Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar Título Profesional de Bioquímico / El manganeso es un componente esencial para los organismos, pues está involucrado en muchos de los procesos elementales de la célula. El estado de oxidación +2 es la forma más abundante de este metal en los sistemas biólógicos, en donde es requerido por una amplia diversidad de enzimas y proteínas. El ion Mn2+ destaca además por su capacidad de controlar especies reactivas del oxígeno al interior de la célula. Aún cumpliendo papeles tan importantes, se ha determinado que altas concentraciones intracelulares de Mn2+ pueden ser tóxicas. Además, su deficiencia también es responsable de ocasionar trastornos metabólicos que influyen en el desarrollo de los organismos. En el marco de comprender la dinámica de la homeostasis del ion Mn2+ en la célula, se han caracterizado varios transportadores que participan en la movilización y almacenamiento de este ion. La existencia de estos sistemas específicos demuestra la importancia que posee el mantener el control estricto de las concentraciones de Mn2+ para la célula. Por otra parte, se ha determinado que este ion es capaz de modular la actividad transcripcional de muchos genes, sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares a través de los cuales es capaz de realizar esta actividad. Ceriporiopsis subvermispora es un hongo que se ha caracterizado por ser un eficiente basidiomicete que degrada la lignina. Nuestro grupo ha caracterizado en profundidad los procesos involucrados en la degradación de este polímero natural y se ha determinado que una de las enzimas que utiliza este hongo es muy dependiente de la disponibilidad del ion Mn2+. A partir de esta y otras evidencias, realizó un estudio de la influencia de este ion sobre la expresión de la maquinaria ligninolitica en C. subvermispora. Los resultados obtenidos permitieron postular la existencia de mecanismos complejos asociados al control transcripcional de la enzima ligninolítica, sin lograr establecer la forma en que participaba el Mn2+. Estos antecedentes sugerían que aspectos fundamentales de la fisiología del Mn2+ en C. subvermispora debían ser abordados. En el trabajo aquí presentado se documenta la identificación de tres componentes de la respuesta a Mn2+, lograda a través del secuenciamiento de regiones genómicas. Estas regiones fueron identificadas parcialmente por estudios previos con la técnica de cDNA-AFLP aplicada para estudiar la homeostasis de Mn2+ en C. subvermispora. Dos de los segmentos identificados en este estudio muestran una alta homología a transportadores que han sido muy bien caracterizadas en la movilización de este metal: un homólogo del transportador de fosfatos inorgánicos de Saccharomyces cerevisiae PHO84, y un transportador de sideróforos. Además, se identificó un segmento que proviene de un marcador inducible por Mn2+, y su función predicha corresponde a una epimerasa que podría participar en el control de especies radicalarias del oxígeno. A partir de las funciones propuestas para estos componentes, se establece un modelo integral del control de la concentración del ion Mn2+ y la actividad ligninolítica de este hongo. Finalmente, se presentan los resultados de la identificación de un motivo presente en promotores de genes que son regulados por Mn2+, que sería específico para este ion. La existencia de este elemento permitiría explicar la respuesta transcripcional previamente estudiada en C. subvermispora, postulando un mecanismo de control transcripcional a través de factores proteicos capaces de reconocer el ion Mn2+. Esta evidencia es contrastada con los hallazgos documentados en el último tiempo para el control ejercido por Mn2+, sugiriendo que este elemento sea funcional / Manganese is a fundamental component for most organisms, because it is involved in many elemental cell processes. This metal is mainly found in biological systems with an oxidation state of +2, being required by an enormous diversity of enzymes and proteins. Mn2+ is highlighted by its ability of controlling reactive oxygen species inside the cell. Although this ion has a fundamental physiological role, it has been determined that high intracellular concentrations of Mn+2 can cause severe toxicity. Besides, the deficiency of this ion is also responsible for metabolic alterations that may affect the development of an organism. Focused on understanding dynamics of cellular Mn2+ homeostasis, there have been characterised several carriers involved in the processes of transport and storage of this ion. These specific systems maintain a strict control of the concentration Mn2+ ion, which is a very important process for the cell. There is evidence that this ion is capable of regulating the transcriptional activity of many genes, however the molecular mechanisms involved in this control are still unknown. Ceriporiopsis subvermispora is a basidiomycete fungus that has been characterised for being very efficient in lignin breakdown. The metabolic machinery employed by this fungus to degrade this compound has been studied by our group and we have determined one of its members, the manganese peroxidase, is widely dependent on Mn2+ availability. This evidence along with other studies, prompted our group to conclude that this ion could influence the expression of ligninolytic enzymes in C. subvermispora. We explored this proposal and the results obtained were not sufficient for establishing the role of Mn2+, but suggested the involvement of complex mechanisms that were capable of regulating ligninolytic enzymes. To investigate the importance of Mn2+ in the expression of ligninolytic machinery, fundamental knowledge about Mn2+ homeostasis had to be understood. In the present work, identification of three components of Mn2+ homeostasis are documented. These results were obtained by sequencing genomic regions, that were partially described in a previous cDNA-AFLP analysis of Mn2+ homeostasis in C. subvermispora. Two of the genomic regions identified showed high homology to well characterised carriers involved in the transport of this ion: a homolog of the inorganic phosphate transporter of Saccharomyces cerevisiae PHO84, and an oligopeptide transporter. The third region was identified from an inducible marker in the cDNA-AFLP study, and its function was predicted to be an epimerase that could be involved in control of reactive oxygen species. Considering predicted functions of the identified regions, an integrative model describing the control of Mn2+ concentration and ligninolytic activity is proposed. Finally, the identification of a specific motif found in promoters of Mn2+ regulated genes is presented. This element could explain the transcriptional response observed in C. subermispora, through a transcription control mechanism involving a transcriptional factors able to bind Mn2+. This result is compared with evidence from recent studies of specific transcriptional control exerted by Mn2+, which suggests that this element is functional

Memoria para optar al título profesional de Químico Farmacéutico / El basidiomicete de pudrición blanca Ceriporiopsis subvermispora es un hongo capaz de degradar la lignina de la madera mediante una serie de enzimas secretadas al medio extracelular. Este sistema ligninolítico está compuesto por las enzimas lacasa (Lcs) y manganeso peroxidasa (MnP) cuyos genes codificantes y sus secuencias regulatorias han sido clonados y secuenciados por nuestro grupo. Tomando en cuenta que la regulación de la expresión de un gen depende de diferentes elementos contenidos en su región promotora, esta actúa como módulo central de procesamiento de diversas señales. Con el objetivo de conocer más sobre el sistema regulatorio de estas enzimas, específicamente de la isoenzima MnP2B, nos propusimos estudiar los posibles factores transcripcionales que se unen al promotor del gen Cs-mnp2B; Para esto se dividió la región promotora en cuatro fragmentos, α1, α2, β1 y β2, los cuales fueron utilizados para ensayos de retardo (EMSA) con extractos de proteínas nucleares preparados a partir de micelio del hongo, para demostrar la formación de complejo proteína-DNA. Posteriormente se realizaron ensayos de competencia que comprobaron la especificidad de la unión a estas sondas. Al analizar mediante footprinting los distintos fragmentos, la sonda β1 mostró los resultados más claros, encontrándose una región protegida de 48 pb. Para analizar este sitio de unión, se diseñó un nuevo partidor que permitió la amplificación de un fragmento de 74 pb, que forma parte de β1 y que contenía dicha secuencia. Esta sonda se denominó β1A y fue analizada con más detalle. Este pequeño fragmento del promotor fue utilizado como sonda en ensayos de EMSA, los que mostraron la unión específica de a lo menos una proteína. Para caracterizar las proteínas unidas a la sonda β1A, el complejo proteína-DNA fue purificado desde el gel de retardo y posteriormente fue resuelto en un gel SDS-PAGE. El resultado de este ensayo mostró la existencia de una proteína mayoritaria en este complejo con una masa molecular entre 60 y 70 kDa. Finalmente se estudió la secuencia que mostró protección en el ensayo de huella digital o “footprinting”, con los programas computacionales CBRC y TESS, los que predicen cajas de unión putativas a factores transcripcionales. El análisis conjunto de ambos programas mostró la probable unión de seis proteínas, ADR1, GCN4, Hsf1, SRY, Stuap y Ttk69, de las cuales al menos tres podrían estar directamente relacionadas con la regulación del gen Cs-mnp2B / The white-rot basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora is able to degrade lignin from wood trough an array of extracellular secreted enzymes, its ligninolytic system composed by laccase (Lcs) and manganese peroxidase enzymes. Their coding sequences and regulatory regions have been cloned and sequenced by our group. Taking into account that the regulation of the expression of a particular gene depends on different elements contained in its promoter region, we decided to explore the possible transcription factors that may interact with the promoter region of the Cs-mnp2B gene. Since promoter regions act as key elements that process a broad type of signals, the aim of this work was to study to some extent the regulatory mechanisms of the genes encoding for these enzymes. For this purpose, the Cs-mnp2B promoter region was divided into four different fragments named α1, α2, β1 and β2. To demonstrate a protein-DNA interaction, all these fragments were incubated with protein nuclear extracts prepared from fungal mycelia and used as DNA probes for electromobility-shift assays (EMSA). Using all the aforementioned probes, the protein-DNA interaction specificity was studied by competition analysis. By means of footprinting, a 48bp protected region was only clearly identified when using the β1 probe. To analyze this binding region, a new primer was designed to allow the amplification of a 74bp fragment that it is part of the b1 probe and that also contains the mentioned sequence. This new probe was named b1A and it was further analyzed. When used as a probe, EMSA showed a specific interaction with at least one nuclear protein. The observed protein-DNA complex was gel-purified and subsequently loaded onto a SDS-PAGE to characterize the proteins present in the complex. The existence of a major protein with a molecular mass between 60 and 70 KDa was observed within the protein- DNA complex. Finally, the footprinting-protected sequence was further analyzed using the CBRC and TESS computational software, which predicts transcriptional factors putative binding regions. According to both analyses, six proteins named ADR1, GCN4, Hsf1, SRY, Stuap and Ttk69 showed to be the most probable binding candidates. Among these proteins, only three may be directly involved in the regulation of the Cs-mnp2B gene

Memoria para optar al título de Bioquímico / La expresión génica dependiente de manganeso no se comprende del todo en organismos eucariontes. Decidimos intentar comprender de mejor forma este proceso utilizando el basidiomicete Ceriporiopsis subvermispora, ya que el manganeso cumple un rol importante en su metabolismo degradante de lignina. Dado que el genoma de este organismo no se encuentra disponible, utilizamos la técnica de cDNA-AFLP para realizar un estudio global de la expresión génica dependiente de manganeso el cual dio interesantes resultados. De 37 fragmentos derivados de transcriptos (TDFs) secuenciados, 21 fueron analizados, identificados y clasificados en razón a su expresión diferencial en respuesta a manganeso. El análisis de estos resultados nos permitió encontrar varios genes cuya expresión se encuentra regulada por este metal y además postular posibles roles homeostáticos para varios de ellos. Entre los hallazgos más importantes podemos mencionar que el estrés por manganeso produce cambios a nivel celular tales como: (1) un aumento en la actividad traduccional, (2) un aumento en la biosíntesis de membranas celulares para la compartamentalización, almacenamiento y destoxificación del manganeso con la concomitante activación de la vía secretora, y (3) un aumento en la biosíntesis de “núcleos Fe-S”. Además, postulamos que existen dos proteínas que participarían como reguladores de la expresión de factores homeostáticos para el estrés por manganeso. La proteína SSD1 participaría activamente regulando la expresión de factores homeostáticos de forma post-transcripcional en respuesta a concentraciones ascendentes del metal, mientras que la proteína Erd2 tendría la misma función, pero en respuesta a concentraciones descendentes. Estudiamos las regiones reguladoras río arriba del sitio de inicio de la traducción de genes relacionados con la homeostasis de manganeso derivados de este estudio y de la literatura. Esto nos permitió identificar la presencia de sitios de unión para los factores de transcripción ACE1 y HAP1, los cuales podrían mediar un efecto sinérgico en la activación de la transcripción manganeso-dependiente, siendo putativamente ACE1 el factor principal. / Manganese-dependent gene expression is not fully understood in eukaryotic organisms. This study aims to understand this process in a better way utilizing the basidiomycete C. subvermispora, since manganese plays an important role in its lignin degrading metabolism. Since the genome of this organism is not available, we used cDNA-AFLP technique to perform a global manganese-dependent gene expression profiling that yielded interesting results. Out of 37 sequenced transcript derived fragments (TDFs), 21 were further analyzed, identified and classified according to their differential expression profile in response to manganese. The analysis of these results allowed us to find various genes whose expression is regulated by this metal, and also postulate possible homeostatic roles for some of them. Among the most important findings we describe that manganese stress produces changes at the cellular level, such as: (1) increased cellular translational rate, (2) increased biosynthesis of cellular membranes for the compartmentalization, storage and detoxification of manganese with a concomitant increased activity of the secretory pathway, and (3) an increased biosynthesis of Fe-S clusters. Even more, we postulate that there are two proteins that participate as regulators of manganese homeostatic expression of factors in response to manganese stress; SSD1 protein would actively regulate post-transcriptionally the expression of homeostatic factors in response to increasing metal concentration, while Erd2 would have the same function yet in response to decreasing concentrations. We studied upstream regulatory regions of genes related to manganese homeostasis by this study or the literature; this allowed the identification of repetitively found transcription factor binding sites for ACE1 and HAP1, which may mediate a synergic effect on the activation of manganese-dependent gene expression, where ACE1 would be the main putative synergic mediator

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El objetivo de este trabajo fue identificar genes expresados diferencialmente en un organismo cuyo genoma no ha sido secuenciado. Investigamos los patrones globales de expresión en respuesta a cambios en la concentración de Mn2+ en el medio de cultivo, con el fin de identificar genes involucrados en el metabolismo y homeostasis de este catión. El organismo modelo usado fue Ceriporiopsis subvermispora, un hongo ligninolítico altamente selectivo, el cual posee una maquinaria enzimática compuesta por peroxidasas dependientes de manganeso y lacasas principalmente. Para lograr el objetivo propuesto desarrollamos un protocolo de cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length Polymorphism) basado en la amplificación de fragmentos derivados de transcritos, para analizar los patrones de expresión génica en cultivos con diferente concentración de Mn2+. Al analizar los patrones generados obtenidos del hongo creciendo en diferentes concentraciones de manganeso, identificamos 34 fragmentos derivados de transcritos diferencialmente expresados en respuesta a manganeso. Veintidós de ellos mostraron homología con genes de función conocida o putativa, mientras que catorce de ellos no mostraron coincidencias considerables. El resultado más interesante fue identificar dos fragmentos derivados de transcritos que correspondían a la familia de transportadores tipo ABC (ATP Binding Cassette) altamente relacionados con la homeostasis de Mn2+ y Ca2+ / The aim of this work was to identify differentially expressed genes in an organism whose genome has not been sequenced. We investigated the global gene expression pattern regulated by manganese, in order to identify genes involved in its metabolism and homeostasis. The model organism used was Ceriporiopsis subvermispora, a highly selective ligninolytic fungus, which possesses an enzymatic machinery composed of manganesedependent peroxidases and laccase. In order to achieve this objective we developed a cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length Polymorphism) protocol based on the amplification of transcript derived fragments (TDFs) to analyze the gene expression patterns on different Mn2+ concentration cultures. When analyzing cDNA-AFLP generated patterns obtained from the fungus grown on different concentrations of manganese, we identified 34 manganesedifferentially expressed transcript derived fragments. Twenty of them showed significant homology to genes with known or putative function, while fourteen fragments did not show significant matches. Interestingly we identified two TDFs that correspond to members of the ABC (ATP Binding Cassette) transporter family closely related with Mn2+/Ca2+homeostasis

Este trabalho compreendeu estudar e definir as condições de cultivo que maximizam a produção de manganês peroxidases (MnPs) e lacases (Lacs) por C. subvermispora, fungo de degradação branca da madeira envolvido em processos industriais de biopolpação. O estudo envolveu cultivos submersos, em superfície ou com micélio imobilizado em espuma de poliuretano em meios complexo ou definido, e cultivos imobilizados em meio definido nos quais foram avaliados os efeitos: de diferentes concentrações de Mn2+, dos indutores 2,5-xilidina e álcool veratrílico, e do surfactante Tween 80, que levaram a diferentes níveis de expressões de Lacs e MnPs. Para a determinação de como essas condições afetam a produção das enzimas oxidativas (MnPs e Lacs), os cultivos foram avaliados cineticamente quanto à concentração de proteínas, às atividades enzimáticas, ao espectro de absorção de luz na região UV-VIS, ao teor de açúcares redutores, ao crescimento micelial, ao teor de amônio, ao pH, à condutividade elétrica. Também foram realizadas análises eletroforéticas de extratos de cultivos selecionados. Nos cultivos que tiveram como inóculo discos de micélio, a condição imobilizada em meio de composição complexa demonstrou potencial para produção de Lac (147,5 UI/L). Já nos cultivos inoculados com suspensão de micélio macerado em água, a condição imobilizada em meio de composição definida se destacou com produção seletiva de MnP (277,5 UI/L). Verificou-se que os cultivos em meio complexo nas formas submersa e imobilizada favoreceram a produção de Lac em detrimento de MnP. Nos cultivos de C. subvermispora imobilizado em espuma de poliuretano, em meio definido, a variação da concentração de manganês no meio de cultura alterou a produção de MnP, sendo a concentração de 11 ppm de Mn+2 promotora da máxima atividade (108,5 UI/L). No entanto, ao suprimir manganês do meio, ocorreu produção seletiva de Lac (15,5 UI/L). Com a suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com 0,5 e 1,0 mM de 2,5-xilidina, foram alcançados máximos de atividade de Lac de 14,0 e 22 UI/L, respectivamente. A atividade máxima de MnP não foi afetada pela adição de 2,5-xilidina. Não houve aumentos significativos nas atividades máximas de Lac e de MnP quando o meio foi suplementado com álcool veratrílico. A suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com Tween 80 nas concentrações de 0,05% e 0,5% v/v, em adição a 2,5-xilidina 1,0 mM, aumentou ainda mais a produção de Lac, com máximos de atividade de 53 e 61 UI/L, e de MnP, com picos de 175 e 182 UI/L, respectivamente. As eletroforeses em condições desnaturantes revelaram bandas proteicas de 12,4 a 118,3 KDa e nos géis de atividade foram detectadas atividades de MnP e Lac com mais de uma banda de atividade. Durante os cultivos, a exaustão de açúcares redutores acarretou em diminuição da concentração de micélio fúngico e aumento da concentração de nitrogênio amoniacal no meio, provavelmente devido à ocorrência de autólise celular. O pH e a condutividade variaram relativamente pouco. Em meio complexo, obsevou-se aumento da condutividade durante o cultivo, provavelmente devido à secreção de ácidos orgânicos pelo fungo. / This work involved the research and definition of the culture conditions that maximize the production of manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) by C. subvermispora, a white-rot fungus studied in biopulping industrial processes. The study involved submerged or static cultures with immobilized mycelium in polyuretane foam in complex or defined medium, and immobilized cultures in defined medium with different concentrations of Mn2+ and inductors, 2.5-xylidin and veratryl alcohol, and surfactant, Tween 80, resulting in different expressions levels of MnPs and Lacs. To determine how these conditions affect the production of oxidative enzymes (MnP and Lac), the cultures were evaluated kinetically regarding the concentration of proteins, enzymatic activities, the absorption of light in the UV-VIS regions, the concentration of reducing sugars, the micelyal growth, the concentration of ammonium, pH, electrical conductivity. We also performed electrophoretic analysis of some selected cultures. In the cultures inoculated whith discs of mycelium, the condition immobilized in poliuretane foam whith complex medium showed potential for producing Lac (147.5 IU / L). In the cultures inoculated with homogenized mycelium, the immobilized condition whith defined medium showed selective production of MnP (277.5 IU/L). It was found that the submerged and immobilized cultures in complex medium increased the production of Lac instead of MnP. In the immobilized cultures with defined medium, the variation of the concentration of manganese in the medium altered the production of MnP, being the concentration of 11 ppm that promoting maximum activity (108.5 IU/L). However, in the absence of manganese in the medium, the selective production of Lac (15.5 IU / L) was observed. With the supplementation of the defined medium containing 11 ppm Mn+2 with 0.5 or 1.0 mM 2.5-xylidine, maximum activities of Lac of 14.0 and 22.0 IU / L, respectively, were achieved. The maximum activity of MnP was not affected by the addition of 2.5-xylidine. There was no significant increase in the maximum activities of Lac and MnP when the medium was supplemented with veratryl alcohol. Supplementation of the medium with Tween 80, at concentrations of 0.05% and 0.5% v/v, in addition to 11 ppm Mn+2 and 1.0 mM 2.5-xylidine, further increased the production of Lac, with highest activities of 53 and 61 IU/L; MnP activities were 175 and 182 IU/L, respectively. Electrophoresis under denaturing conditions revealed bands of approximately 12.4-118.3 KDa in the electrophoresis non-denaturing PAGE showed MnP and Lac activities in differents bands. During the cultivations, the exhaustion of sugars led to decreased concentrations of mycelium and increased concentrations of ammonia in the extracts, probably due to the occurrence of cellular autolysis. The pH and conductivity showed low variations. The culture in complex medium showed an increased conductivitywith time, probably due to the secretion of organic acids by the fungus.

No presente trabalho buscaram-se formas adequadas de produzir micélio de Ceriporiopsis subvermispora em culturas submersas, com o objetivo de preparar inóculo destinado ao processo de biopolpação. A obtenção de inóculo pode ser considerada uma etapa chave na biopolpação, visto que atualmente não existem processos industriais estabelecidos para a produção de micélio de basidiomicetos em quantidades compatíveis com a demanda prevista no processo. Mesmo uma planta industrial pequena de biopolpação (200 ton de polpa/dia) pode demandar cerca de 1 kg de micélio seco/dia, considerando-se as cargas de inoculação de 5 g de micélio seco/ton de madeira tratada. Desta forma, o sucesso desse processo pode depender de um baixo custo da produção dos inóculos fúngicos em larga escala. Os experimentos realizados consistiram inicialmente no crescimento do fungo em Erlenmeyers de 250 mL contendo 20 mL de meio líquido. Numa segunda etapa, os experimentos foram conduzidos em biorreatores de 1,5 L (Bioflo-NewBrunswick) e por último em um biorreator de 14 L. No último caso, o biorreator em questão foi especialmente desenhado e construído com o intuito de minimizar efeitos de cisalhamento da hifa durante o cultivo, mantendo ainda níveis adequados de aeração. Em Erlenmeyer foram feitos cultivos utilizando meio composto por 2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de levedura (DB-EL), além de um meio potencialmente de menor custo que era composto por 2,0% de sacarose e 3,2% de milhocina (SM). A biomassa total obtida nos cultivos com meio SM foi compatível com aquela obtida no meio DB-EL. Os cultivos subsequentes realizados em biorreator utilizaram então o meio SM. O maior nível de biomassa fúngica obtida nos cultivos com biorreator agitado por pás (1,5 L) foi de 7,0 g/L, após 12 dias de crescimento. As maiores produtividades foram observadas a partir do 7o dia de cultivo, atingindo 0,93 g/L.dia quando a biomassa total era de 6,5 g/L. No biorreator de 14 L foram realizados 3 cultivos em condições diferenciadas (denominados de A, B e C). No cultivo A não houve intervenção em relação à correção de pH ou nível de nutrientes disponíveis ao longo de 14 dias. No cultivo B foi realizado o controle do pH a fim de mantê-lo entre 4,0 e 5,0. No cultivo C foi realizada a adição de sacarose correspondente a uma reposição de 5 g/L após 5 dias de crescimento. Os cultivos foram monitorados quanto à biomassa produzida, o pH, o teor de açúcar residual e o nível de O2 dissolvido. De forma geral, o acúmulo de biomassa sempre foi seguido pelo consumo de açúcares, pela diminuição nos níveis de O2 dissolvido e pela tendência de elevação do pH. A maior quantidade de biomassa foi obtida no cultivo C (14,1 g/L), correspondendo a uma produtividade de 1,72 g/L.dia. O surgimento de clamidósporos foi verificado em todos os tipos de cultivo, sendo que no cultivo C (em biorreator de 14 L) foi observada a menor quantidade de clamidósporos. Isso sugeriu que nessa situação houve melhores condições de crescimento para o fungo e menor estresse nutricional ou induzido por cisalhamento. A viabilidade dos inóculos preparados para a efetiva colonização da madeira foi testada e indicou que o inóculo produzido no biorreator de 14 L, tanto micélio como clamidósporos, foi efetivo para colonizar Eucalyptus grandis. / The present work evaluated suitable systems for producing Ceriporiopsis subvermispora mycelium in submerged cultures. Mycellium produced was used in subsequent inoculation of wood chips in biopulping processes. The development of appropriated technologies for producing large amounts of inoculum may be a key step in biopulping, since currently there are no established processes designed to produce basidiomycetes mycelium to supply biopulping demands. Even a small biopulping plant (200 ton pulp / day) may require about 1 kg of dry mycelium/day, taking into account inoculation of 5 g of dry mycelium/ton of wood to be biotreated. Thus, the success of this process may depend on the low cost of large scale fungal inoculum production. The experiments were conducted initially in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 20 mL of liquid medium. In a second step, the experiments were conducted in bioreactors of 1.5 L (Bioflo-NewBrunswick) and finally in a bioreactor of 14 L. In the latter case, the bioreactor has been designed and constructed in order to minimize the effects of shear stress during cultivation and supply suitable aeration levels. Culture broths were composed of 2.4% potato extract and 0.7% yeast extract (BD-EL) or 2.0% sucrose and 3.2% of corn steep liquor (SM) that represent a potentially lower cost culture broth. The total biomass obtained in flask-cultures with SM broth was similar to that obtained with DB-EL. Cultures performed in the subsequent bioreactor used then the SM broth. The higher level of fungal biomass obtained in the cultures performed in the 1.5 L-stirred bioreactor was 7.0 g/L after 12 days. The highest mycelium yield was observed from the 7th day of cultivation, reaching 0.93 g/L.day and 6.5 g/L total biomass. In the 14 L-bioreactor, 3 experiments were performed in different conditions (called A, B and C). In cultivation A, no interventions were performed to correct the culture pH or the level of available nutrients over 14 days of culturing. In culture B pH was controlled to keep it between 4.0 and 5.0. Cultivation C was carried out with addition of sucrose (final concentration of 5 g/L) after 5 days of growth. All cultures were monitored with basis on the biomass produced, culture pH, residual sugar content and dissolved O2 levels. In general, biomass accumulation was always followed by sugar consumption, decrease in dissolved O2 levels and a rising tendency for the pH values. The highest biomass amount was obtained in culture C (14.1 g / L), corresponding to a yield of 1.72 g/L.day. The presence of clamydospores was observed in all cultures, whereas in culture C (in 14 L bioreactor) it appeared at the lowest amounts. This fact suggested that culture C presented the lowest stress level for the fungus, including low hypha shear stress and low nutritional depletion. The viability of inoculum prepared, both mycelium and clamydospores, was checked by culturing them on Eucalyptus grandis wood chips. Both inoculum types (prepared from the 14 L-bioreactor) were efficient on colonizing wood chips and to produce the manganese peroxidase enzyme.

No presente trabalho buscaram-se formas adequadas de produzir micélio de Ceriporiopsis subvermispora em culturas submersas, com o objetivo de preparar inóculo destinado ao processo de biopolpação. A obtenção de inóculo pode ser considerada uma etapa chave na biopolpação, visto que atualmente não existem processos industriais estabelecidos para a produção de micélio de basidiomicetos em quantidades compatíveis com a demanda prevista no processo. Mesmo uma planta industrial pequena de biopolpação (200 ton de polpa/dia) pode demandar cerca de 1 kg de micélio seco/dia, considerando-se as cargas de inoculação de 5 g de micélio seco/ton de madeira tratada. Desta forma, o sucesso desse processo pode depender de um baixo custo da produção dos inóculos fúngicos em larga escala. Os experimentos realizados consistiram inicialmente no crescimento do fungo em Erlenmeyers de 250 mL contendo 20 mL de meio líquido. Numa segunda etapa, os experimentos foram conduzidos em biorreatores de 1,5 L (Bioflo-NewBrunswick) e por último em um biorreator de 14 L. No último caso, o biorreator em questão foi especialmente desenhado e construído com o intuito de minimizar efeitos de cisalhamento da hifa durante o cultivo, mantendo ainda níveis adequados de aeração. Em Erlenmeyer foram feitos cultivos utilizando meio composto por 2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de levedura (DB-EL), além de um meio potencialmente de menor custo que era composto por 2,0% de sacarose e 3,2% de milhocina (SM). A biomassa total obtida nos cultivos com meio SM foi compatível com aquela obtida no meio DB-EL. Os cultivos subsequentes realizados em biorreator utilizaram então o meio SM. O maior nível de biomassa fúngica obtida nos cultivos com biorreator agitado por pás (1,5 L) foi de 7,0 g/L, após 12 dias de crescimento. As maiores produtividades foram observadas a partir do 7o dia de cultivo, atingindo 0,93 g/L.dia quando a biomassa total era de 6,5 g/L. No biorreator de 14 L foram realizados 3 cultivos em condições diferenciadas (denominados de A, B e C). No cultivo A não houve intervenção em relação à correção de pH ou nível de nutrientes disponíveis ao longo de 14 dias. No cultivo B foi realizado o controle do pH a fim de mantê-lo entre 4,0 e 5,0. No cultivo C foi realizada a adição de sacarose correspondente a uma reposição de 5 g/L após 5 dias de crescimento. Os cultivos foram monitorados quanto à biomassa produzida, o pH, o teor de açúcar residual e o nível de O2 dissolvido. De forma geral, o acúmulo de biomassa sempre foi seguido pelo consumo de açúcares, pela diminuição nos níveis de O2 dissolvido e pela tendência de elevação do pH. A maior quantidade de biomassa foi obtida no cultivo C (14,1 g/L), correspondendo a uma produtividade de 1,72 g/L.dia. O surgimento de clamidósporos foi verificado em todos os tipos de cultivo, sendo que no cultivo C (em biorreator de 14 L) foi observada a menor quantidade de clamidósporos. Isso sugeriu que nessa situação houve melhores condições de crescimento para o fungo e menor estresse nutricional ou induzido por cisalhamento. A viabilidade dos inóculos preparados para a efetiva colonização da madeira foi testada e indicou que o inóculo produzido no biorreator de 14 L, tanto micélio como clamidósporos, foi efetivo para colonizar Eucalyptus grandis. / The present work evaluated suitable systems for producing Ceriporiopsis subvermispora mycelium in submerged cultures. Mycellium produced was used in subsequent inoculation of wood chips in biopulping processes. The development of appropriated technologies for producing large amounts of inoculum may be a key step in biopulping, since currently there are no established processes designed to produce basidiomycetes mycelium to supply biopulping demands. Even a small biopulping plant (200 ton pulp / day) may require about 1 kg of dry mycelium/day, taking into account inoculation of 5 g of dry mycelium/ton of wood to be biotreated. Thus, the success of this process may depend on the low cost of large scale fungal inoculum production. The experiments were conducted initially in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 20 mL of liquid medium. In a second step, the experiments were conducted in bioreactors of 1.5 L (Bioflo-NewBrunswick) and finally in a bioreactor of 14 L. In the latter case, the bioreactor has been designed and constructed in order to minimize the effects of shear stress during cultivation and supply suitable aeration levels. Culture broths were composed of 2.4% potato extract and 0.7% yeast extract (BD-EL) or 2.0% sucrose and 3.2% of corn steep liquor (SM) that represent a potentially lower cost culture broth. The total biomass obtained in flask-cultures with SM broth was similar to that obtained with DB-EL. Cultures performed in the subsequent bioreactor used then the SM broth. The higher level of fungal biomass obtained in the cultures performed in the 1.5 L-stirred bioreactor was 7.0 g/L after 12 days. The highest mycelium yield was observed from the 7th day of cultivation, reaching 0.93 g/L.day and 6.5 g/L total biomass. In the 14 L-bioreactor, 3 experiments were performed in different conditions (called A, B and C). In cultivation A, no interventions were performed to correct the culture pH or the level of available nutrients over 14 days of culturing. In culture B pH was controlled to keep it between 4.0 and 5.0. Cultivation C was carried out with addition of sucrose (final concentration of 5 g/L) after 5 days of growth. All cultures were monitored with basis on the biomass produced, culture pH, residual sugar content and dissolved O2 levels. In general, biomass accumulation was always followed by sugar consumption, decrease in dissolved O2 levels and a rising tendency for the pH values. The highest biomass amount was obtained in culture C (14.1 g / L), corresponding to a yield of 1.72 g/L.day. The presence of clamydospores was observed in all cultures, whereas in culture C (in 14 L bioreactor) it appeared at the lowest amounts. This fact suggested that culture C presented the lowest stress level for the fungus, including low hypha shear stress and low nutritional depletion. The viability of inoculum prepared, both mycelium and clamydospores, was checked by culturing them on Eucalyptus grandis wood chips. Both inoculum types (prepared from the 14 L-bioreactor) were efficient on colonizing wood chips and to produce the manganese peroxidase enzyme.

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.

Este trabalho compreendeu estudar e definir as condições de cultivo que maximizam a produção de manganês peroxidases (MnPs) e lacases (Lacs) por C. subvermispora, fungo de degradação branca da madeira envolvido em processos industriais de biopolpação. O estudo envolveu cultivos submersos, em superfície ou com micélio imobilizado em espuma de poliuretano em meios complexo ou definido, e cultivos imobilizados em meio definido nos quais foram avaliados os efeitos: de diferentes concentrações de Mn2+, dos indutores 2,5-xilidina e álcool veratrílico, e do surfactante Tween 80, que levaram a diferentes níveis de expressões de Lacs e MnPs. Para a determinação de como essas condições afetam a produção das enzimas oxidativas (MnPs e Lacs), os cultivos foram avaliados cineticamente quanto à concentração de proteínas, às atividades enzimáticas, ao espectro de absorção de luz na região UV-VIS, ao teor de açúcares redutores, ao crescimento micelial, ao teor de amônio, ao pH, à condutividade elétrica. Também foram realizadas análises eletroforéticas de extratos de cultivos selecionados. Nos cultivos que tiveram como inóculo discos de micélio, a condição imobilizada em meio de composição complexa demonstrou potencial para produção de Lac (147,5 UI/L). Já nos cultivos inoculados com suspensão de micélio macerado em água, a condição imobilizada em meio de composição definida se destacou com produção seletiva de MnP (277,5 UI/L). Verificou-se que os cultivos em meio complexo nas formas submersa e imobilizada favoreceram a produção de Lac em detrimento de MnP. Nos cultivos de C. subvermispora imobilizado em espuma de poliuretano, em meio definido, a variação da concentração de manganês no meio de cultura alterou a produção de MnP, sendo a concentração de 11 ppm de Mn+2 promotora da máxima atividade (108,5 UI/L). No entanto, ao suprimir manganês do meio, ocorreu produção seletiva de Lac (15,5 UI/L). Com a suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com 0,5 e 1,0 mM de 2,5-xilidina, foram alcançados máximos de atividade de Lac de 14,0 e 22 UI/L, respectivamente. A atividade máxima de MnP não foi afetada pela adição de 2,5-xilidina. Não houve aumentos significativos nas atividades máximas de Lac e de MnP quando o meio foi suplementado com álcool veratrílico. A suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com Tween 80 nas concentrações de 0,05% e 0,5% v/v, em adição a 2,5-xilidina 1,0 mM, aumentou ainda mais a produção de Lac, com máximos de atividade de 53 e 61 UI/L, e de MnP, com picos de 175 e 182 UI/L, respectivamente. As eletroforeses em condições desnaturantes revelaram bandas proteicas de 12,4 a 118,3 KDa e nos géis de atividade foram detectadas atividades de MnP e Lac com mais de uma banda de atividade. Durante os cultivos, a exaustão de açúcares redutores acarretou em diminuição da concentração de micélio fúngico e aumento da concentração de nitrogênio amoniacal no meio, provavelmente devido à ocorrência de autólise celular. O pH e a condutividade variaram relativamente pouco. Em meio complexo, obsevou-se aumento da condutividade durante o cultivo, provavelmente devido à secreção de ácidos orgânicos pelo fungo. / This work involved the research and definition of the culture conditions that maximize the production of manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) by C. subvermispora, a white-rot fungus studied in biopulping industrial processes. The study involved submerged or static cultures with immobilized mycelium in polyuretane foam in complex or defined medium, and immobilized cultures in defined medium with different concentrations of Mn2+ and inductors, 2.5-xylidin and veratryl alcohol, and surfactant, Tween 80, resulting in different expressions levels of MnPs and Lacs. To determine how these conditions affect the production of oxidative enzymes (MnP and Lac), the cultures were evaluated kinetically regarding the concentration of proteins, enzymatic activities, the absorption of light in the UV-VIS regions, the concentration of reducing sugars, the micelyal growth, the concentration of ammonium, pH, electrical conductivity. We also performed electrophoretic analysis of some selected cultures. In the cultures inoculated whith discs of mycelium, the condition immobilized in poliuretane foam whith complex medium showed potential for producing Lac (147.5 IU / L). In the cultures inoculated with homogenized mycelium, the immobilized condition whith defined medium showed selective production of MnP (277.5 IU/L). It was found that the submerged and immobilized cultures in complex medium increased the production of Lac instead of MnP. In the immobilized cultures with defined medium, the variation of the concentration of manganese in the medium altered the production of MnP, being the concentration of 11 ppm that promoting maximum activity (108.5 IU/L). However, in the absence of manganese in the medium, the selective production of Lac (15.5 IU / L) was observed. With the supplementation of the defined medium containing 11 ppm Mn+2 with 0.5 or 1.0 mM 2.5-xylidine, maximum activities of Lac of 14.0 and 22.0 IU / L, respectively, were achieved. The maximum activity of MnP was not affected by the addition of 2.5-xylidine. There was no significant increase in the maximum activities of Lac and MnP when the medium was supplemented with veratryl alcohol. Supplementation of the medium with Tween 80, at concentrations of 0.05% and 0.5% v/v, in addition to 11 ppm Mn+2 and 1.0 mM 2.5-xylidine, further increased the production of Lac, with highest activities of 53 and 61 IU/L; MnP activities were 175 and 182 IU/L, respectively. Electrophoresis under denaturing conditions revealed bands of approximately 12.4-118.3 KDa in the electrophoresis non-denaturing PAGE showed MnP and Lac activities in differents bands. During the cultivations, the exhaustion of sugars led to decreased concentrations of mycelium and increased concentrations of ammonia in the extracts, probably due to the occurrence of cellular autolysis. The pH and conductivity showed low variations. The culture in complex medium showed an increased conductivitywith time, probably due to the secretion of organic acids by the fungus.

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.