Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Previamente, foi demonstrado que o tratamento via intravenosa com 1-nitro-2-feniletano (NFE) induziu hipotensÃo que resulta principalmente de sua aÃÃo vasodilatadora diretamente sobre o mÃsculo liso. Nesse estudo, estudamos o mecanismo subjacente ao efeito miorrelaxante do NFE em tecidos vasculares isolados de ratos. Registros isomÃtricos foram obtidos a partir de anÃis isolados de artÃria aorta e do segundo ramo da mesentÃrica de ratos atravÃs de sistema de aquisiÃÃo de dados. Experimentos in silico (docking) de simulaÃÃo da formaÃÃo de complexos entre o NFE e a enzima guanilato ciclase foram realizados. Em preparaÃÃes de aorta isolada com endotÃlio intacto, NFE (1-300 &#61549;g/mL) relaxou a contraÃÃo induzida por fenilefrina ou K+, com valores de CI50 de 35,0 [23,3â52,6] e 73,2 [39,5â134,3] &#61549;g/mL, respectivamente. Os efeitos vasorrelaxantes do NFE foram significativamente (P < 0,05, teste de Mann-Whitney) reduzidos pelo tratamento prÃvio com ODQ (10 ÂM), azul de metileno (10 ÂM), TEA (5 mM), glibenclamida (10 ÂM) ou 4-aminopiridina (1 mM), mas nÃo pela remoÃÃo do endotÃlio vascular ou pelo prÃ-tratamento com L-NAME (100 &#956;M), indometacina (10 &#956;M), MDL-12.330A (3 &#956;M), KT5823 (0.5 ÂM) ou KT5720 (1 &#956;M). A potÃncia do NFE para induzir efeito vasorrelaxante foi significantemente maior (p < 0,01, teste de Mann-Whitney) nas preparaÃÃes de artÃria mesentÃrica quando comparado à aorta, tanto nas contraÃÃes induzidas por K+ como por noradrenalina com valores de CI50 de 5,3 [2,6â10,5] e 6,5 [2,8â14,9] Âg/mL, respectivamente. Em um meio sem cÃlcio, na presenÃa de K+ 60 mM ou fenilefrina 1 ÂM, as contraÃÃes induzidas CaCl2 foram significativamente reduzidas e atà mesmo abolidas pelo NFE na concentraÃÃo de 100 Âg/mL, respectivamente. Em meio sem cÃlcio, contendo EGTA, a resposta contrÃtil da fenilefrina foi significantemente reduzida pelo NFE (100 Âg/mL ), efeito impedido pelo tratamento com ODQ (10 ÂM), enquanto nÃo teve efeito significativo sobre as contraÃÃes induzidas por cafeÃna. Resultados semelhantes foram obtidos com nitroprussiato de sÃdio. NFE tambÃm foi capaz de inibir a contraÃÃo induzida pela entrada capacitativa de cÃlcio e pelo Ãster de forbol. AlÃm disso, os resultados de docking revelam que existem clusters de provÃveis interaÃÃes do NFE com a enzima guanilato ciclase. O presente estudo sugere que a atividade vasorrelaxante do NFE em aorta de rato à causada por provÃvel estimulaÃÃo da guanilato ciclase e consequente ativaÃÃo da cascata enzimÃtica guanilato ciclase/GMPc/canais de K+. / It was early shown that intravenous treatment with 1-nitro-2-phenylethane (NPE) induced hypotension resulting mainly from its direct vasodilatory action on vascular smooth muscle. Here, it was sudied the underlying mechanism involved in the vasorelaxant effect of NPE in isolated rings of rat arteries. Isometric recordings were obtained from rings made from aorta or mesenteric artery using a digital acquisition system. Experiments in silico (docking) for simulation of molecular interactions between NPE and the enzyme guanylate cyclase were performed. In endothelium-intact aortic preparations, NPE (1-300 &#61549;g/mL) relaxed the phenylephrine or K+-induced contractions with IC50 values of 35.0 [23.3- 52.6] and 73.2 [39.5-134.3] &#61549;g/mL, respectively. Vasorelaxant effects of NPE were significantly (P <0.05, Mann-Whitney test) decreased by pretreatment with ODQ (10 ÂM), methylene blue (10 ÂM), TEA (5 mM), glibenclamide (10 ÂM) or 4-aminopyridine (1 mM) but not by vascular endothelium removal or by pretreatment with L-NAME (100 ÂM), indomethacin (10 ÂM), MDL-12.330A (3 ÂM), KT5823 (0.5 ÂM ) or KT5720 (1 ÂM). Pharmacological potency of NPE was significantly greater (p <0.01, Mann-Whitney test) in preparations of mesenteric artery compared to that of aorta, as in K+- and norepinephrine-induced contraction with IC50 values of 5.3 [2.6-10.5] and 6.5 [2.8-14.9] &#61549;g/mL, respectively. In calcium-free medium, in presence of K+ 60 mM or phenylephrine 1 &#956;M, the CaCl2-induced contractions were significantly reduced and almost abolished by NPE at 100 &#956;g/mL, respectively. In calcium-free medium, containing EGTA, the contractile response of phenylephrine was significantly reduced by NPE (100 &#61549;g/mL), an effect prevented by treatment with ODQ (10 ÂM), whereas NPE was deprived of any significant effect on caffeine-induced contractions. Similar results were obtained with sodium nitroprusside. NPE also inhibited the contractions induced by the capacitive calcium entry or by phorbol ester. In addition, docking results revealed clusters of interactions of NPE with the guanylate cyclase molecule. The present study suggests that vasorelaxant activity of NPE on rat aorta is due to its stimulatory properties on guanylate cyclase, which activates the guanylate cyclase/cGMP/K+ channels pathway.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and &#945;-methyl-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (&#945;, &#946;, &#947; and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480  2 Da, 12.864  1 Da and 12,633  1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80 C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (&#945; chain) and two minor components (&#946; and &#947; chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the &#945; chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-&#945;-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60 C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica e biolÃgica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteÃnas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade, via de regra, està em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, mÃltiplos processos patolÃgicos cardiovasculares e inflamatÃrios, principalmente de natureza crÃnica e recorrente, despertam o interesse da comunidade cientÃfica por requererem uma maior variedade de fÃrmacos para alternativas terapÃuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com aÃÃo vasorrelaxante e anti-inflamatÃria. Assim, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por monossacarÃdeos (D-manose, D-glicose e &#945;-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). SDS-PAGE revelou trÃs bandas, correspondentes a trÃs cadeias (&#945;, &#946;, e &#947;) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480Â2 Da, 12,864Â1 Da e 12,633Â1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV à Ãtima nos pH 7.0 a 9.0, estÃvel a uma temperatura de 80 ÂC, e nÃo à afetada pelo EDTA. ConV nÃo demonstrou toxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participaÃÃo do domÃnio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificaÃÃo de glicoproteÃnas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um Ãnico passo atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia &#945;) e dois componentes menores (cadeias &#946; e &#947;) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionizaÃÃo por eletropulverizaÃÃo. Em comparaÃÃo com a massa molecular mÃdia das cadeias &#945;, a sequÃncia parcial de aminoÃcidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequÃncia total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarÃdeos (D-glicose, D-manose, e &#945;-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). AlÃm disso, CoxyL mostrou ser termoestÃvel a 60 C, e sua atividade à Ãtima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em nÃuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.