus, the stg fimbria has been classified among the list of non-functional pseudogenes. The objectives of this study were to assess the involvement of stg fimbriae during interaction with human cells, and then to evaluate the importance of the stgC pseudogene in fimbrial biogenesis. First, stg transcription was evaluated using a lacZ fusion. Despite low expression levels generally observed in rich medium, growth in minimal medium promoted transcription of the operon. Complete deletion of the stgABCD fimbrial operon from S. Typhi was performed by allelic exchange and was complemented on a plasmid. It has been shown that the presence of stg in S. Typhi, S. Typhimurium and E. coli contributes to increased adherence to human epithelial cells. In addition, the fimbriae seem to act as an anti-phagocytic structure during the interaction with macrophages. Thus, the stg operon appears to be functional despite its premature codon, as phenotypes were observed. The second part of this study involved testing the role of the stgC pseudogene in fimbrial biogenesis. Different variants of the operon were generated, cloned into an arabinose inducible vector, and then transformed into afimbriated E. coli strain ORN172. Translocation of the StgD subunit to the cell surface of the different mutants was evaluated using Western blot. This experiment demonstrated that stgC is essential for export of the StgD subunit to the cell surface. The addition of a 6-histidine tag at the C-terminal end of StgC confirmed the complete translation of the gene, despite the premature TAA stop codon. Peptide sequencing revealed the insertion of a tyrosine at this codon. A translational fusion with the green fluorescent protein demonstrated that approximately 0.8% of the mRNA can be translated to allow full production of the usher. This project allowed characterization of a virulence factor unique to S. Typhi and is a step closer towards better understanding of its pathogenesis mechanisms. This is the first demonstration in bacteria of the functionality of a gene which is interrupted by a premature TAA stop codon.