Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foi estudada a imobilização de enzimas lacases de Aspergillus sp em quitosana, através de ligação cruzada e sua aplicação na bioconversão de compostos fenólicos em reatores operando em regime batelada e fluxo contínuo (reator de leito fixo). Inicialmente, foi realizada a otimização do processo de imobilização através de um planejamento fatorial do tipo DCCR (delineamento experimental central composto e adição de ponto rotacional). Dentre os níveis de fatores estudados, o experimento que permitiu a obtenção de biocatalisadores com a maior atividade enzimática foi realizado com concentração de glutaraldeído de 1%, pH de 6,5, tempo de 5,0 horas e concentração de enzima igual a 6 g.L-1. Em seguida foi avaliada a estabilidade da enzima imobilizada na estocagem. Verificou-se que a melhor condição para manutenção da atividade enzimática é em solução tampão pH 8,0, na temperatura de 8 °C. Além disso, o biocatalisador foi aplicado na oxidação de 18 diferentes derivados fenólicos. Foi observado que o 4-nitrofenol não pode ser convertido enquanto o 2,5-xilenol e 2,6-xilenol, 2,3,5-trimetilfenol e o p-etilfenol apresentaram conversões acima de 90%, na temperatura de 40°C. Por fim, a lacase imobilizada foi aplicada na bioconversão de dois substratos padrões a siringaldazina e o 2,6-dimetoxifenol para realização do estudo cinético do processo e avaliação da estabilidade operacional. Em regime batelada, foi observado que não é possível reutilizar o biocatalisador quando este participa da reação envolvendo a siringaldazina, enquanto que no processo com o 2,6-DMP, a enzima mantêm sua atividade inicial por até 8 ciclos reacionais. Em fluxo contínuo, quando o biocatalisador é utilizado para mediar a bioconversão de 2,6-DMP, a atividade da enzima imobilizada é mantida por um tempo maior em relação ao observado na bioconversão da siringaldazina. / The immobilization of laccase (Aspergillus sp) on chitosan by cross-linking and its application on bioconversion of phenolic compounds in batch and continuous flow reactors (fixed bed reactor) were studied. The immobilization of enzyme was optimized using an experimental design RCCD (Rotational central composite design). Among the different levels of factors studied, the optimized conditions (in order to obtain the major enzyme activity) were glutaraldehyde concentration of 1%, pH 6.5, immobilization time of 5.0 hours and enzyme concentration of 6 g.L-1. The stability of the immobilized enzyme along the storage time was evaluated. The best condition for maintenance of enzyme activity is in buffer pH 8.0 at 8 °C. Also, the biocatalyst was applied to the biotransformation of eighteen different phenol derivatives. It was observed that 4 # nitrophenol was not converted while the 2,5 # xylenol and 2,6 # xylenol, 2,3,5 # trimethylphenol and the ethylphenol showed reactions yields up 90% at 40 °C. The immobilized laccase was applied to bioconversion of two substrates: syringaldazine and 2,6 # dimethoxyphenol. The kinetic of process and enzyme operational stability was studied. In batch reactors, it was not possible to reuse the enzyme when it was applied to syringaldazine bioconversion. Therefore, when the enzyme is applied to bioconversion of 2,6 # DMP, the activity was stable for eight reaction batchs. The biocatalyst was applied in packed bed reactors. For the bioconversion of 2,6 # DMP, the activity of the immobilized enzyme is maintained for a longer time if compared to that observed in the bioconversion of syringaldazine.

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Elisângela Soares Gomes Pepe / Coorientador: Mariana Rangel Pereira / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: João Martins Pizauro Junior / Resumo: O mercado industrial está se tornando cada vez mais dependente do uso de enzimas como catalisadores. Dentre as enzimas utilizadas industrialmente estão as de origem microbiana, por serem ativas nas mais diversas condições. As lacases são enzimas com alto potencial, pois atuam sobre diversos compostos, o que possibilita uma vasta diversidade de possíveis aplicações. Entre as formas de prospecção de novas enzimas microbianas, encontra-se a metagenômica. Diante disto, foi realizada a busca por potenciais lacases seguindo uma estratégia "sequence-driven" em uma base de dados metagenomicos composta por amostras de diversos ambientes, pertencente ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP). As ORFs previamente anotadas por similaridade de sequências e domínios conservados como possíveis "Multicopper oxidases" (grupo no qual se encontram as lacases) foram prospectadas pela região conservada para lacases L3 (HLHGH). Esta estratégia retornou três ORFs, a ORF50MF; a ORF51ME e a ORF13SE (lacmeta), as quais foram clonadas e submetidas as análises de super-expressão e purificação. LacMeta, similar em 82% com a sequência de proteína hipotética de Streptomyces rubidus [WP_069465126.1], foi a proteína que apresentou o melhor resultado de expressão e purificação, sendo então submetida a caracterização cinética. A proteína fusionada a uma cauda de hexa-histidina foi purificada na forma homo-trimérica, com 107 kDa, e apresentou atividade ótima em pH ácido para o substrato AB... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The industrial market is becoming increasingly dependent on the use of enzymes as biocatalysts. Among the enzymes used industrially are those of microbial origin, because they are active in the most diverse conditions. Laccases are enzymes with high potential, since they act on several compounds, which allows a wide diversity of possible applications. Among the search for new forms of microbial enzymes, is the metagenomic. In this way, the search for potential laccases was carried out following a sequence-driven strategy in a metagenomic database composed of samples from different environments, belonging to the Laboratory of Biochemistry of Microorganisms and Plants (LBMP). The ORFs previously annotated by similarity of sequences and conserved domains as possible "Multicopper oxidases" (group in which the laccases are) were prospected by the region conserved for laccases L3 (HLHGH). This strategy returned three ORFs, the ORF50MF; the ORF51ME and the ORF13SE (lacmeta), which were cloned and subjected to super-expression and purification analyzes. LacMeta, similar in 82% to the hypothetical protein sequence of Streptomyces rubidus [WP_069465126.1], was the protein that presented the best expression and purification result and was then subjected to kinetic characterization. The protein fused to a hexa-histidine tail was purified in the homo-trimeric form with 128.22 kDa and presented optimum acidic pH activity for the ABTS substrate, for which obtained the catalytic parameters k... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-21T04:15:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344109.pdf: 2132551 bytes, checksum: ce482fdce49fb3dee55e987122afb313 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fungos do gênero Pleurotus são conhecidos como produtores de lacases. Esta enzima tem vasta aplicação nas indústrias de bebidas, alimentos, têxteis, bem como na degradação diversos de poluentes ambientais. A fim de se minimizar os custos de produção desta enzima, diversos resíduos agroindustriais, normalmente disponíveis na região de produção, podem ser utilizados na formulação de meios de cultivo. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivos (a) caracterizar quimicamente os resíduos lignocelulósicos água de imersão de folhas secas de bananeira e pó de cascas de banana; (b) estudar a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju, em frascos agitados e biorreator, utilizando resíduos da bananicultura na composição do meio de cultivo; (c) avaliar a influência da velocidade de agitação sobre a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju; (d) caracterizar a enzima produzida; (e) avaliar a eficácia do caldo enzimático bruto sobre a degradação de bisfenol-A. Os experimentos em frascos agitados foram realizados em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio de cultivo inoculados com dois discos de ágar de 12 mm contendo micélio fúngico. Os frascos foram mantidos a 30 oC e agitação de 110 min-1, por 15 dias. Os experimentos em biorreator foram realizados em modelo BIOSTAT B da marca B. BRAUN com volume de trabalho de 4 L, sendo o inóculo 10% deste volume. O pH inicial foi ajustado em 6,0, a temperatura fixada em 30 oC, a aeração em 0,3 vvm e a velocidade de agitação em 100, 350 e 500 min-1, dependendo do experimento. Os resíduos água de imersão de folhas secas de bananeira e pó de cascas de banana apresentaram relação C:N iguais a 13,8 e 16,9, respectivamente. Os percentuais de cinzas foram 28,6 e 12,8% para água de imersão e pó de cascas de banana, respectivamente. O meio de cultivo OXI, formulado com resíduos da bananicultura, mostrou-se adequado para a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju, sendo os maiores valores de atividade encontrados nos testes em frascos agitados (60 g L-1 pó de cascas de banana) e em biorreator (45 g L-1 pó de cascas de banana e 350 min-1) iguais a 2.416 e 1.850 U L-1, respectivamente. As atividades obtidas utilizando-se velocidades de agitação 100 e 500 min-1 foram 200 e 9 vezes, respectivamente, inferiores às obtidas utilizando-se velocidade de 350 min-1. Encontrou-se como pH ótimo os valores de 2,5 e 3,0. Com relação à temperatura ótima, todas as temperaturas avaliadas (20, 30, 40 e 50 oC) apresentaram atividade relativa próxima a 100 %. Observou-semaior estabilidade da enzima nos valores de pH 5 e 7; e temperatura de estabilidade na faixa de 20 a 40 oC. Os valores de Km e Vmáx foram 0,1 mM e 1,25 mM min-1, respectivamente. O caldo enzimático bruto foi capaz de degradar 100 % do bisfenol-A (500 mg L-1) em 48 h de incubação.<br> / Abstract : Fungi of the Pleurotus genus are known as laccase producers. This enzyme is widely applied in the food, beverage and textile industries as well as in the degradation of various environmental pollutants. In order to minimize production costs for this enzyme, several agro-industrial wastes, normally available in the production area, may be used to formulate the culture media. Thus, the objectives of this study were to: (a) chemically characterize the lignocellulosic wastes: immersion water of dried banana leaves and banana peel powder; (b) study laccase production by Pleurotus sajor-caju, in shake flasks and bioreactor, using banana plantation wastes in the culture medium composition; (c) evaluate the influence of agitation speed on laccase production by Pleurotus sajor-caju; (d) characterize the enzyme produced; (e) evaluate the efficacy of the crude enzymatic broth on bisphenol-A degradation. The experiments in shake flasks were carried out in Erlenmeyer 500 mL flasks containing 100 mL of culture medium inoculated with two 12 mm agar discs containing fungal mycelium. The flasks were kept at 30 oC with 110 min-1 agitation, for 15 days. The experiments in bioreactor were carried out in a B. BRAUN BIOSTAT B fermenter with 4 L work volume, with inoculum being 10 % of this volume. Initial pH was adjusted to 6.0, temperature fixed at 30 oC, aeration at 0.3 vvm and agitation speed at 100, 350 and 500 min-1, depending on the experiment. The water wastes from the immersion of dried banana leaves and banana peel powder had a C:N ratio equal to 13.8 and 16.9, respectively. Ash percentages were 28.6 and 12.8 % for immersion water and banana peel powder, respectively. The OXI culture medium, formulated with banana plantation wastes proved to be adequate for laccase production by Pleurotus sajor-caju, with the greatest activity values being found in tests with flasks agitated at (60 g L-1 banana peel powder) and in bioreactor (45 g L-1 banana peel powder and 350 min-1) equal to 2,416 and 1,850 U L-1, respectively. The activities obtained using 100 and 500 min-1 agitation speeds were 200 and 9 times, respectively, lower than those obtained using a speed of 350 min-1. The values of 2.5 and 3.0 were considered ideal for the pH. In relation to ideal temperature, all evaluated temperatures (20, 30, 40 and 50 oC) showed activity relatively close to 100 %. Greater enzyme stability was observed with pH values of 5 and 7; and temperature stability in the range of 20 to 40 oC. The Km and Vmáx values were 0.1 mM and 1.25 mM min-1, respectively. Thecrude enzymatic broth was able to degrade the bisphenol-A (500 mg L-1) 100 % in 48 h incubation.

Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-03T17:26:08Z No. of bitstreams: 1 Tese Fernanda Bettin.pdf: 3264365 bytes, checksum: 15d4eaeafc7deb4520c2e8ae285e8490 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-03T17:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Fernanda Bettin.pdf: 3264365 bytes, checksum: 15d4eaeafc7deb4520c2e8ae285e8490 (MD5)

Submitted by cmquadros@ucs.br (cmquadros@ucs.br) on 2018-02-02T10:31:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Simone Zaccaria.pdf: 993465 bytes, checksum: 0a1335797da601a4322d237b9b0aee3a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-02T10:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Simone Zaccaria.pdf: 993465 bytes, checksum: 0a1335797da601a4322d237b9b0aee3a (MD5) Previous issue date: 2018-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-08T19:57:48Z No. of bitstreams: 2 Tese Luciana de Oliveira.pdf: 1908204 bytes, checksum: d106719829e859b269968dc234a2c86c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Luciana de Oliveira.pdf: 1908204 bytes, checksum: d106719829e859b269968dc234a2c86c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2009-07-03 / CAPES; PPBio; CNPq; DAAD / Os fungos compreendem um grupo heterogêneo de microrganismos, atuando como sapróbios, parasitas e simbiontes. Como sapróbios, podem viver em diversos ambientes, especialmente no solo. Este trabalho teve como objetivos o isolamento, identificação e atividade enzimática (lacase e peroxidase) de fungos filamentosos do solo do Vale do Catimbau, semi-árido pernambucano. Quatro coletas de solo foram feitas durante os períodos chuvosos (2) e de estiagem (2). Foram identificadas 87 espécies de fungos filamentosos pertencentes aos fungos anamorfos (74), Zygomycota (8) e Ascomycota (6). Penicillium e Aspergillus predominaram com 28 e 18 espécies, respectivamente. Aspergillus fumigatus, A. versicolor, A. terreus, Fusarium solani, Penicillium commune, P. decumbens, P. restrictum, P. verruculosum e P. waksmanii foram classificados como abundantes. Não foram observadas diferenças significativas entre as unidades formadores de colônia em relação aos períodos chuvoso e de estiagem e às superfície e profundidade do solo. O Índice de Diversidade de Shannon-Wiener foi de 4,84 bits por indivíduo. Das espécies identificadas, Pestalotiopsis palustris e Pestalozziella artocarpi estão sendo citadas pela primeira vez para as Américas do Sul e Latina, respectivamente. Trinta e duas espécies foram testadas quanto à atividade enzimática, onde 22 e 27 foram positivas para a lacase e peroxidase, respectivamente. Chaetomium globosum apresentou melhor atividade lacase, enquanto Pithomyces chartarum revelou melhor atividade para peroxidase. O pH ótimo para atividade lacase foi 3,0 em Pithomyces chartarum e, 4,5 em C. pallescens para peroxidase. A temperatura ótima foi observada em C. globosum foi 70ºC por 60 min para lacase e, 50ºC por 60 min em Mirothecium roridum para peroxidase. Curvularia pallescens, Pestalotiopsis palustris, Pestalozziella artocarpi e Scopulariopsis chartarum estão sendo citadas como primeiro registro com atividade para fenoloxidases. Os resultados desta pesquisa indicam que os fungos anamórficos predominam no solo do Vale do Catimbau e que as espécies testadas quanto a produção de fenoloxidases são promissoras para a biotecnologia.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES

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Fungos Basidiomycetes são citados como degradadores de fenóis e corantes que podem estar em efluentes. Neste estudo Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor foram pesquisados na produção de lacase e descoramento de vermelho congo e verde malaquita. O crescimento radial em ágar BD foi 8,2 a 9,5 mm dia-1 no P. sanguineus e 5,4 a 7,1 mm dia-1 no T. versicolor A biomassa dos fungos foi 1,6 a 1,7 g L-1 em extrato de malte (EM) e 0,32 a 0,34 g L-1 em caldo Bushnell-Haas(BH), detectando lacase após 5 dias. Em 20 dias de cultura estática em caldo EM, T. versicolor produziu 800 unidades de siringaldazina e P. sanguineus 400. Aeração favoreceu a produção de lacase no P. sanguineus. As taxas de descoramento do vermelho congo pelos fungos em BH foram de 5,5 a 8 mg L-1 dia-1 após 48 horas. O descoramento após 10 dias foi 60% (BH) e 92% (BH+ 0,001% de glicose, BHG), no P. sanguineus (32 Unidades de lacase produzidas ), e 80% (BH) e 99% (BHG) no T . versicolor (438 U. lacase). As taxas de descoramento do verde malaquita no P. sanguineus e T. versicolor após 48 horas foram 5,0 a 9 mg L-1 dia-1 em BH. Descoramento após 10 dias foi 28% (BH) e 40% (BHG) pelo P. sanguineus (83 U. lacase) e 84% (BH) e 68% (BHG) pelo T. versicolor (311 U.lacase). Os resultados sugerem que os fungos Basidiomycetes podem ser utilizados para tratamento de efluentes industrais contendo estes e corantes similares. / Basidiornycete fungi are cited as being able to degrade phenolics and dyes which can be presente in effluents. In this study Pycnoporus sanguineus and Trametes versicolor were investigated for laccase production and Congo red and Malachite green discolorization. Radial growth on potato dextrose agar was 8.2-9. 5 mm d-1 for P. sanguineus and 5.4-7.1 mm d-1 for T. versicolor. Biomass production for both fungi was 1.6-1.7 g L-1 in malt extract broth (MEB) and 0.32-0.34 g L-1 in Bushnell-Haas broth (BHB), with laccase detected after 5 days. After 20 days static culture in MEB, T. versicolor produced 800 syringaldazine units and P. sanguineus 400. Aeration favored laccase production by P. sanguineus. Congo red discoloration rate by both fungi in BHB was 5.5-8 mg L-1 d-1 after 48h . Discoloration after 10 d was 60% (BHB) and 92% (BHB+0.001% glucose, BHBG) for P. sanguineus (32 laccase units produced) and 80% (BHB) and 99% (BHBG) for T . versicolor (438 laccase units). Malachite green discoloration rate after 48 h by P. sanguineus and T. versicolor was 5.0-9.0 mg L-1 d-1 in BHB. Discoloration after 10 d was 28% (BHB) and 40% (BHBG) for P. s anguineus (83 laccas e units) and 84% (BHB) and 68% (BHBG) for T. versicolor (311 laccase units). These results suggest that these basidiornycete fungi could be used for the treatment of industrial effluents containing these, and related, dyestuffs .

Fungos Basidiomycetes são citados como degradadores de fenóis e corantes que podem estar em efluentes. Neste estudo Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor foram pesquisados na produção de lacase e descoramento de vermelho congo e verde malaquita. O crescimento radial em ágar BD foi 8,2 a 9,5 mm dia-1 no P. sanguineus e 5,4 a 7,1 mm dia-1 no T. versicolor A biomassa dos fungos foi 1,6 a 1,7 g L-1 em extrato de malte (EM) e 0,32 a 0,34 g L-1 em caldo Bushnell-Haas(BH), detectando lacase após 5 dias. Em 20 dias de cultura estática em caldo EM, T. versicolor produziu 800 unidades de siringaldazina e P. sanguineus 400. Aeração favoreceu a produção de lacase no P. sanguineus. As taxas de descoramento do vermelho congo pelos fungos em BH foram de 5,5 a 8 mg L-1 dia-1 após 48 horas. O descoramento após 10 dias foi 60% (BH) e 92% (BH+ 0,001% de glicose, BHG), no P. sanguineus (32 Unidades de lacase produzidas ), e 80% (BH) e 99% (BHG) no T . versicolor (438 U. lacase). As taxas de descoramento do verde malaquita no P. sanguineus e T. versicolor após 48 horas foram 5,0 a 9 mg L-1 dia-1 em BH. Descoramento após 10 dias foi 28% (BH) e 40% (BHG) pelo P. sanguineus (83 U. lacase) e 84% (BH) e 68% (BHG) pelo T. versicolor (311 U.lacase). Os resultados sugerem que os fungos Basidiomycetes podem ser utilizados para tratamento de efluentes industrais contendo estes e corantes similares. / Basidiornycete fungi are cited as being able to degrade phenolics and dyes which can be presente in effluents. In this study Pycnoporus sanguineus and Trametes versicolor were investigated for laccase production and Congo red and Malachite green discolorization. Radial growth on potato dextrose agar was 8.2-9. 5 mm d-1 for P. sanguineus and 5.4-7.1 mm d-1 for T. versicolor. Biomass production for both fungi was 1.6-1.7 g L-1 in malt extract broth (MEB) and 0.32-0.34 g L-1 in Bushnell-Haas broth (BHB), with laccase detected after 5 days. After 20 days static culture in MEB, T. versicolor produced 800 syringaldazine units and P. sanguineus 400. Aeration favored laccase production by P. sanguineus. Congo red discoloration rate by both fungi in BHB was 5.5-8 mg L-1 d-1 after 48h . Discoloration after 10 d was 60% (BHB) and 92% (BHB+0.001% glucose, BHBG) for P. sanguineus (32 laccase units produced) and 80% (BHB) and 99% (BHBG) for T . versicolor (438 laccase units). Malachite green discoloration rate after 48 h by P. sanguineus and T. versicolor was 5.0-9.0 mg L-1 d-1 in BHB. Discoloration after 10 d was 28% (BHB) and 40% (BHBG) for P. s anguineus (83 laccas e units) and 84% (BHB) and 68% (BHBG) for T. versicolor (311 laccase units). These results suggest that these basidiornycete fungi could be used for the treatment of industrial effluents containing these, and related, dyestuffs .