Memoria para optar al título de Bioquímico / La expresión génica dependiente de manganeso no se comprende del todo en organismos eucariontes. Decidimos intentar comprender de mejor forma este proceso utilizando el basidiomicete Ceriporiopsis subvermispora, ya que el manganeso cumple un rol importante en su metabolismo degradante de lignina. Dado que el genoma de este organismo no se encuentra disponible, utilizamos la técnica de cDNA-AFLP para realizar un estudio global de la expresión génica dependiente de manganeso el cual dio interesantes resultados. De 37 fragmentos derivados de transcriptos (TDFs) secuenciados, 21 fueron analizados, identificados y clasificados en razón a su expresión diferencial en respuesta a manganeso. El análisis de estos resultados nos permitió encontrar varios genes cuya expresión se encuentra regulada por este metal y además postular posibles roles homeostáticos para varios de ellos. Entre los hallazgos más importantes podemos mencionar que el estrés por manganeso produce cambios a nivel celular tales como: (1) un aumento en la actividad traduccional, (2) un aumento en la biosíntesis de membranas celulares para la compartamentalización, almacenamiento y destoxificación del manganeso con la concomitante activación de la vía secretora, y (3) un aumento en la biosíntesis de “núcleos Fe-S”. Además, postulamos que existen dos proteínas que participarían como reguladores de la expresión de factores homeostáticos para el estrés por manganeso. La proteína SSD1 participaría activamente regulando la expresión de factores homeostáticos de forma post-transcripcional en respuesta a concentraciones ascendentes del metal, mientras que la proteína Erd2 tendría la misma función, pero en respuesta a concentraciones descendentes. Estudiamos las regiones reguladoras río arriba del sitio de inicio de la traducción de genes relacionados con la homeostasis de manganeso derivados de este estudio y de la literatura. Esto nos permitió identificar la presencia de sitios de unión para los factores de transcripción ACE1 y HAP1, los cuales podrían mediar un efecto sinérgico en la activación de la transcripción manganeso-dependiente, siendo putativamente ACE1 el factor principal. / Manganese-dependent gene expression is not fully understood in eukaryotic organisms. This study aims to understand this process in a better way utilizing the basidiomycete C. subvermispora, since manganese plays an important role in its lignin degrading metabolism. Since the genome of this organism is not available, we used cDNA-AFLP technique to perform a global manganese-dependent gene expression profiling that yielded interesting results. Out of 37 sequenced transcript derived fragments (TDFs), 21 were further analyzed, identified and classified according to their differential expression profile in response to manganese. The analysis of these results allowed us to find various genes whose expression is regulated by this metal, and also postulate possible homeostatic roles for some of them. Among the most important findings we describe that manganese stress produces changes at the cellular level, such as: (1) increased cellular translational rate, (2) increased biosynthesis of cellular membranes for the compartmentalization, storage and detoxification of manganese with a concomitant increased activity of the secretory pathway, and (3) an increased biosynthesis of Fe-S clusters. Even more, we postulate that there are two proteins that participate as regulators of manganese homeostatic expression of factors in response to manganese stress; SSD1 protein would actively regulate post-transcriptionally the expression of homeostatic factors in response to increasing metal concentration, while Erd2 would have the same function yet in response to decreasing concentrations. We studied upstream regulatory regions of genes related to manganese homeostasis by this study or the literature; this allowed the identification of repetitively found transcription factor binding sites for ACE1 and HAP1, which may mediate a synergic effect on the activation of manganese-dependent gene expression, where ACE1 would be the main putative synergic mediator

La predisposición al alcoholismo está en gran parte determinada por factores genéticos que son difíciles de abordar en humanos, por lo que se han desarrollado en el mundo líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de alcohol para estudiar los factores permisivos y protectores del alcoholismo. En Chile se encuentran la línea UChA (Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de Chile, Bebedoras) que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Las ratas UChA beben entre 0,1 y 1 g de etanol/kg/día, en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día. En la ratay el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente en el hígado, donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH) transforma el etanol en acetaldehído que es transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). La ADH y la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor en las reacciones de oxidación. El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: el alelo Aldh22 se encuentra exclusivamente en el linaje UChA y los alelos Aldh21 y Aldh23 se encuentran en el linaje UChB, siendo el alelo Aldh23 exclusivo del linaje bebedor. Además, el linaje UChA se diferencia del UChB en la capacidad de generación de NAD+ de las mitocondrias: menor en las mitocondrias del linaje UChA que en las del linaje UChB. En ratas, la variante ALDH23 es suficiente para generar un consumo elevado de alcohol, independientemente de la mitocondria que posean. En cambio, la variante ALDH22 es necesaria pero no suficiente para determinar un bajo consumo de alcohol, fenotipo que sí se manifiesta cuando, además de la ALDH22, las ratas tienen mitocondrias de menor capacidad de generar NAD+. Las diferencias en las capacidades respiratorias mitocondriales se deben al complejo I (deshidrogenasa de NADH) formado por 46 subunidades. Nueve de ellas son de herencia exclusivamente materna, dos codificadas en el cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial. En esta memoria se estudiaron los genes mitocondriales que codifican subunidades del complejo I de las ratas UChA y UChB con el propósito de identificar las bases moleculares de las diferencias bioquímicas entre ambos linajes. Se amplificaron, secuenciaron y analizaron, de cinco ratas UChA (Aldh22/Aldh22) y cinco ratas UChB (Aldh23/Aldh23), siete genes mitocondriales que codifican sendas subunidades del complejo I mitocondrial. No se encontró heteroplasmia puesto que hay un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las cinco ratas UChA son iguales entre sí y las cinco ratas UChB también son iguales entre sí. Se encontró que las ratas UChA (no bebedoras) y UChB (bebedoras de alcohol) se diferencian en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I. No se encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L. Los genes Nd1 y Nd3 sólo tienen diferencias nucleotídicas silentes mientras que los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6 tienen además diferencias nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos, por lo que ambos linajes difieren en cuatro proteínas. Las subunidades ND2 se diferencian en cuatro posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304 (Met/Thr) y una inserción de histidina en la posición 318 (His/---). Estas variaciones aminoacídicas en la proteína ND2 determinan cambios estructurales que se manifiestan de manera evidente en un modelo tridimensional y en el número de segmentos de transmembrana: nueve en el linaje UChA y diez en el linaje UChB. Las subunidades ND4 se diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las subunidades ND5 se diferencian en la posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en la posición 139 (Val/Ile). Siete de las catorce secuencias genéticas obtenidas en este trabajo son variantes nuevas entre los roedores: los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4 del linaje UChA. Las secuencias aminoacídicas deducidas de la subunidad ND5 de los linajes UChA y UChB y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del linaje UChA corresponden a secuencias proteicas nuevas entre los roedores. Concluyendo, los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del complejo I mitocondrial, en especial los responsables de variaciones aminoacídicas, pueden establecer nuevos factores (permisivos o protectores) de herencia exclusivamente materna que influyen en la capacidad mitocondrial de regenerar el NAD+ y, por lo tanto, en el consumo de alcohol.