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Enrichissement de protéines ubiquitinées et une nouvelle approche protéomique pour l'identification des sites d'ubiquitinationDurette, Chantal January 2008 (has links)
Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.
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Enrichissement de protéines ubiquitinées et une nouvelle approche protéomique pour l'identification des sites d'ubiquitinationDurette, Chantal January 2008 (has links)
Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal
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Large scale identification of protein SUMOylation by mass spectrometry in HEK293 cellsMahrouche, Louiza 12 1900 (has links)
Les fichiers qui accompagnent mon document sont des tableaux supplémentaires réalisés avec Excel (Microsoft Office), dans la version papier du mémoire ces fichiers sont sur un CD-ROM. / Une large gamme d’événements cellulaires est régulée par la SUMOylation des protéines. Cette modification post-traductionnelle est impliquée dans le cancer notamment dans la leucémie promyélocytaire aigue. À ce jour, peu d’études à grande échelle ont porté sur l’identification des sites de modification. Ce mémoire présente une approche protéomique quantitative unique qui combine une double purification par affinité au niveau des protéines cibles ainsi que des peptides modifiés.
L’approche la plus répandue de purification des protéines SUMOylés implique l’utilisation d’une forme de SUMO modifié avec une étiquette (His6-SUMO). A ce jour, les approches permettant l’enrichissement au niveau peptidique nécessite une forme mutante de SUMO.
Notre analyse consiste à premièrement enrichir en protéines SUMOylés dans les cellules humaines vierges ou sur exprimant His6-SUMO-1/3 en présence ou pas de trioxyde de diarsenic, un traitement de leucémie promyélocytaire aigue. Par la suite, les échantillons sont digérés et les peptides obtenus des protéines SUMOylés conservent un branchement caractéristique. Les peptides sont soit immunoprécipités avec un anticorps spécifique au branchement SUMO ou directement analysés par nano LC/LC-MS/MS par un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Une analyse manuelle des données révèle des fragments caractéristiques correspondant à la chaîne latérale de SUMO. L’originalité de l’approche réside dans l’identification quantitative et sans ambigüité des sites de SUMOylation. Cette approche a permis l’identification de 17 et 3 sites de SUMO-3 et SUMO-1 respectivement dans les cellules HEK293. Finalement, la SUMOylation de PML est induite suite au traitement d’arsenic. / A wide range of cellular events are regulated by protein SUMOylation. This posttranslational modification was involved in APL (acute promyelocytic leukemia). Only a few large scale studies in mammalian cells have focused on identifying the conjugation sites. This thesis presents a unique quantitative proteomics approach that combines double affinity purification at the protein and peptide level.
A common approach to purification of SUMOylated proteins involves the use of a tagged SUMO (His6-SUMO). To date, the SUMO peptide isolation is addressed using an engineered SUMO.
In presence or absence of arsenic trioxide, a treatment of APL, mock and His6-SUMO1/3 expressing cells are lysed and the SUMOylated proteins are isolated under denaturing conditions. Subsequently, these samples are digested and the peptides bearing the modification site bear a specific SUMO stub. They are either immunoprecipitated with an anti SUMO stub antibody or directly analyzed by nano LC coupled to an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. Manual analysis of the data reveals characteristic fragmentation corresponding to the side chain of SUMO. The originality of the approach lies in the quantitative and unambiguous identification of SUMOylation sites in vivo. This approach allowed the identification of 17 and 3 sites of SUMO-3 and SUMO-1, respectively, in HEK293 cells. Finally, PML was identified as the major SUMOylation target following arsenic treatment.
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Large scale identification of protein SUMOylation by mass spectrometry in HEK293 cellsMahrouche, Louiza 12 1900 (has links)
Une large gamme d’événements cellulaires est régulée par la SUMOylation des protéines. Cette modification post-traductionnelle est impliquée dans le cancer notamment dans la leucémie promyélocytaire aigue. À ce jour, peu d’études à grande échelle ont porté sur l’identification des sites de modification. Ce mémoire présente une approche protéomique quantitative unique qui combine une double purification par affinité au niveau des protéines cibles ainsi que des peptides modifiés.
L’approche la plus répandue de purification des protéines SUMOylés implique l’utilisation d’une forme de SUMO modifié avec une étiquette (His6-SUMO). A ce jour, les approches permettant l’enrichissement au niveau peptidique nécessite une forme mutante de SUMO.
Notre analyse consiste à premièrement enrichir en protéines SUMOylés dans les cellules humaines vierges ou sur exprimant His6-SUMO-1/3 en présence ou pas de trioxyde de diarsenic, un traitement de leucémie promyélocytaire aigue. Par la suite, les échantillons sont digérés et les peptides obtenus des protéines SUMOylés conservent un branchement caractéristique. Les peptides sont soit immunoprécipités avec un anticorps spécifique au branchement SUMO ou directement analysés par nano LC/LC-MS/MS par un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Une analyse manuelle des données révèle des fragments caractéristiques correspondant à la chaîne latérale de SUMO. L’originalité de l’approche réside dans l’identification quantitative et sans ambigüité des sites de SUMOylation. Cette approche a permis l’identification de 17 et 3 sites de SUMO-3 et SUMO-1 respectivement dans les cellules HEK293. Finalement, la SUMOylation de PML est induite suite au traitement d’arsenic. / A wide range of cellular events are regulated by protein SUMOylation. This posttranslational modification was involved in APL (acute promyelocytic leukemia). Only a few large scale studies in mammalian cells have focused on identifying the conjugation sites. This thesis presents a unique quantitative proteomics approach that combines double affinity purification at the protein and peptide level.
A common approach to purification of SUMOylated proteins involves the use of a tagged SUMO (His6-SUMO). To date, the SUMO peptide isolation is addressed using an engineered SUMO.
In presence or absence of arsenic trioxide, a treatment of APL, mock and His6-SUMO1/3 expressing cells are lysed and the SUMOylated proteins are isolated under denaturing conditions. Subsequently, these samples are digested and the peptides bearing the modification site bear a specific SUMO stub. They are either immunoprecipitated with an anti SUMO stub antibody or directly analyzed by nano LC coupled to an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. Manual analysis of the data reveals characteristic fragmentation corresponding to the side chain of SUMO. The originality of the approach lies in the quantitative and unambiguous identification of SUMOylation sites in vivo. This approach allowed the identification of 17 and 3 sites of SUMO-3 and SUMO-1, respectively, in HEK293 cells. Finally, PML was identified as the major SUMOylation target following arsenic treatment. / Les fichiers qui accompagnent mon document sont des tableaux supplémentaires réalisés avec Excel (Microsoft Office), dans la version papier du mémoire ces fichiers sont sur un CD-ROM.
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Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnelsDagenais, Pierre 11 1900 (has links)
Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de
l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles
que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une
technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules
d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés
majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements.
Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique
d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend
la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur
support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La
nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN
fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par
spectroscopie RMN. / The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such
as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of
RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol
includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an
enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the
RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient
way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure
determination of large RNAs.
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Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnelsDagenais, Pierre 11 1900 (has links)
Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de
l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles
que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une
technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules
d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés
majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements.
Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique
d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend
la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur
support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La
nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN
fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par
spectroscopie RMN. / The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such
as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of
RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol
includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an
enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the
RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient
way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure
determination of large RNAs.
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L’α-synucléine : un regard sur les miARN menant à sa surexpressionSalvail-Lacoste, Alix 12 1900 (has links)
L'α-synucléine est reconnue comme une protéine clé dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson ainsi que d'autres troubles neurodégénératifs appelés synucléinopathies. Dans ces maladies, la surexpression de l’α-synucléine entraîne la formation d'agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques (DA). Dans cette thèse, nous avons exploré l’effet de la régulation de microARN (miARN) sur l’expression de l’α-synucléine. Pour se faire, des études ont été menées avec la lignée cellulaire humaine SH-SY5Y qui peut être différenciée pour créer un modèle de neurones DA et ensuite traitée avec une neurotoxine pour induire des caractéristiques cellulaires de la maladie de Parkinson. Des observations importantes ont été supportées dans des modèles cellulaires plus avancés, notamment les neurones induits par reprogrammation directe de fibroblastes humains (iNs) et les neurones DA primaires de souris purifiés.
Le premier objectif était de mieux comprendre comment la surexpression aberrante de l'α synucléine dans les synucléinopathies pourrait être due à une dérégulation de la maturation des miARN qui ciblent son ARN messager. Tout d’abord, nous avons sélectionné les miARN les plus susceptibles d'avoir un effet régulateur sur l’expression de l’α-synucléine à partir de recherche de la littérature et d’analyse de bases de données spécialisées. Nous avons observé que l’augmentation de l'expression de l'α-synucléine associée à l’ajout de neurotoxine est accompagnée d’une diminution concomitante de l'expression de plusieurs miARN sélectionnés. Sur la base de ces résultats, l'impact de ces miARN sur l'expression de l'α-synucléine a été évalué dans plusieurs types de cellules humaines, notamment les HEK 293T, les SH-SY5Y différenciées et les iNs. À cette fin, nous avons utilisé des cibles de miARN exogènes pour réprimer l'activité régulatrice des miARN et avons mesuré leur effet sur l'expression de l'α synucléine. Ainsi, nous avons démontré que la répression de miR-7, miR-93, miR-140, miR 153 et miR 214 mène systématiquement à la surexpression de l’α-synucléine dans les différents types de cellules. De plus, nous avons démontré que certains miARN sont régulés de manière post-transcriptionnelle en mesurant les niveaux des formes immatures et matures des miARN dans différents contextes cellulaires.
Le deuxième objectif était d’identifier des protéines potentiellement aptes à réguler la maturation post-transcriptionnelle de miARN. Des études de purification par affinité et de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les protéines qui s’associent avec la tige-boucle des formes immatures des miARN et régulent potentiellement leur maturation. Quelques protéines candidates ont été sélectionnées sur la base d’analyse informatique pour examiner l’effet de leur surexpression dans différents essais cellulaires. À ce jour, nous avons identifié quatre protéines (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) qui, en plus de répondre à certains critères de bases (lient l’ARN, sont présentes dans le cerveau et impliquées dans des maladies associées au système nerveux), ont un effet sur l’activité et l’expression de miR-153 ainsi que sur l’expression de l’α-synucléine.
Ces travaux ont permis d’établir de solides bases dans notre compréhension de la régulation de l'α-synucléine par les miARN et d’ouvrir la voie à des études plus élaborées qui permettront d’établir les mécanismes de régulation des niveaux de miARN qui ciblent l’α-synucléine. À plus long terme, cet axe de recherche pourrait fournir des pistes pour le développement d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour les synucléinopathies. / Alpha-synuclein is a key protein in the pathophysiology of Parkinson's disease and other
neurodegenerative disorders called synucleinopathies. In these diseases, overexpression of α-synuclein
leads to the formation of toxic aggregates in dopaminergic (DA) neurons. In this thesis, we explored the
effect of microRNA (miRNA) regulation on α-synuclein expression. To do so, studies were conducted
with the human SH-SY5Y cell line, which can be differentiated to create a model of DA neurons and
then treated with a neurotoxin to induce cellular features of Parkinson's disease. Important observations
were supported in more advanced cell models, including neurons induced by direct reprogramming of
human fibroblasts (iNs) and purified primary mouse DA neurons.
The first objective was to better understand how aberrant overexpression of α-synuclein in
synucleinopathies results in the deregulation of the maturation of miRNAs that target its messenger RNA.
First, we selected the miRNAs most likely to have a regulatory effect on α-synuclein expression based
on literature searches and specialized database analyses. We observed that the increase in α-synuclein
expression associated with neurotoxin addition is accompanied by a concomitant decrease in the
expression level of several selected miRNAs. Based on these results, the impact of these miRNAs on αsynuclein expression was evaluated in several human cell types, including HEK 293T, differentiated SHSY5Y, and iNs. To this end, we used exogenous miRNA targets to repress miRNA regulatory activity
and measured their effect on α-synuclein expression. Thus, we demonstrated that repression of miR-7,
miR-93, miR-140, miR-153, and miR-214 consistently leads to overexpression of α-synuclein in
different cell types. In addition, we demonstrated that some miRNAs are regulated in a posttranscriptional manner by measuring the levels of immature and mature forms of miRNAs in different
cellular contexts. The second objective was to identify proteins potentially able to regulate the post-transcriptional
maturation of miRNAs. Affinity purification and mass spectrometry studies were used to identify
proteins that associate with the stem-loop of immature forms of miRNAs and potentially regulate their
maturation. A few candidate proteins were selected based on computational analysis to examine the effect
of their overexpression in different cell-based assays. To date, we have identified four proteins (MIF,
PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) that, in addition, to fitting basic criteria (known to bind RNA, are present
in the brain and associated with nervous system-related diseases) affect miR-153 activity and expression
as well as α-synuclein expression.
This work has established a solid foundation in our understanding of the regulation of α-synuclein
by miRNAs and has paved the way for more elaborate studies that will establish the mechanisms of
regulation of miRNA levels that target α-synuclein. In the longer term, this line of research could provide
avenues for the development of diagnostic and therapeutic tools for synucleinopathies.
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