Fungos Basidiomycetes são citados como degradadores de fenóis e corantes que podem estar em efluentes. Neste estudo Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor foram pesquisados na produção de lacase e descoramento de vermelho congo e verde malaquita. O crescimento radial em ágar BD foi 8,2 a 9,5 mm dia-1 no P. sanguineus e 5,4 a 7,1 mm dia-1 no T. versicolor A biomassa dos fungos foi 1,6 a 1,7 g L-1 em extrato de malte (EM) e 0,32 a 0,34 g L-1 em caldo Bushnell-Haas(BH), detectando lacase após 5 dias. Em 20 dias de cultura estática em caldo EM, T. versicolor produziu 800 unidades de siringaldazina e P. sanguineus 400. Aeração favoreceu a produção de lacase no P. sanguineus. As taxas de descoramento do vermelho congo pelos fungos em BH foram de 5,5 a 8 mg L-1 dia-1 após 48 horas. O descoramento após 10 dias foi 60% (BH) e 92% (BH+ 0,001% de glicose, BHG), no P. sanguineus (32 Unidades de lacase produzidas ), e 80% (BH) e 99% (BHG) no T . versicolor (438 U. lacase). As taxas de descoramento do verde malaquita no P. sanguineus e T. versicolor após 48 horas foram 5,0 a 9 mg L-1 dia-1 em BH. Descoramento após 10 dias foi 28% (BH) e 40% (BHG) pelo P. sanguineus (83 U. lacase) e 84% (BH) e 68% (BHG) pelo T. versicolor (311 U.lacase). Os resultados sugerem que os fungos Basidiomycetes podem ser utilizados para tratamento de efluentes industrais contendo estes e corantes similares. / Basidiornycete fungi are cited as being able to degrade phenolics and dyes which can be presente in effluents. In this study Pycnoporus sanguineus and Trametes versicolor were investigated for laccase production and Congo red and Malachite green discolorization. Radial growth on potato dextrose agar was 8.2-9. 5 mm d-1 for P. sanguineus and 5.4-7.1 mm d-1 for T. versicolor. Biomass production for both fungi was 1.6-1.7 g L-1 in malt extract broth (MEB) and 0.32-0.34 g L-1 in Bushnell-Haas broth (BHB), with laccase detected after 5 days. After 20 days static culture in MEB, T. versicolor produced 800 syringaldazine units and P. sanguineus 400. Aeration favored laccase production by P. sanguineus. Congo red discoloration rate by both fungi in BHB was 5.5-8 mg L-1 d-1 after 48h . Discoloration after 10 d was 60% (BHB) and 92% (BHB+0.001% glucose, BHBG) for P. sanguineus (32 laccase units produced) and 80% (BHB) and 99% (BHBG) for T . versicolor (438 laccase units). Malachite green discoloration rate after 48 h by P. sanguineus and T. versicolor was 5.0-9.0 mg L-1 d-1 in BHB. Discoloration after 10 d was 28% (BHB) and 40% (BHBG) for P. s anguineus (83 laccas e units) and 84% (BHB) and 68% (BHBG) for T. versicolor (311 laccase units). These results suggest that these basidiornycete fungi could be used for the treatment of industrial effluents containing these, and related, dyestuffs .

Orientador: Jose Augusto Rosario Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zampieri_LuizArthur_M.pdf: 1219190 bytes, checksum: 50f1c90b246b806bd16bb30df4ecbbaf (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho estudou-se a bioxidação do sesquiterpeno valenceno (C15H24), produzindo o bioflavorizante nootkatona (C15H22O), buscando as condições ótimas para obtenção do máximo rendimento. Esta reação foi realizada utilizando dois sistemas enzimáticos distintos: o sistema lacase/mediador (LMS) de Trametes versicolor com mediador HBT (hidroxibenzotriazol) ou TEMPO (tetrametilpiperidin-N-oxil) e o sistema utilizando o complexo enzimático do citocromo P-450 de Chaetomium globosum. Outros microorganismos testados foram Botrytis cinerea, Mortierella isabellina e Mortierella ramaniana. As diversas variáveis (pH, tempo de reação, concentrações de enzima, mediadores e indutores, condições de aeração, entre outras) envolvidas nas respectivas reações foram estudadas através de planejamento fatorial e modelagem de superfície de resposta. A utilização do sistema LMS de Trametes versicolor mostrou ser uma ferramenta viável para obtenção de nootkatona a partir de valenceno, embora tenhamos obtido rendimento inferior (17%, agitador orbital em pequena escala e 15 % em escala preparativa, sob aeração externa) descrito na literatura (25%, sob aeração, escala preparativa), o que torna nosso procedimento pouco viável para utilização em maior escala, apesar disso, os resultados foram condizentes com os obtidos em reações semelhantes descritos na literatura científica, onde o rendimento de sistemas LMS dificilmente ultrapassa os 15%. O sistema enzimático CYP-450 apresentou rendimento inferior ao sistema lacase/mediador e, este último sistema, HBT mostrou ser um mediador mais eficiente que TEMPO. / Abstract: In this work, we study the sesquiterpene valencene bioxidation (C15H24), which produces the nootkatona biological flavor substance (C15H22O), in an attempt to achieve the best conditions for optimum yield. This reaction was carried out using two different enzymatic systems: the Trametes versicolor laccase-mediator system with HBT mediators (hydroxybenzotriazol), or TEMPO (tetramethyl-piperidine-N-oxide), and the system using the Chaetomium globosum cythocrome P-450 enzymatic complex. Other microorganisms were tested, such as Botrytis cinerea, Mortierella isabellina and Mortierella ramaniana. The different variables involved in the respective reactions were studied by means of factorial planning and modeling the response system. The use of the Trametes versicolor LMS system proved to be a viable tool to obtain nootkatone from valencene, although we have obtained an inferior yield (17% with orbital agitator in small scale and 15% in preparatory scale, under external aeration) in comparison with the highest value described in literature (25% under aeration). Thus, our procedure presents little viability for large scale use, although results were in agreement with those obtained in similar reactions described in scientific literature, in which the yield produced by LMS systems rarely exceeds 15%. The CYP-450 enzymatic system presented lower yield in comparison with the laccase-mediator system and in the latter, HBT turned out to be more efficient than TEMPO. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

A criptococose é infecção fúngica oportunista causada pelo Cryptococcus neoformans com alta incidência em indivíduos imunodebilitados, principalmente entre pacientes com Aids, sendo o número de casos registrados da doença no Brasil, 474.279, de 1980 a junho de 2007. Para melhor compreensão do agente etiológico, da criptococose e dos fatores associados à virulência são necessários estudos adicionais sobre a patogênese deste microrganismo. Dentre os fatores relacionados à virulência, a melanina é um dos principais e sua síntese ocorre por ação da lacase. Assim sendo, foram realizados estudos para avaliar a produção do pigmento entre amostras clínicas e ambientais de C. neoformans sob diferentes condições de pH (5, 6 e 7) e temperatura (25 °C, 30 °C e 35°C). A relação do pigmento com o perfil de sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e anfotericina B também foi avaliada. Os resultados mostraram que não houve comportamento uniforme de melanização entre as amostras. As maiores alterações de pigmentação e crescimento das leveduras foram observadas nos meios de cultura com pH 7 incubados a 35 °C. A técnica de eletroforese em gel PAGE nãodesnaturante mostrou-se uma ferramenta útil na análise da lacase produzida pelas amostras de C. neoformans com posterior quantificação de melanina por densitometria das bandas após reação com o substrato L-dopa. As amostras ambientais apresentaram os maiores valores de intensidade de melanina e ampla faixa de variação. Mais da metade das amostras clínicas (56,2 %) apresentaram as menores intensidades de melanina. A amostra clínica ICB 88 revelou duas bandas de melanina no gel indicando a presença de duas isoformas da lacase. Os testes de sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e anfotericina B, através das metodologias de difusão em agar por disco e fita (E-test®), mostraram que a leitura após 72 h de incubação pode levar a erro na classificação quanto ao perfil de sensibilidade, tanto nos testes com ou sem adição de melanina. Adição de melanina pareceu não interferir nos resultados frente ao fluconazol nas metodologias de difusão em agar a partir de disco e fita (E-test®). Para anfotericina B houve aumento de CIMs para 90,9 % das amostras, sendo 45,4 % superior a 2 diluições com adição de melanina nos testes de sensibilidade na metodologia de difusão em agar a partir de fita (E-test®). / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection caused by Cryptococcus neoformans that has presented increased incidence with the great number of immunocompromised patients, mainly AIDS ones, being 474.273, the number of cases registered in Brazil since 1980 to june 2007. Additional studies about microorganism’s pathogenesis is necessary for better comprehension about the aethyological agent, criptococosis and associated factors to virulence. Among virulence’s factors, melanin is one of the mainly and its synthesis occurs by laccases action. So, some studies were performed to evaluate the melanin pigment’s production between clinical and environmental strains of C. neoformans under different conditions of pH (5, 6 and 7) and temperatures (25 °C, 30 °C and 35 °C). The pigment and susceptibility to fluconazole and amphotericin B relation’s was also evaluated. The results showed that there wasn’t comparable behaviour of melanization among the strains. The higher alterations on yeast’s pigmentation and growth were noted under pH 7 and at 35 °C. The electrophoresis technique on non-denaturant PAGE gel showed to be an useful tool to the analysis of laccase produced by C. neoformans strains and posterior quantification of melanin by spot’s densitometry after reaction with L-dopa substrate. The environmental strains showed the higher values of melanin intensities and large variation range. Over than a half of clinical strains (56.2 %) showed the lower melanin’s intensities. The clinical strain, ICB 88 revealed two melanin spots on gel indicating the presence of two laccase isoforms. The susceptibility antifungal tests with fluconazole and amphotericin B through disk diffusion and E-test® methods showed that reading after 72 hours can induce to mistakes on the susceptibility profile of strains, either in presence or absence of melanin. Addition of melanin on medium surface appears not change the results of susceptibility to fluconazole in disk diffusion and E-test®, but to amphotericin B was observed increase of MICs to 90.9 % of strains, been 45.4 % upper to 2 dilutions after addition of melanin in Etest ® methodology.

A vinhaça e o bagaço de cana são os principais subprodutos oriundos do processamento da cana-de-açúcar nas indústrias sucroalcooleiras, sendo geradas grandes quantidades dos mesmos. O fungo basidiomiceto Pleurotus ostreatus tem a capacidade de degradar materiais lignocelulolíticos e produzir enzimas lignolíticas de interesse para as indústrias. Com o objetivo de avaliar a produção das enzimas lacases e peroxidase, o fungo Pleurotus ostreatus, foi cultivado em meio contendo bagaço pré-tratado e vinhaça, ou em meio contendo apenas vinhaça, em sistema de fermentação semissólido ou submerso; as enzimas extracelulares foram avaliadas após 7, 10 e 12 dias de cultivo. O bagaço peneirado foi considerado pré-tratado fisicamente (T1); para o pré-tratamento T2 o bagaço umedecido foi submetido a autoclave (121°C e 1 atm por 15 min); nos pré-tratamentos químicos, T3 e T4, o bagaço foi tratado com peróxido de hidrogênio e hidróxido de sódio nas seguintes concentrações: 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) e 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) na proporção 1:10 (p/v) e, em seguida foram submetidos à autoclave (121°C e 1 atm por 15min). A vinhaça utilizada foi proveniente de uma indústria sucroalcooleira (V1) e outra de destilaria (V2); a composição físico-química mostrou que a primeira possuía os índices de matéria orgânica e fósforo mais elevados que na vinhaça V2, enquanto que a relação C:N foi menor na vinhaça V1. Os extratos enzimáticos foram obtidos após filtração do meio submerso; para o meio semissólido foi necessário a adição de tampão citrato (1:5 p/v) antes da filtração. A atividade de lacasse e peroxidase em meio submerso, nos tratamentos com a vinhaça V1, foi superior ao observado em meio semissólido. A produção das enzimas em fermentação submersa, utilizando a vinhaça V1, apresentou valores de atividade de lacase, no tratamento TL1 e TL2, de 784,9 e 707,5 U.L-1, com atividade específica de 3,04 e 2,86 U.mg-1, respectivamente, e a amostra VL1, contendo apenas vinhaça, de 1,91 U.mg-1, no 12º dia de fermentação. Os valores mais altos de atividade de peroxidase foram obtidos nos tratamentos TL1, TL2, VL1, com 133,1; 131,2 e 126,1 U.L-1, respectivamente, após 12 dias de cultivo. A maior atividade específica obtida foi na VL1 (0,86 U.mg-1) no 7º dia de cultivo. O pré-tratamento físico do bagaço mostrou melhores condições para a produção das enzimas. Para a produção da lacase e da peroxidase é fundamental a composição da vinhaça. / The vinasse and bagasse are the principal by-products derived from the processing of sugarcane in the sugarcane industry, which generated large amounts of them. The basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus, has the ability to degrade lignocellulolytic materials and produce lignolíticas enzymes of interest to industry. In order to evaluate the production of laccase and peroxidase enzymes, fungus P. ostreatus was grown in medium containing pre-treated bagasse and vinasse, or in medium containing only vinasse in semi-solid or submerged fermentation system; extracellular enzymes were evaluated after 7, 10 and 12 days of cultivation. The screened bagasse was considered pretreated physically (T1); for the pretreatment T2 moistened residue was subjected to autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). The chemical pretreatments, T3 and T4, the residue was treated with hydrogen peroxide and sodium hydroxide solution in the following concentrations 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) and 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) 1:10 (w/v) and then underwent autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). Vinasse used was coming from a sugar and alcohol industry (V1) and a distillery (V2); the physico-chemical composition showed that the former had the rates of organic matter and phosphorus higher than in V2 vinasse, whereas the C: N ratio was lower in V1 vinasse. The enzymatic extracts were obtained after filtration medium the submerged; to semisolid medium was necessary the addition of citrate buffer (1:5 w/v) prior to filtration. The activity of peroxidase and lacasse in submerged medium, in the treatments with the V1 vinasse, was higher than observed in semi-solid medium. The production of enzymes by submerged fermentation using the vinasse V1, presented laccase activity values, in the treatment TL1 and TL2, of 784,9 and 707,5 UI.L-1, with specific activity of 3,04 e 2,86 U.mg-1, on the 12th day of fermentation. Higher values peroxidase activity were obtained in the treatments TL1, TL2, VL1, with 133,1; 131,2 and 126,1 UI.L-1, respectively, after 12 days of culture. The highest specific activity was obtained at VL1 (0,86 U.mg-1) on the 7th day of culture. Physical bagasse pretreatment showed better conditions for the production of enzymes. For the production of the laccase and peroxidase is fundamental composition of vinasse.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T22:24:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290634.pdf: 1887279 bytes, checksum: 38dbb1993715ad8a7209ea8375585349 (MD5) / A presente tese descreve o desenvolvimento de novos biossensores para aplicação na determinação de luteolina em amostras de chá de camomila e quercetina em formulação farmacêutica manipulada e suco de maçã, empregando a técnica de voltametria de onda quadrada. Inicialmente, dois biossensores contendo nanopartículas de prata ou ouro dispersas em líquido iônico hexafluorofosfato de 1-n-butil-3- metilimidazólio (Ag- ou Au-BMI.PF6) e lacase (Aspergillus oryzae) imobilizada em quitosana quimicamente modificada com cloreto cianúrico foram desenvolvidos. Esta enzima catalisa a oxidação da luteolina a sua correspondente o-quinona, a qual é reduzida eletroquimicamente na superfície do eletrodo a um potencial de 0,35 V versus Ag/AgCl. Sob condições previamente otimizadas, foram construídas as curvas analíticas para cada biossensor a partir da corrente resultante versus concentração de luteolina, apresentando linearidade em um intervalo de 9,9x10-8 a 5,8x10-6 mol L-1, com limites de detecção de 5,3x10-8 (Ag-biossensor) e 2,8x10-8 mol L-1 (Au-biossensor). A recuperação de luteolina nas amostras de chá variou de 90,0 a 105,1%. Esses biossensores demonstraram elevada sensibilidade de calibração, excelente seletividade, boa reprodutibilidade e estabilidade, e representam uma alternativa viável para determinação desta flavona. Na segunda parte desse estudo, um biossensor contendo nanopartículas de prata dispersas em líquido iônico bis(trifluorometanosulfonil)imidato de 1-n-butil-3-metilimidazólio (Ag-BMI.N(Tf)2) e lacase imobilizada em ß-ciclodextrina modificada com epicloridrina foi construído. A lacase catalisa a oxidação da quercetina a sua o-quinona, que é reduzida na superfície do biossensor a um potencial de 0,29 V. Este biossensor mostrou linearidade em um intervalo de 1,0x10-7 a 6,5x10-6 mol L-1 e um baixo limite de detecção (3,9x10-8 mol L-1). Além disso, forneceu excelentes resultados quanto à repetibilidade, reprodutibilidade, seletividade, estabilidade e recuperação, e também demonstrou ser apropriado para determinação de quercetina em amostra farmacêutica e suco de maçã (obtido da fruta fresca). / This present thesis describes the development of novel biosensors for application in the luteolin determination in chamomile tea samples and quercetin in manipulated pharmaceutical formulation and apple juice, using square-wave voltammetry. Initially, two biosensors containing silver or gold nanoparticles dispersed in ionic liquid 1-n-butyl-3-methylimidazolium hexafluoropho sphate and laccase (Aspergillus oryzae) immobilized in chitosan chemically modified with cyanuric chloride were developed. This enzyme catalyzes the oxidation of luteolin to its corresponding oquinone, which is electrochemically reduced on the surface electrode at a potential of 0.35 V versus Ag/AgCl. Under optimized conditions, the analytical curves for the biosensors were built from the resulting current versus luteolin concentration, presenting linearly in a range of 9.9x10.8 to 5.8x10.6 mol L.1, with detection limits of 5.3x10.8 (Ag-biosensor) and 2.8x10.8 mol L.1 (Au-biossensor). The recovery for luteolin in tea samples ranged of 90.0 to 105.1%. These biosensors demonstrated high calibration sensitivity, excellent selectivity, good reproducibility and stability, and represent a viable alternative for determination of this flavone. In the second part of this study, a biosensor containing silver nanoparticles in ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl)imide (Ag-BMI.N(Tf)2) and laccase immobilized on â-cyclodextrin modified with epichlorohydrin was constructed. Laccase catalyzes the oxidation of quercetin to its oquinone, which is reduced on the biosensor surface at a potential of 0.29 V. This biossensor showed linearity in a range of 1.0x10.7 to 6.5x10.6 mol L.1 and a low detention limit of 3.9x10.8 mol L-1. Moreover, it supplied excellent results for repeatability, reproducibility, selectivity, stability and recovery, and also demonstrated to be suitable for quercetin determination in pharmaceutical formulation and apple juice (obtained of the fresh fruit).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T09:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225836.pdf: 1172201 bytes, checksum: 6cef987593cfe31ef17852d62cb933d5 (MD5) / Os efluentes das indústrias papeleiras são constituídos de vários compostos fenólicos tóxicos. Dentre esses compostos, alguns de elevadas massas molares (MM) são biotransformados apenas por alguns organismos como fungos da classe Basidiomycota. Diversos estudos demonstram que a biotransformação da madeira por estes fungos depende principalmente de sua capacidade de produzir enzimas lignolíticas extracelulares como as lacases. As lacases catalisam oxidação de uma série de compostos aromáticos, especialmente compostos fenólicos. Várias aplicações vêm sendo sugeridas para essas enzimas, dentre elas, o seu uso na biorremediação de compostos fenólicos e, conseqüentemente, efluentes que possuam tais compostos. No entanto, a aplicação destas, como de quaisquer enzimas na forma livre, torna-se inviável devido a peculiaridades das mesmas, como o fato de perderem atividade em condições e meios densnaturantes. Dessa forma, para aumentar a estabilidade operacional das enzimas, as mesmas podem ser imobilizadas em suportes sólidos, que lhes conferem maior resistência à perda de atividade. Considerando isso, o presente trabalho teve como principal objetivo imobilizar a enzima lacase em esferas de quitosana e avaliar seu potencial para biotransformação de amostras do efluente de uma indústria de papel e celulose. Inicialmente foi possível observar que, apesar da enzima ter adquirido valores baixos de estabilidade operacional, tornou-se mais resistente a diversas condições e meios desnaturantes tais como: pH e temperatura elevados, presença de inibidores e solventes. Em um segundo momento, foram realizados ensaios de biotransformação das amostras de efluente com a enzima imobilizada. O processo de biotransformação foi acompanhado em diversos períodos de tempo pelos seguintes parâmetros: fenóis totais, fenóis de baixa MM, cor e DQO. Com base nos resultados obtidos foi possível observar que, após 24 horas de incubação da enzima imobilizada com o efluente, houve remoção de aproximadamente 65% de fenóis totais, 65% de fenóis de baixa MM e 60% de cor. Embora não se tenha observado modificações estatisticamente significativas nos níveis de DQO após tratamento enzimático, foi possível concluir que a enzima imobilizada em esferas de quitosana possui grande potencial de biotransformação dos compostos fenólicos que, por sua vez, são os que detêm os agentes químicos responsáveis pela elevada toxicidade desse tipo de efluente.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo65_1.pdf: 1190845 bytes, checksum: d4f899e977b335a6659d3f6c8d7271f8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade de Pernambuco / Imobilização de lacase de Trametes versicolor a partículas magnéticas polissiloxano álcool polivinílico (mPOS-PVA) e sua aplicação para a remoção de compostos fenólicos de uma mistura modelo de fenol foram estudados. As partículas de mPOSPVA foram preparadas usando o processo sol-gel e magnetizadas por co-precipitação de íons Fe2+ e Fe3+. As condições de imobilização e de oxidação de fenóis foram investigados. Delineamento composto central rotacional e metodologia de superfície de resposta foram utilizados para avaliar os efeitos de parâmetros de imobilização, como concentração de enzima, pH e tempo de imobilização. A quantidade de lacase imobilizada foi 3,0 mg/g de suporte sob condições otimizadas (50 μg ml -1 de lacase, pH 4,5, 180 min e temperatura de 25◦C). Excesso de proteína imobilizada ao suporte resultou em baixa eficiência do biocatalisador. A lacase imobilizada foi utilizada para a oxidação de uma mistura de cinco compostos fenólicos (fenol, guaiacol, pirogalol, resorcinol e ácido tânico) comumente presentes em efluentes da indústria papeleira. Os compostos fenólicos foram oxidadas pela lacase formando produtos insolúveis, os quais foram removidos do meio de reação por filtração em membrana. Para obter as melhores condições para oxidação de fenol, um delineamento composto central rotacional com diferentes combinações de pH, concentração de fenol e tempo de reação foi realizada. O derivado imobilizado reduziu 65,1% de teor de fenóis totais da solução modelo sob condições ótimas (concentração de fenóis de 1mM, pH 6,0 durante 32h). Os resultados destes experimentos indicam que a metodologia de superfície de resposta foi um método promissor para a otimização de imobilização de proteínas e que lacase imobilizada em mPOS-PVA é eficaz na transformação de misturas de compostos fenólicos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7523_1.pdf: 2350468 bytes, checksum: 72ad4a741028a348bc5725a9d32c1bb0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Este trabalho objetivou investigar o potencial biotecnológico de Curvularia lunata UFPEDA885/URM6179 na produção de enzimas lignolíticas e biossurfactante utilizando óleo diesel como substrato. Para seleção deste fungo, utilizou-se ácido gálico e solução de Manachini acrescida de óleo diesel (2%), seguida da quantificação de lacase (LaC), lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP). Posteriormente, realizou-se planejamento fatorial completo 32 variando pH e temperatura, para otimização da produção das enzimas lignolíticas e avaliou-se o efeito do pH e temperatura na atividade e estabilidade enzimática. Para a produção de biossurfactante, realizou-se um delineamento composto central rotacional 24 variando: inóculo, NH4NO3, MnSO4H2O e CuSO45H2O. Inoculou-se o fungo em meio mineral Bushnell Haas modificado, acrescido de 2% de óleo diesel, onde foram avaliados: tensão superficial e os efeitos do pH, temperatura e salinidade (NaCl) na atividade emulsificante e na estabilidade da emulsão. Por fim, verificou-se a toxicidade do biossurfactante e a biorremoção de óleo automotivo em solo arenoso. C. lunata UFPEDA885 foi selecionado como produtor das três enzimas do sistema lignolítico. No planejamento fatorial, observou-se otimização na produção de LaC em nove vezes (1940U/L+4). Esta enzima, apesar de instável nas condições testadas, foi produzida em maior quantidade por C. lunata UFPEDA885, em pH 3,4 a 65ºC. Houve otimização na produção de LiP (1480U/L+6) em 24 vezes, sendo estável, com pH ideal para produção de 6,2 a 65ºC. A maior produção de MnP por C. lunata UFPEDA885 foi 820U/L +3,5, um aumento de cerca de 15 vezes, sendo esta enzima estável, com maior produção em pH de 3,4 a 50ºC. C. lunata UFPEDA 885 produz biossurfactante, reduzindo a tensão superficial até 32,9mN/m. Este fungo é capaz de emulsificar até 98% de óleo automotivo, com elevada estabilidade em diferentes valores de pH, temperatura e salinidade. Houve baixa toxicidade frente a sementes de Cucumis sativa e a CL50 para Artemia salina ocorreu a 25% de extrato bruto do biossurfactante. Por fim, houve remoção de 93,5% de óleo automotivo em solo arenoso pelo extrato bruto produzido. C. lunata UFPEDA885 é indicado para produção de LiP, MnP, biossurfactante e bioemulsificante, utilizando óleo diesel como substrato visando aplicação industrial e na biorremediação

Orientador: Lucia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ElisangelaFrancisconGuimaro_D.pdf: 1126460 bytes, checksum: 218340ed688851cd46f637d8f8b3cd16 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Azocorantes são compostos aromáticos com um ou mais grupos azo (-N=N-). São os maiores e a mais importante classe de corantes sintéticos usados em aplicações industriais. Eles são considerados compostos xenobióticos recalcitrantes aos processos de biodegradação, e a presença destes azocorantes nos ecossistemas aquáticos é a causa de sérios problemas ambientais e relacionados com a saúde. Neste trabalho, a habilidade em degradar azocorantes de 62 linhagens bacterianas previamente isoladas de efluente industrial foi investigada. A seleção das linhagens foi realizada através de testes de descoloração visual em meio líquido com azocorantes suplementados com diferentes fontes de carbono. O processo de descoloração foi realizado sob condições microaerofílicas ou estáticas até que nenhuma cor fosse observada, seguido de agitação para promover a biodegradação dos metabólitos produzidos. A descoloração e a biodegradação dos azocorantes bem como dos metabólitos produzidos foram monitoradas por análises de UV-vis, Carbono Orgânico Total (COT), Espectroscopia no Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIV) e Cromatografía Líquida de Alta Eficiência e Espectrometria de Massa (CLAE-EM). A atividade de enzimas oxidativas (peroxidase, lacase and tirosinase) foram analisadas para verificar se estas estavam envolvidas no metabolismo de biodegradação dos azocorantes. Análises de toxicidade foram realizadas antes e após a degradação dos azocorantes utilizando o organismo teste Daphnia magna.As aminas aromáticas geradas da biodegradação dos azocorantes foram testadas com o propósito de obter a polimerização. A enzima lacase de Myceliophthora Thermophila foi usada para catalizar reações de acoplamento entre as aminas aromáticas produzidas. As análises de UV-vis mostraram que os corantes foram descoloridos (80%) em condições microaerofílicas ou estáticas. Não houve nenhuma mudança significativa na cor, no estágio aeróbio seguinte. O tempo de descoloração mostrou relação com o meio de cultura utilizado e com a estrutura química dos corantes. Os corantes monoazo foram descoloridos entre 8 a 120 hs. Os diazo e os triazo foram descoloridos após 120 e 168 hs. As linhagens bacterianas descoloriram os corantes somente quando o meio foi suplementado com glicose e piruvato ou extrato de levedura. Na ausência destes compostos, as culturas foram incapazes de descolorir, indicando um requerimento obrigatório de uma fonte suplementar de carbono para alcançar a descoloração. Resultados mostraram que, quando o meio foi incubado em condições microaerofílicas ou estáticas a redução no COT (Carbono Orgânico Total) foi menor do que em condições aeróbias, onde 70% de redução foi observado. A presença de altas concentrações de aminas aromáticas em condições microaerofílicas ou estáticas confirma que houve redução das ligações azo. Porém, houve a confirmação da oxidação destas aminas no estágio aeróbio, indicando que um proceso oxidativo foi responsável pela biodegradação dos metabólitos. Foi observada atividade de tirosinase para na linhagem de Brevibacterium sp, sugerindo o papel desta enzima no processo de descoloração dos azocorantes, não sendo observada atividade de lacase e peroxidase. Nas análises de Espectroscopia no Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIV) após condições microaerofílicas ou estáticas foram observadas bandas em regiões atribuidas a grupamentos amina. Estas bandas desapareceram no estágio aeróbio e foram observadas novas bandas nas regiões associadas com ácido carboxílicos e íons NH3+, confirmando mineralização parcial dos produtos de degradação dos azocorantes, bem como dos metabólitos do meio de cultura. Os metabólitos produzidos pela biodegradação do azocorante RR 198 foram analisados por CLAEEM, para tentar identificar alguns metabólitos desconhecidos. Entre os possíveis compostos produzidos da biodegradação do RR198, 4-cloro-N-o-toluil-1,3,5-triazina-2-amino; sódio 4-aminonaftaleno-2-sulfonado e 3,6 -dimetil-7-(o-toluildiazenil) naftaleno-1-amino, tiveram razoável semelhança com os metabólitos aromáticos encontrados na amostra. Após condições aeróbias, a intensidade dos íons presentes nestes metabólitos foram reduzidos. Estes resultados também foram confirmados pelas análises de FTIV e poderia ser explicado pela diminuição dos compostos aromáticos gerados nas condições microaerofílicas ou estáticas. Foi observado que após um longo período de tempo, a lacase catalizou a polimerização das aminas aromáticas presentes nas soluções descoloridas. Os produtos gerados precipitaram e adquiriram cor, como confirmado pelas análises de UV-Vis. Os tamanhos das partículas foram significativamente maiores após o tratamento com lacase, como mostra as análises de Espectroscopia de Correlação de Fótons. Todas as linhagens bacterianas usadas neste estudo foram capazes de descolorir e degradar os azocorantes em condições microaerofílicas ou estáticas. Em condições aeróbias, ocorreu parcial mineralização dos produtos de degradação dos azocorantes, bem como dos metabólitos do meio, como confirmado para o organismo teste Daphnia magna e Carbono Orgânico Total (COT). Após o estudo, estas bactérias foram identificadas através de análises de sequência de rDNA 16S como Staphylococcus arlettae, Klebsiella sp, Microbacterium sp, Leucobacter albus e Brevibacterium sp / Abstract: Azo dyes, which are aromatic compounds with one or more azo (-N=N-) groups, are the most important and largest class of synthetic dyes used in commercial applications. They are considered as xenobiotic compounds that are very recalcitrant to biodegradation processes. The presence of these dyes in the aqueous ecosystem are a cause of serious environmental and health concerns. In this work, the ability of 62 bacterial strains previously isolated from an industrial activated sludge process treating effluent containing azo dyes was investigated. The selection was undertaken, through visual decolorization, in liquid media with azo dyes supplemented with diferent carbon sources. Decolorization process was performed under microaerophilic or static conditions until no color was observed. The medium was then aerated to promote the biodegradation of the metabolites produced. The azo dyes decolorization and biodegradation and the aromatic amines produced were monitored by UV-Vis, Total Organic Carbon (TOC), Fourier Transformed Infra Red (FTIR) and High Performence Liquid Chromatography (HPLC- MS). Activity of the oxidoreductase enzymes (peroxidase, laccase and tyrosinase) was evaluated in cultures of the bacterial isolates. Acute toxicity tests with Daphnia magna (Crustacea, Cladocera) were carried out after and before microaerobic or static and aerobic conditions. The aromatic amines generated from the biodegradation of the azo dyes were tested for their ability to undergoing polymerization using a laccase from M. thermophila to catalyze the coupling reactions of the aromatic amines. The decolorization time showed a relationship with the culture medium and chemical structure of the dyes. The monoazo dyes were decolourized within 8 to 120 h. The diazo and triazo were decolourized required 120 to168 h, approximately. UV-Vis analysis showed complete decolorization (>80%) in the microaerophilic or static conditions. No significant color changes were detected in the following aerobic stage. However the bacterial strains could only decolourize the dyes effectively when the medium was supplemented with glucose and pyruvate or yeast extract. In the absence of these compounds, the cultures were unable to decolorize the dyes, thus indicating an obligate requirement for a supplementary carbon source for dye decolorization. When the medium was incubated under microaerophilic conditions, the reduction in TOC was low even after 7 days of incubation. Conversely, a significant increase in TOC reduction (>70%) was observed in the aerobic stage. The reduction of azo bonds is known to yield the production of high concentrations of amines in the microaerophilic or static stage therefore confirmed the azo bond was reduced. Therefore the oxidation of these aromatic amines was confirmed by the absence of amine in the aerobic stage indicating that an oxidative process was responsible by metabololite biodegradation. Tyrosinase activity was observed for Brevibacterium sp, suggesting the role of this enzyme in the decolorization process, but no-activity was observed for laccase and peroxydase. In the Fourier Transformed Infra Red (FTIR) analysis after microaerophilic or static decolorization, new bands were observed in region attributed to amine groups. These bands disappeared in the aerobic stage and a new broad region associated with carboxylic acid and NH3+ ions were observed. However, in the aerobic stage the partial mineralization of the dye degradation products and of the medium metabolites was confirmed. The decolorization products of the RR198 dye were analyzed by High Performence Liquid Chromatography (HPLC- MS) for tentative identification of the unknown metabolites tentating identifield compounds included, 4-chloro-N-o-tolyl-1,3,5-triazin-2-amine; sodium 4-aminonaphthalene-2-sulfonate and 3,6-dimethyl-7-(o-tolyldiazenyl) naphthalen-1-amine. After aerobic conditions the intensity of these metabolites was reduced. These results were also confirmed by FTIR and could be explained by degradation of these aromatics coumpounds previously generated in microaerophylic or static stage. After an extended period of time, laccase catalyzed polymerization of the aromatic amines in the destained solutions. The products generated precipitated spontaneously from the solution and acquired some color as confirmed by the UV-Vis analysis. The particle size was also significantly higher after laccase treatment as show by Photon Correlation Spectroscopy analysis (PCS). The bacterial strains used in this study were able to totally destain the azo dyes under microaerophilic or static condition. In the aerobic stage, partial mineralization of the dye decolorization products as well as of the medium metabolites was also confirmed by toxicity testing and TOC measurements. The strains were identified by 16S rDNA gene sequence analysis as Staphylococcus arlettae, Klebsiella sp, Microbacterium sp, Leucobacter albus e Brevibacterium sp. / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Gábia Leite (gabya.leite@gmail.com) on 2016-07-11T13:54:20Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Jessica Souza.pdf: 2840429 bytes, checksum: 1f24de40d9b0322ffb19e92e4f0c36d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-07-14T12:31:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Jessica Souza.pdf: 2840429 bytes, checksum: 1f24de40d9b0322ffb19e92e4f0c36d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-07-14T12:40:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Jessica Souza.pdf: 2840429 bytes, checksum: 1f24de40d9b0322ffb19e92e4f0c36d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T12:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Jessica Souza.pdf: 2840429 bytes, checksum: 1f24de40d9b0322ffb19e92e4f0c36d1 (MD5) Previous issue date: 2015-10-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The effluent produced by the textile industry have intense coloration causing great impact on bodies of water. The methods used in the treatment of these industrial wastes are often ineffective, being necessary to seek new and more effective strategies. One of these, biodegradation refers to the use of microorganisms or their enzymes in the degradation of dyes present in the effluent. In this work the production of phenol oxidase enzymes by Auricularia sp., Coriolopsis sp. and L. crinitus in liquid cultivation and solid state for 14 days. The laccase enzyme characterization was performed using samples which showed the enzyme activity peaks for each of the selected isolates, both in submerged in a solid state. To evaluate the potential of discoloration, 23 dye were exposed to enzymatic action for 72 h. For this test the samples with the highest laccase activity were selected. After enzymatic degradation, toxicity to Daphnia magna effluent assays were performed. In cultivating a solid to increased production of laccase (502, 7 U / g) was measured in marupá substrate by Auricularia sp. In liquid culture, Coriolopsis sp. obtained the highest activity (567,14 IU / ml). Laccases obtained from liquid culture showed optimum temperature of 45 °C, while the highest activities of laccases were between 35 C and 45 C, for cultivation in the solid state. The pH in sodium acetate buffer the highest activities were between 4,0 – 4,5. In McIlvaine buffer were between 3,0 – 4,0. In the bleaching test, enzyme extracts Coriolopsis sp. and L. crinitus degraded dyes Brillante green and Bromocresol green. The dye Acid Blue 80, Remazol brillant blue, Reactive Blue Kn, Reactive Blue 220 and Acid green, the anthraquinone class, after treatment with laccase L. crinitus decolorized when compared to the control. The laccase extracts were not effective in the degradation of azo-dyes, only the Congo red was degraded by laccase Auricularia sp. and L. crinitus. For the toxicity test were used crude extracts liquid cultivation of the three Agaricomycetes. The results obtained in acute toxicity tests on D. magna establish that after the action of enzymes on the dye RBBR the solution with the highest level of toxicity was the Coriolopsis sp. (Toxicity factor (TF) = 32), followed by L. crinitus (TF = 16) and Auricularia sp. (TF = 8). On the other hand the solution with RBBR showed no death of individuals from the concentration of 50% (TF = 2). This fact demonstrates that the pure dye was less toxic than when degraded by the fungal enzymes. Thus removal of an effluent color can not be interpreted as detoxification. The results indicate the potential of Auricularia sp., Coriolopsis sp. and L. crinitus for industrial application and are the starting point for the use of laccases from these strains in processes of removal of dyes from textile effluents. / Os efluentes produzidos pela indústria têxtil apresentam coloração intensa causando grande impacto em corpos d’agua. Os métodos utilizados no tratamento desses rejeitos industriais são, muitas vezes, ineficazes, sendo necessário buscar novas estratégias mais eficientes. Uma destas, a biodegradação, consiste no uso de microrganismos ou suas enzimas na degradação dos corantes presentes nos efluentes industriais. Neste trabalho foi estudada a produção de enzimas fenol-oxidases por Auricularia sp., Coriolopsis sp. e Lentinus crinitus em cultivo líquido e em estado sólido durante 14 dias. A caracterização enzimática de lacases foi realizada com as amostras que apresentaram os picos de atividade enzimática para cada um dos isolados selecionados, em cultivo em estado sólido e submerso. Para avaliar o potencial de descoloração, 23 corantes foram expostos a ação enzimática durante 72 h. Para este teste foram selecionadas as amostras com maior atividade de lacase. Após a degradação enzimáticas, foram realizados ensaios de toxicidade dos efluentes com Daphnia magna. No cultivo em estado sólido a maior produção de lacase (502, 7 U/g) foi dosada no substrato marupá por Auricularia sp. No cultivo líquido, Coriolopsis sp. obteve maior atividade (567,14 Ul/ml). As lacases obtidas do cultivo líquido apresentaram temperatura ótima de 45 oC, enquanto a maiores atividades de lacases foram entre 35o C e 45 o C, para cultivo em estado sólido. Quanto ao pH, em tampão acetato de sódio as maiores atividades ficaram entre 4, 0 - 4, 5. No tampão McIlvaine ficaram entre 3, 0 - 4,0. No teste de descoloração, os extratos enzimáticos de Coriolopsis sp. e L. crinitus degradaram os corantes Brillante green e Bromocresol green. Os corantes Acid Blue 80, Remazol brillant blue, Azul Reativo Kn, Reactive blue 220 e Acid green, da classe antraquinona, após tratamento com lacases de L. crinitus descoloriram quando comparados ao controle. Os extratos de lacase não foram eficientes na degradação dos azocorantes, apenas o Congo red foi degradado por lacases de Auricularia sp. e L. crinitus. Para o ensaio de toxicidade foram utilizados os extratos brutos de cultivo líquido dos três Agaricomycetes. Os resultados obtidos nos ensaios de toxicidade aguda sobre D. magna permitem demonstrar que após ação das enzimas sobre o corante RBBR a solução com maior nível de toxicidade foi a de Coriolopsis sp. (Fator de toxidade FT= 32), seguida por L. crinitus (FT= 16) e Auricularia sp. (FT= 8). Por outro lado a solução com RBBR não apresentou morte dos indivíduos a partir da concentração de 50% (FT=2). Tal fato demostra que o corante puro foi menos tóxico do que quando degradado pelas enzimas fúngicas. Deste modo a remoção da cor de um efluente não pode ser interpretada como detoxificação. Os resultados indicam o potencial de Auricularia sp., Coriolopsis sp. e L. crinitus para aplicação industrial e constituem o ponto de partida para a utilização de lacases provenientes destas linhagens em processos de remoção de corantes de efluentes têxteis.