CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480  2 Da, 12.864  1 Da and 12,633  1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80 C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60 C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica e biolÃgica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteÃnas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade, via de regra, està em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, mÃltiplos processos patolÃgicos cardiovasculares e inflamatÃrios, principalmente de natureza crÃnica e recorrente, despertam o interesse da comunidade cientÃfica por requererem uma maior variedade de fÃrmacos para alternativas terapÃuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com aÃÃo vasorrelaxante e anti-inflamatÃria. Assim, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por monossacarÃdeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). SDS-PAGE revelou trÃs bandas, correspondentes a trÃs cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480Â2 Da, 12,864Â1 Da e 12,633Â1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV à Ãtima nos pH 7.0 a 9.0, estÃvel a uma temperatura de 80 ÂC, e nÃo à afetada pelo EDTA. ConV nÃo demonstrou toxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participaÃÃo do domÃnio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificaÃÃo de glicoproteÃnas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um Ãnico passo atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionizaÃÃo por eletropulverizaÃÃo. Em comparaÃÃo com a massa molecular mÃdia das cadeias α, a sequÃncia parcial de aminoÃcidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequÃncia total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarÃdeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). AlÃm disso, CoxyL mostrou ser termoestÃvel a 60 C, e sua atividade à Ãtima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em nÃuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O resÃduo (torta) obtido apÃs a extraÃÃo de Ãleo das sementes de pinhÃo-manso (Jatropha curcas) para a produÃÃo de biodiesel à tÃxico. Apesar dos entraves relacionados à sua utilizaÃÃo na alimentaÃÃo animal, existem evidÃncias de que esse resÃduo tem grande potencial de utilizaÃÃo biotecnolÃgica graÃas ao arsenal de molÃculas que o constitui. Assim, o presente trabalho teve como foco a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de um inibidor de tripsina da torta de pinhÃo-manso, vislumbrando um maior aproveitamento desse resÃduo. A anÃlise da composiÃÃo centesimal revelou ser a torta de pinhÃo-manso composta principalmente por proteÃnas (37,21%), fibras (34,26%) e lipÃdios (19,16%). O extrato bruto obtido a partir da torta sob condiÃÃo alcalina (tampÃo borato de sÃdio 100 mM, pH 10,0) mostrou a presenÃa de lectina (319,76 UH/gF), inibidor de papaÃna (1.287,38 UI/gF), protease (2,69 UA/gF) e, principalmente, de inibidor de tripsina (1.649,7 UI/gF). O inibidor de tripsina, denominado JcTI, foi purificado do extrato bruto por fracionamento com Ãcido tricloroacÃtico (2,5%) seguido de cromatografias de afinidade (tripsina-sepharose-4B) e de exclusÃo molecular (sephacryl S-200). JcTI à uma glicoproteÃna (6,4% de carboidratos) com massa molecular na faixa de 20-21 kDa, pI de 6,6, sequÃncia NH2-terminal (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) exibindo similaridade em torno de 60% com albuminas vegetais e altamente estÃvel ao calor, salinidade e pH. JcTI (500 Âg/mL) retardou o crescimento de vÃrios fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola, incluindo Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum e Fusarium solani. Esse inibidor tambÃm mostrou atividade antibacteriana frente a bactÃrias patogÃnicas ao homem, tais como Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis e Staphylococcus aureus, com concentraÃÃo inibitÃria mÃnima inferior a 5 Âg/mL. Os resultados obtidos demonstram o potencial do JcTI para aplicaÃÃo biotecnolÃgica como uma nova proteÃna de defesa contra fungos fitopatogÃnicos e bactÃrias patogÃnicas ao homem. / The residue (cake) obtained after the extraction of oil from jatropha (Jatropha curcas) seeds for biodiesel production is toxic. Despite of the obstacles related to its use in the animal feed, there are evidences that this residue has great potential for biotechnology applications due to its arsenal of molecules. Thus, the present study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor from jatropha cake, in order to make a better use of this residue. The centesimal composition analysis showed to be the jatropha cake mainly composed of proteins (37.21%), fiber (34.26%) and lipids (19.16%). The crude extract obtained from the jatropha cake under alkaline condition (100 mM sodium borate buffer, pH 10.0) showed the presence of lectin (319.76 HU/gF), papain inhibitor (1,287.38 IU/gF), protease (2.69 AU/gF) and, especially, trypsin inhibitor (1,649.7 IU/gF). The trypsin inhibitor, named JcTI, was purified by fractionation of the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity chromatography (trypsin-sepharose-4B) and molecular exclusion (sephacryl S-200). JcTI is a glycoprotein (6.4% carbohydrates) with molecular mass in the range of 20-21 kDa, pI of 6.6, NH2-terminal sequence (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) showing identity around 60% with plant albumins and highly stable to heat, pH and salinity. JcTI (500 Âg/mL) slowed the growth of important phytopthogenic fungi, including Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum and Fusarium solani. This inhibitor also presented antibacterial activity against human pathogenic bacteria such as Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis and Staphylococcus aureus, with minimum inhibitory concentration less than 5 Âg/mL. The results demonstrate the potential of JcTI for biotechnological application as a new defense protein against phytopthogenic fungi and human pathogenic bacteria.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os nanotubos de carbono apresentam extraordinÃrias propriedades fÃsico-quÃmicas que tÃm sido exploradas para aplicaÃÃes que vÃo desde a ciÃncia de materiais atà a biologia. No entanto, a maioria das aplicaÃÃes requer modificaÃÃes quÃmicas dos nanotubos de modo a explorar ao mÃximo seu potencial. Neste contexto, o desenvolvimento de protocolos de tratamento e de purificaÃÃo à muito importante. O objetivo deste estudo à contribuir para o entendimento de como a mudanÃa de uma variÃvel especÃfica, a temperatura, afeta as propriedades fÃsico-quÃmicas dos nanotubos de carbono de paredes mÃltiplas (MWNTs) durante a purificaÃÃo. Um grama (1g) de MWNTs (Ctube 100, CNT Co. Ltd., Incheon - CorÃia do Sul) foram submetidos a um refluxo de Ãcido nÃtrico 9 mol/L por 12 horas em temperaturas de 25ÂC, 75ÂC, 125ÂC e 175ÂC. ApÃs o refluxo, as amostras foram resfriadas em um banho tÃrmico, filtradas em condiÃÃes de vÃcuo com uma membrana de PTFE de 0, 2 Âm e lavadas com Ãgua deionizada atà que o pH neutro do filtrado foi atingido. Por Ãltimo, os MWNTs oxidados foram secos em vÃcuo durante 48 h. As tÃcnicas utilizadas neste trabalho para a realizaÃÃo das caracterizaÃÃes forneceram resultados que tratam desde caracterÃsticas macro e de superfÃcie atà as associadas ao nÃvel atÃmico. A estabilidade tÃrmica foi analisada por meio de medidas de TGA, uma vez que muitos dos grupos funcionais criados no tratamento sÃo termicamente instÃveis. A oxidaÃÃo resultante do tratamento introduz grupos polares na superfÃcie dos MWNTs e assim cria a estabilidade eletrostÃtica necessÃria para uma dispersÃo estÃvel em meio aquoso. A estabilidade foi avaliada para cada amostra por meio de medidas de potencial zeta. A quantidade e o tipo de resÃduos catalÃticos presentes nas amostras antes e depois do tratamento foram analisados atravÃs de medidas de EDX e UV-VIS. Medidas de espectroscopia Raman Confocal permitiram a anÃlise especÃfica dos defeitos estruturais criados sobre a superfÃcie dos tubos, em conseqÃÃncia do processo de oxidaÃÃo. Constatou-se que os experimentos Raman devem ser realizados sobre muitos pontos para poder acessar as propriedades mÃdias das amostras. A capacidade de adsorÃÃo da superfÃcie de cada amostra apÃs o tratamento foi inspecionada atravÃs de medidas de Ãrea superficial especÃfica (mÃtodo BET). Ao comparar os resultados de diferentes tÃcnicas, foi possÃvel acessar os efeitos da temperatura do tratamento sobre as propriedades fÃsico-quÃmicas relevantes, permitindo assim a obtenÃÃo de amostras bem caracterizadas que serÃo Ãteis para futuros estudos em Ãreas bio-relacionadas. / Carbon nanotubes exhibit remarkable physico-chemical properties which have been exploited for applications ranging from materials science to biology. However, most of the aplications requires the chemical modification of the nanotubes in order to exploit their maximum potential. In this context, the development of protocols for treatment and purification is very important. The purpose of this study is to contribute for the understand on how the change of a particular purification parameter, temperature, affects the physico-chemical properties of multi-walled carbon nanotubes (MWNTs) during the purification. One gram (1g) of MWNTs (Ctube 100, CNT Co. Ltd., Incheon - South Korea) were subjected to a reflux with nitric acid 9 mol/L for 12 hours at temperatures 25ÂC, 75ÂC, 125ÂC and 175ÂC. After refluxed, the samples were cooled down in a heat bath, filtered in vacuum condition using a PTFE membrane of 0, 2 Âm and washed with deionized water until the neutral pH of the filtrate was reached. Afterwards, the oxidized MWCNTs were dried in vacuum for 48 h. The experimental techniques used in this work to perform the samples characterization provide results that allow to get information from macro and surface characteristics to those associated with the atomic level. Thermal stability was analyzed by TGA measurements, since many of the functional groups created during the treatment are thermally unstable. Oxidation resulting from treatment introduces polar groups on the surface of MWNTs thus creating the electrostatic stability required for a stable dispersion in aqueous medium. The stability was evaluated for each sample by zeta potential measurements. The amount and type of catalytic residues present in the samples before and after treatment were analyzed by means of EDX and UV-VIS. Techniques confocal Raman spectroscopy measurements allowed the specific analysis of the structural defects created on the surface of the tubes as a consequence of oxidation process. It was found that Raman experiments should be performed on may points of the sample in order to access their average properties. The adsorption capacity of the surface of each sample after treatment, were inspected through specific surface area measurements (BET method). By comparing the results of different techniques it was possible to access the effects of temperature on the treatment on the relevant physico-chemical properties thus allowing us to have well characterized samples that will be useful for further studies in biorelated areas.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Avaliou-se o uso de testes de ecotoxicidade com o organismo-teste Daphnia magna no biomonitoramento de efluentes de ETEs industriais (real e sintÃtico), hospitalares e de aterro sanitÃrio. Para tanto, foram selecionadas algumas ETEs a citar: Industrial Real (Sistema Integrado do Distrito Industrial â SIDI), Industrial SintÃtico (Reator anaerÃbio seguido dos pÃs-tratamentos em Reator em Batelada SeqÃencial â RBS e Processo de OxidaÃÃo AvanÃado â POA do tipo H2O2/UV, tratando um efluente contendo o corante azo Reactive Black 5 - RB5), Hospitalar (Hospital Geral Waldemar de AlcÃntara â HGWA) e Aterro SanitÃrio (Lixiviado coletado na saÃda do sistema de lagoas de estabilizaÃÃo do Aterro SanitÃrio Metropolitano Oeste de Caucaia â ASMOC e submetido a um pÃs-tratamento por meio de um Reator Aerado Submerso â RAS). Os testes de toxicidade aguda realizados com o lixiviado indicaram que o efluente ao sistema ASMOC apresentou CE50 de 68%, o qual podia ser classificado como moderadamente tÃxico. Assim, alÃm de alguns parÃmetros fÃsico-quÃmicos nÃo estarem atendendo à Portaria n 154/02 da SEMACE, os resultados ecotoxicolÃgicos confirmaram o potencial poluidor do lixiviado em questÃo para ser descartado no Riacho Garoto, de baixa capacidade de diluiÃÃo. O pÃs-tratamento aerÃbio realizado no RAS contribuiu bastante na reduÃÃo da toxicidade do lixiviado, tanto em termos fÃsico-quÃmicos quanto em termos ecotoxicolÃgicos, aumentando o valor de CE50 para 95,04%, se configurando como uma boa opÃÃo de pÃs-tratamento. Os resultados obtidos com o esgoto afluente e efluente ao SIDI revelaram que o CE50 passou de 18,05% para 61,90%, mudando a classificaÃÃo de muito tÃxico para moderadamente tÃxico, respectivamente. Entretanto, o estudo efluente do SIDI, com as caracterÃsticas fÃsico-quÃmicas e de toxicidade encontradas, associadas à elevada vazÃo de esgotos tratados, representam um sistema com uma carga poluidora que merece ser investigada no corpo receptor. Em relaÃÃo ao esgoto hospitalar, observou-se que o esgoto bruto apresentou alta toxicidade e um CE50 de 7,27% (muito tÃxico) enquanto que o efluente tratado pela seqÃÃncia de reator UASB e lodo ativado apresentou CE50 de 30,83% (tÃxico). Portanto, os ensaios ecotoxicolÃgicos apontaram para o carÃter tÃxico do efluente em termos agudos, e podemos inferir a toxicidade crÃnica que tal efluente pode causar no corpo hÃdrico, jà que o mesmo pode conter elevadas concentraÃÃes de fÃrmacos, hormÃnios e outros micro-poluentes. O efluente sintÃtico bruto contendo o corante RB5 apresentou CE50 de 23,02%, sendo classificado como efluente muito tÃxico. ApÃs o tratamento no reator UASB, o valor de CE50 caiu para 40,34%, ou seja, houve uma diminuiÃÃo da toxicidade no tratamento anaerÃbio. No pÃs-tratamento pelo RBS ocorreu uma diminuiÃÃo significativa de toxicidade, em que o mesmo pode ser classificado como nÃo tÃxico. Entretanto, o POA do tipo do tipo UV/H2O2 provocou aumento da toxicidade, com o efluente apresentando CE50 de 20,17%, recebendo classificaÃÃo de muito tÃxico. A investigaÃÃo ecotoxicolÃgica em D. magna para avaliar o efeito da concentraÃÃo de H2O2 revelou elevada toxicidade do residual de perÃxido, sendo que em todas as diluiÃÃes testadas houve morte de 100% dos organismos expostos. Portanto, os estudos indicaram que muito embora o processo de oxidaÃÃo avanÃado (POA) do tipo H2O2/UV tenha uma boa perspectiva de aplicaÃÃo no tratamento de esgotos recalcitrantes, o perÃxido residual tem que ser cuidadosamente monitorado, nÃo sà por elevar a DQO do efluente como tambÃm por aumentar a toxicidade deste. Como conclusÃo geral da presente dissertaÃÃo foi possÃvel demonstrar a grande importÃncia dos testes ecotoxicolÃgicos agudos e crÃnicos no biomonitoramento de cargas poluidoras localizadas em corpos de Ãgua do CearÃ, assim como para um melhor entendimento dos processos biolÃgicos e nÃo biolÃgicos de tratamento de esgotos. / We evaluated the use of ecotoxicity tests with Daphnia magna for the biomonitoring of industrial effluents (real and synthetic), hospital effluent and leachate: real industrial wastewater (Integrated System of Industrial District - SIDI), synthetic industrial wastewater (anaerobic reactor followed by the post-treatments Sequential Batch Reactor - SBR and Advanced Oxidation Process - AOP type H2O2/UV, both treating a wastewater containing the azo dye Reactive Black 5 - RB5), Hospital effluent (Hospital Geral Waldemar de AlcÃntara - HGWA) and Leachate collected at the output of the stabilization ponds system located at the Metropolitan Sanitary Landfill West of Caucaia - ASMOC and submit to the post-treatment of Submerged Aerated Reactor - SAR. The acute toxicity tests conducted with the leachate indicated that the effluent from ASMOC system showed EC50 of 68%, which could be classified as moderately toxic. Thus, in addition to some physical and chemical parameters that are not complying with the limits defined in the Portaria nÂ. 154/02 of SEMACE, ecotoxicological results confirm the pollution potential of the leachate to be discharged at the Riacho Garoto, which has low dilution capacity. The post-aerobic treatment performed in SAR showed to greatly contribute in reducing the leachate toxicity in terms of physical-chemical and ecotoxicological characteristics, increasing the EC50 value to 95.04%, and showing to be a good post-treatment option. The results obtained with the real industrial influent and effluent from SIDI revealed that the EC50 increased from 18.05% to 61.90%, switching the classification from very toxic to moderately toxic, respectively. However, the SIDI effluent, considering the physico-chemical properties and toxicity found, associated with the high flow rate of treated wastewater, represents a system with a pollutant load that should be further investigated in the receiving water body. Regarding the hospital wastewater, it was observed that the raw wastewater had a high toxicity, with EC50 of 7.27% (very toxic), while the effluent treated by the sequence of UASB and activated sludge showed EC50 of 30.83% (toxic). Therefore, ecotoxicological tests revealed the toxic character of the effluent in terms of in acute toxicity and it can infer the chronic toxicity that such an effluent can cause in the water body, since it may contain high concentrations of drugs, hormones and other micro-pollutants. The synthetic wastewater containing the azo dye RB5 presented EC50 of 23.02%, classified as very toxic. After treatment in the UASB reactor, the EC50 value increased to 40.34%, i.e. there was a toxicity decrease by the anaerobic treatment. In the post-treatment by SBR, a significant reduction of toxicity was found and the effluent could be classified as non-toxic. However, the UV/H2O2 AOP increased the toxicity, in other words the EC50 decreased to 20.17%, being classified as very toxic. The effect of H2O2 concentration on the ecotoxicological test with D. magna was assessed and showed high toxicity of the residual peroxide, in all dilutions tested, causing death of 100% of the exposed organisms. Therefore, the studies indicated that although the H2O2/UV advanced oxidation process (AOP) has a good prospect for application on recalcitrant compounds, the peroxide residual has to be carefully monitored, not only because it increases the wastewater COD but also because it increases the effluent toxicity. As a general conclusion of this research, it was possible to show the great importance of acute and chronic ecotoxicological tests for the biomonitoring of pollution sources located in CearÃ, and also for a better understanding of biological and non-biological processes applied to wastewater treatment.