Orientador: José Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_FabianaHelenaForte_M.pdf: 6688953 bytes, checksum: ffe979c84bdddab601e6a550b2872ebb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Brasil é o maior produtor de citros no mundo, entretanto, várias doenças ameaçam a citricultura brasileira, dentre elas o cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A doença é caracterizada por necrose e lesões eruptivas. Sabe-se que a bactéria transloca proteínas efetoras para o interior da célula hospedeira e modula a transcrição na planta. Dentre as proteínas translocadas está à proteína PthA que por si só é capaz de induzir hiperplasia e hipertrofia tecidual. Em relação aos genes cuja expressão foi induzida pela infecção por X. citri estão àqueles envolvidos na remodelação da parede celular, síntese, mobilização e sinalização de auxina e giberelina, os quais são os principais hormônios vegetais controladores de crescimento celular. Corroborando com isso, tanto auxina como giberelina ativam a expressão de celulases e expansinas e são necessárias para o desenvolvimento do cancro cítrico. Em 2010 demonstrou-se a interação entre PthAs e a proteína ARF ("auxin response fator") de Citrus sinensis (CsARF), um possível repressor da via de auxina. O promotor do gene da expansina de citros (CsEXP), cujo gene foi induzido por X. citri e auxina contêm uma sequência similar aos chamados AuxRe, elementos cis-regulatórios de resposta à auxina, localizado adjacentemente ao provável TATA-"box". Sendo assim, analisou-se a região 5' a montante do gene CsEXP de C. sinensis a fim de saber se este representa de fato o promotor mínimo do gene e se o "box AuxRE-like" funciona como elemento regulatório de resposta à auxina. No ensaio de transformação de CsEXP para ativação do gene repórter GUS, a região promotora foi responsiva à auxina, havendo, portanto uma regulação positiva do gene pelo hormônio. Há uma interação (sinergismo) entre a proteína PthA2 e/ou PthA4 com auxina na regulação da transcrição. Esta região que contém o "box AuxRE-like" possui uma sequência TGTCTA a qual está justaposta ao possível TATA-box no promotor do gene podendo se tratar de uma região de provável co-interação entre as duas proteínas. As proteínas CsARF e PthA2, em ensaios gel "shift", demonstraram afinidade por esta região, o que corrobora com a hipótese de co-interação nessa região. Os resultados demonstram que esta região do DNA mostra se como importante alvo de estudo, envolvendo interações correlacionadas com o desenvolvimento da doença / Abstract: Brazil is the biggest in the world in the citrus production, but many diseases threaten the Brazilian citrus cultivation, among them the citric canker, a disease characterized by hyperplastic lesions on the host surface, having Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) as the causal agent of citrus canker. It is known that the bacterium translocates effector proteins into the host cell to modulate transcription in the plant, including the PthA protein which itself is capable of inducing tissue hyperplasia and hypertrophy. Recently, it was shown that X. citri induces the expression of genes involved in cell wall remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellic acid, main plant hormones controlling cell growth and division. Furthermore, auxin and gibberellin are capable to activate the expression of cellulases and expansins and both of them are necessary for the development of citrus canker. Moreover, we verified the interaction between PthA and the protein ARF (auxin response factor) of Citrus sinensis (CsARF), and that promoter of the gene of expansins citrus (CsExp) it was induced by X. citri and auxin, which contains a sequence similar to known AuxRe, cis-regulatory elements in response to auxin, located adjacent to the probable TATA-box. Therefore, we analyzed the 5' region upstream of the gene CsExp of C. sinensis in order to know if in fact represents the minimal promoter of the gene and if AuxRE-box-like functions as regulatory element in response to auxin._ In the test transformation of CsEXP for activating GUS, the promoter region was responsive to auxin, the results were promising, because the minimal promoter of the gene was responsive to auxin in vivo assays, which have confirmed the activation of the reporter gene by auxin, with therefore an upregulation of the gene by the hormone. There is a synergy between the proteins PthA2 and PthA4 with auxin in the regulation. This region contains the AuxRE-like-box which has a sequence TGTCTA which is juxtaposed to the potential TATA-box within the promoter of the gene, possibly being a region of likely joint-interaction for the two proteins._PthA2 and CsARF Proteins in gel shift tests demonstrated affinity for this region, which could confirms the hypothesis of the region to be a region of jointinteraction. The results were significant and this region of the DNA shown to be an important target for study of interactions likely correlated with the development of the disease / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:36:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_MarianeNoronha_D.pdf: 24489370 bytes, checksum: 8029060db192a79e81b19764465f2ca7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), constitui uma doença que afeta a maioria das espécies do gênero Citrus ocorrendo praticamente em todos os continentes e se destaca como uma ameaça à citricultura brasileira. A bactéria utiliza a proteína efetora do tipo III PthA para modular a transcrição na planta hospedeira e promover o desenvolvimento dos sintomas da doença. PthA pertence a família AvrBs3/PthA e contém um domínio central de repetições de 34 aminoácidos que media interações proteína-proteína e proteína-DNA. Elucidar como a PthA ativa a transcrição é de grande importância para o esclarecimento do seu modo de ação e da patogenicidade de Xac. Este trabalho teve como principal objetivo confirmar in vivo e in vitro interações entre PthA de Xac e proteínas de laranja doce selecionadas num screening de duplo-híbrido em leveduras. Além da interação com a proteína ?-importina, conhecida por mediar a importação nuclear de AvrBs3, são descritas neste trabalho interações de PthA com proteínas de citros envolvidas no enovelamento e ubiquitinação do tipo K63. PthAs 2 e 3 interagem preferencialmente com uma ciclofilina (Cyp) de citros e com TDX, uma proteína que contém um domínio tetratricopeptídeo (TPR) e um domínio tiorredoxina (TRX). Constatou-se que PthAs 2 e 3, e não 1 e 4, interagem com um complexo de conjugação a ubiquitina formado por Ubc13 e uma enzima de conjugação a ubiquitina variante (Uev) requerido para o processo de ubiquitinação K63 e no reparo de DNA lesionado. Cyp, TDX e Uev interagem entre si e as proteínas Cyp e Uev estão localizadas no núcleo de células de planta, assim como as variantes de PthA de Xac. Além disso, Ubc13 e Uev complementam o fenótipo de reparo no DNA de cepas de leveduras mutantes, indicando que estão envolvidas em processos de ubiquitinação K63 e reparo no DNA. Como PthA2 afetou o crescimento de cepas de levedura na presença de um agente alquilante do DNA, sugere-se que PthA2 inibe ubiquitinação K63 requerida em vias de reparo aos danos no DNA, e não é alvo deste processo como acreditava-se inicialmente. A proteína Cyp de citros também foi capaz de complementar o fenótipo de leveduras mutantes na maquinaria transcricional, de tal forma que PthAs poderiam aumentar as taxas de transcrição através da modulação da atividade de um complexo proteico associado com controle da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a disease that affect most species of the genus Citrus occurring in virtually every continent, and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The bacterium uses a type III effector protein PthA to modulate transcription in the host plant and promote the development of disease symptoms. PthA proteins belong to the AvrBs3/PthA family and carry a domain comprising tandem repeats of 34 amino acids that mediates protein-protein and protein-DNA interactions. Elucidate how PthA activates transcription is of great importance for the elucidation of its mode of action and pathogenicity of Xac. This study aimed to confirm in vivo and in vitro interactions between Xac protein PthA and sweet orange proteins in a yeast two-hybrid screening. Here, in addition to the interaction with the ?- importin protein, known to mediate the nuclear import of AvrBs3, we described new interactions of PthAs with citrus proteins involved in folding and K63-linked ubiquitination. PthAs 2 and 3 preferentially interact with a citrus cyclophilin (Cyp) and with TDX, a tetratricopeptide domaincontaining thioredoxin. It was found that PthAs 2 and 3, but not 1 and 4, interact with the ubiquitinconjugating enzyme complex formed by Ubc13 and ubiquitin-conjugating enzyme variant (Uev), required for K63-linked ubiquitination and DNA repair. We show that Cyp, TDX and Uev interact with each other, and that Cyp and Uev localize to the nucleus of plant cells. Furthermore, the citrus Ubc13 and Uev proteins complement the DNA repair phenotype of the yeast mutants, strongly indicating that they are also involved in K63-linked ubiquitination and DNA repair. How PthA2 affected the growth of yeast cells in the presence of a DNA damage agent, suggests that PthA2 inhibits K63-linked ubiquitination required for DNA repair, and is not the target of this process as it was believed initially. The citrus protein Cyp was also able to complement the phenotype of yeast mutants in the transcriptional machinery, such that PthAs could increase the rates of transcription by modulating the activity of a protein complex associated with control of transcription / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_TiagoAntoniode_M.pdf: 8040684 bytes, checksum: 0b9836df8d96343f09503df5056436cd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é uma doença que afeta a maioria das espécies do gênero Citrus, ocorrendo praticamente em todos os continentes, e se destaca como uma das ameaças à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual Xac causa o cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria ao infectar a planta, utiliza o sistema secretório tipo ??? (TTSS) para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas PthAs da família AvrBs3/PthA. Quando expresso na célula hospedeira, PthA induz lesões características do cancro como hipertrofia e hiperplasia. Estudos recentes demonstram que membros dessa família atuam como fatores de transcrição. Portanto, a elucidação de como PthA ativa a transcrição é de grande importância para o entendimento do seu mecanismo de ação e desenvolvimento das lesões do cancro. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo caracterizar interações entre a proteína PthA de Xac e as proteínas CsARF (Auxin Response Factor) e CsHMG (High-mobility group) de laranja doce (Citrus sinensis), previamente identificadas em ensaios de duplo híbrido de leveduras. CsARF tem elevada similaridade com AtARF2, um repressor transcricional envolvido na via de sinalização por auxinas. Hormônios vegetais desempenham um importante papel na interação planta-patógeno e em nosso laboratório verificamos que auxinas são importantes para o desenvolvimento dos sintomas do cancro. CsARF foi capaz de interagir com a maioria das variantes de PthA tanto in vitro quanto em ensaios de duplo-híbrido de leveduras. A interação de CsARF com PthA se dá através dos domínios C-terminal Aux/IAA e B3 de ligação ao DNA. Verificamos que o promotor do gene de uma expansina de citros, induzido por Xac e auxina, apresenta possíveis sítios de ligação das proteínas CsARF e PthA. Dados de EMSA indicam que PthA e CsARF ligam em sítios adjacentes no promotor da expansina de citros e que a interação de PthA com CsARF poderia deslocá-la do promotor. A proteína CsHMG é semelhante a AtHMGB1 de Arabidopsis thaliana, envolvida em crescimento celular. CsHMG interagiu com todas as variantes de PthA, sendo que essa interação envolve uma região rica em leucinas (LRR), idêntica nas quatro variantes de PthA. Verificou-se também que CsHMG é capaz de ligar DNA de forma inespecífica. Por outro lado, CsHMG ligou RNA in vitro, com especificidade para RNAs ricos em uridina (poly-U). Como PthA age como fator de transcrição eucarioto, não é surpreendente que proteínas do hospedeiro envolvidas com regulação gênica sejam capazes de interagir com esse efetor, sugerindo um novo modo de ação de proteínas efetoras bacterianas. / Abstract: Citrus canker disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), affects almost all citrus species and represents a major threat to the Brazilian citriculture. The molecular mechanism by which Xac causes citrus canker disease is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins through a type III secretion system (TTSS) including proteins of AvrBs3/PthA family proteins. When transiently expressed in host cells, PthAs alter transcription of the host cell to the benefit of the pathogen, leading to the development of the cancer lesions, including hypertrophy and hyperplasia. These proteins are thought to acts as eukaryotic transcriptional factors, binding and activating directly promoters of host genes. Therefore, elucidating how activates PthA transcription is very important to understanding the mechanisms governing the development of canker lesions. To elucidate how PthA activates transcription and to establish its molecular mode of action, a two-hybrid approach was used to identify host proteins that interact with PthA and therefore could be important for the development of the canker lesions. Among the citrus proteins identified, we selected for studies a CsARF (Auxin Response Factor) and a CsHMG (High-mobility group), both involved in regulation of gene transcription. CsARF shares high similarity to the Arabidopsis thaliana ARF2, involved in the auxin signaling pathway. This is in line with our previous studies showing that auxin is required for canker development. The interactions between all variants of PthA were analyzed both in vivoand in vitro and depend on the repeat domain of PthAs. The B3 DNA binding and the Aux/IAA domains of CsARF are both involved in protein-protein interactions. Interestingly, the citrus promoter of a citrus expansin gene that is up-regulated by Xac and auxin contains putative CsARF and PthA binding sites. Since these sites are located adjacent in this promoter, it is suggested that the interaction of PthA with CsARF might somehow affect the regulation of the expansin promoter. CsHMG is highly similar to the A. thaliana HMGB1 involved in cell growth. CsHMG interacts with all PthA variants and its interaction was shown to be mediated primarly by the leucine-rich repeat (LRR) region of PthAs. CsHMG binds to DNA in a non-specific fashion; surprisingly, however, CsHMG shows an as yet unreported ability to bind to synthetic RNA forms with an apparent specificity to poly-U probes. PthA acts like an eukaryotic transcription factor and is not surprising that host proteins involved with gene regulation can interact with this effector, suggesting a new mode of action of these bacterial effector proteins. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T05:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_BrunaMedeia_D.pdf: 41386343 bytes, checksum: 8048b677c8a43e7438a1c349c584b9ec (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia induzida pela bactéria. A patogenicidade de Xac é dependente do sistema secretório tipo III, que transloca proteínas efetoras pertencentes à família AvrBs3/PthA para dentro da célula hospedeira. Estudos recentes mostram que PthAs funcionam como fatores de transcrição no hospedeiro, transativando genes específicos da planta que irão beneficiar a bactéria ou desencadear uma resposta de defesa. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação de PthAs como ativadores da transcrição, nosso laboratório identificou, através da técnica de duplo-híbrido, várias proteínas de laranja (Citrus sinensis) que interagiram com diferentes PthAs. Entre elas, destacamos uma ciclofilina (CsCyp), que realiza isomerização de resíduos de prolina, uma proteína com domínio tioredoxina (CsTdx), relacionada com interação proteína-proteína e redução de pontes dissulfeto e uma cisteína protease (CsCP), envolvida na resposta de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de CsCyp. A resolução da estrutura de CsCyp mostrou que CsCyp pertence ao grupo de ciclofilinas divergentes que possuem um loop adicional (KSGKPLH), duas cisteínas invariáveis (C40 e C168) e um glutamato (E83) conservado. Este último interage com resíduos do loop, estabilizando-o. A função destes elementos era desconhecida até o momento e o trabalho visou elucidar sua atuação na regulação da atividade PPIase da proteína. Neste trabalho, verificamos que C40 e C168 formam uma ponte dissulfeto. Dados de modelagem e simulação suportaram a hipótese de que a formação da ponte dissulfeto induz mudanças conformacionais que quebram a interação do E83 com o loop divergente, levando ao fechamento do sítio ativo de CsCyp. O estudo descreveu, portanto um mecanismo de regulação redox, que controla a atividade PPIase da proteína. Adicionalmente, mostrou-se que CsTdx interage com CsCyp através dos resíduos conservados C40 e C168, sendo críticos para tal interação. Foi mostrado também que CsCyp interage com o domínio C-terminal (CTD) da RNA Polimerase II (RNA Pol II), especificamente com a repetição YSPSAP. Surpreendentemente, através da transformação de plantas com construções para silenciamento e superexpressão de CsCyp, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsCyp apresentaram um aumento dos sintomas do cancro cítrico quando infiltradas com Xac, enquanto que plantas com níveis aumentados de CsCyp apresentaram sintomas reduzidos quando infiltradas com Xac, indicando que CsCyp tem papel importante no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. Este trabalho também mostra a expressão e purificação das proteínas CsTdx e CsCP e a comprovação de que CsCP interage com PthAs 2 e 3 através de ensaios de duplo-híbrido / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the bacteria. Xac pathogenicity is dependent on a type III secretory system that translocates effector proteins which belongs to AvrBs3/PthA family inside the host cell. Recent studies showed that these proteins work as transcriptional factors that transactivate specific plant genes which will either benefit the bacteria or trigger defense response. To gain insights into PthA mechanism of action as transcription activators, our laboratory identified that PthA targeted the citrus protein complex comprising the thioredoxin CsTdx, ubiquitin-conjugating enzymes CsUev/Ubc13 and cyclophilin CsCyp. Also, we showed previously that the CsCyp binds the citrus thioredoxin CsTdx and the C-terminal domain of RNA Polymerase II (CTD), and that CsCyp complements the function of Cpr1 and Ess1, two yeast prolyl-isomerases that regulate transcription by the isomerization of proline residues of the regulatory C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. In this work we solved the 3D structure of CsCyp in complex with its inhibitor cyclosporine A (CsA), showing that CsCyp is a divergent cyclophilin that carries the additional loop KSGKPLH, invariable cysteines C40 and C168, and conserved glutamate E83. Despite the suggested roles in ATP and metal binding, the function of these unique structural elements remains unknown. Here we show that the conserved cysteines form a disulfide bond that inactivates the enzyme, whereas E83, which belongs to the catalytic loop and is also critical for enzyme activity, is anchored to the divergent loop to maintain the active site open. In addition, we demonstrate that C40 and C168 are required for the interaction with CsTdx and that CsCyp binds the citrus CTD YSPSAP repeat. Our data support the model where formation of the C40- C168 disulfide bond induces a conformational change that disrupts the interaction of the divergent and catalytic loops, via E83, causing the active site to close. This suggests a new type of allosteric regulation in divergent cyclophilins, involving disulfide bond formation and a loop displacement mechanism. Moreover, we present evidence that PthA2 inhibits the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity of CsCyp in a similar fashion as CsA, and that silencing of CsCyp, as well as treatments with CsA, enhance canker lesions in Xac-infected leaves. Given that CsCyp appears to function as a negative regulator of cell growth and that Ess1 negatively regulates transcription elongation in yeast, we propose that PthAs activate host transcription by inhibiting the PPIase activity of CsCyp on the CTD / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AndreLuizAraujo_D.pdf: 43759919 bytes, checksum: 379266575f1db46c7d620232efb9ba13 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico resulta da interação compatível entre a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e Citrus spp. A doença não tem cura, é de fácil disseminação e difícil controle. O cenário é preocupante, pois a doença diminui drasticamente o rendimento e a qualidade dos frutos de plantas infectadas, ocasionando um forte impacto econômico na citricultura mundial. Os principais sintomas do cancro cítrico, resultantes dos processos de hipertrofia (aumento do volume celular) e hiperplasia (aumento da divisão celular), são dependentes da proteína efetora PthA de X. citri. PthA integra a família de fatores de transcrição conhecida como efetores ativadores de transcrição (transcription activator-like ou TAL). O principal homólogo de PthA é o efetor AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria que atua regulando a transcrição de genes do hospedeiro em benefício do patógeno. A similaridade entre estas proteínas gira em torno de 97%, sugerindo, portanto, função semelhante para PthA. Através de uma série de microarranjos, investigou-se o perfil de expressão gênica de laranja doce (Citrus sinensis) dependente de PthA (X. citri) e de PthCs de X. aurantifolii, uma bactéria que causa cancro cítrico apenas no limão galego e que, em laranja doce, induz uma reação de hipersensibilidade. Desta forma, verificou-se a regulação positiva ou negativa de uma série de genes. Os PthCs regularam negativamente genes associados à sinalização por auxina e induziram a expressão de genes de defesa e silenciamento gênico. Em contrapartida, PthAs induziram uma série de genes intimamente relacionados aos sintomas de cancrose, incluindo: genes associados aos processos de aumento e divisão celular, síntese e remodelamento de parede celular, bem como genes envolvidos na sinalização por auxina e giberelina. Neste sentido, efetuou-se o isolamento de regiões promotoras de cinco genes, os quais são potencialmente regulados por PthA. A análise destas regiões revelou a presença de um possível TATA-box notavelmente semelhante àquele encontrado no gene upa20, denominado UPA-box (up-regulated por AvrBs3), sugerindo que estes genes poderiam ser transativados por PthA em citros. De fato, ensaios de retardamento de mobilidade eletroforética (electrophoretic mobility shift assay ou EMSA), demonstraram a ligação específica de PthA2 e 4 ao TATA-box encontrado na região promotora do gene que codifica uma proteínas relacionada à patogênese (pathogenesis-related proteins ou PR). Este resultado corrobora com a hipótese de que os efetores TAL atuam como proteínas ligadoras de elementos TATA. Finalmente, experimentos de co-imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e cotransformação demonstraram, ainda que em resultados preliminares, que particularmente PthA4 é capaz de transativar pr5 in planta. Embora o cancro cítrico ainda não seja completamente entendido a nível molecular, os dados aqui apresentados sugerem fortemente a ação de PthAs como fatores de transcrição, bem como aponta candidatos à regulação positiva intimamente associados aos processos de hipertrofia e hiperplasia. Além disso, as regiões promotoras aqui isoladas podem ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para a geração de plantas resistentes à cancrose / Abstract: Citrus canker is a result of a compatible interaction between Xanthomonas axonopodis pv. citri and Citrus spp. There is no cure for citrus canker, and the disease is easily spread and difficult to be managed. The scenario is threatening since the disease dramatically diminishes the quality of fruits in infected plants leading to great economic losses for the world citrus producers. The main citrus canker symptoms known as hypertrophy (cell enlargement) and hyperplasia (cell division) are PthA-dependent. PthA is an effector protein from X. citri which belongs to the TAL effectors (transcription activatorlike) family. The closest homologue of PthA is AvrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, a TAL effector that acts as a transcriptional factor to modulate host transcription to the pathogen's benefit. Similarity shared by these two proteins is around 97%, suggesting that PthA plays a similar role in the citrus host. Through a number of microarray experiments, we investigate the gene transcription in sweet orange (Citrus sinensis) in response to the transient expression of PthA from X. citri or PthC from X. aurantifolii, pathotype C, a bacteria that causes citrus canker in Mexican lime but in orange trigger a hypersensitive response in sweet orange. We observed that PthCs down-regulated various auxin signaling genes and induced the expression of genes involved in defense and gene silencing. On the other hand, PthAs induces several genes implicated in canker development such as cell division and elongation, cell-wall synthesis and remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellin. Promoter regions of PthA-induced genes were isolated and shown to have predicted PthA and PthC binding sites at or near their putative TATA boxes. Moreover, competition gel shift assays confirmed that PthA4 shows preferential binding to the TATA box of the pathogenesis-related (pr5) gene promoter, supporting the idea that TAL effectors may act as general TATA-binding proteins. Finally, both chromatin immunoprecipitation (ChIP) and co-transformation assays demonstrated however as preliminary results, that PthA4 is able to transactivate pr5 in planta. Albeit the molecular mechanism by which citrus canker develop remains elusive at the molecular level, we provided data supporting the notion that PthA acts as a transcriptional factor, as well as identified PthA-induced genes associated with hypertrophy and hyperplasia. Furthermore, the promoter regions isolated here might be useful to obtain citrus plants resistant to the canker bacteria / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soprano_AdrianaSantos_D.pdf: 24018757 bytes, checksum: 29724fbb81a588e3bb656bf4c2df3390 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular