La recerca en el camp del desenvolupament de fàrmacs peptídics i peptidomimètics ha experimentat una evolució important durant els darrers anys. Els fàrmacs peptídics sovint presenten baixa disponibilitat oral, una vida mitjana curta, accions múltiples i àmplies fluctuacions en el seu comportament farmacocinètic. D'aquí la necessitat de desenvolupar pèptids modificats o peptidomimètics amb propietats que millorin aquests inconvenients. Una de les idees més interessants en aquest camp va ser el trasllat de la cadena lateral de l'àtom de carboni de l'aminoàcid a l'àtom de nitrogen de l'enllaç amida, tot conduint a oligòmers de glicines N substituïdes, compostos que van ser anomenats peptoides. Aquestes estructures presenten clars avantatges davant dels pèptids, com ara una estabilitat metabòlica més elevada que els fa resistents a la degradació per proteases. A més, es poden sintetitzar amb una gran variabilitat de grups funcionals, són més flexibles degut a l'absència de ponts d'hidrogen augmentant l'espai conformacional capaç d'interaccionar amb diferents dianes terapèutiques, i presenten un esquelet estructural molt apropiat per aplicar-hi estratègies combinatòries.L'absència de regeneració neuronal en el sistema nerviós central adult és un greu problema sanitari i social. Estudis recents indiquen que el bloqueig d'inhibidors endògens del recreixement axonal pot constituir una nova via per estimular la regeneració neuronal. En aquest sentit, el descobriment de la família de les semaforines (i els seus receptors: les neuropilines), els inhibidors més potents del creixement axonal, ofereix un ampli ventall de noves possibilitats experimentals i terapèutiques en regeneració neuronal. Les semaforines (SEMA) són una gran família de proteïnes secretades o associades a la membrana que actuen com a quimiorepel·lents o inhibidors dels axons, tot afectant la seva direcció de creixement, la seva fascicul·lació i ramificació així com la formació de la sinapsi.Fruit de la col·laboració amb altres grups d'investigació es va identificar, mitjançant el cribratge d'una quimioteca de peptoides, el peptoide SICHI com a inhibidor de la quimiorepulsió induïda per semaforines. La síntesi posterior d'aquest compost ens va conduir a la detecció de la formació de subproductes cíclics que impedien l'obtenció del peptoide desitjat amb rendiments de reacció acceptables. Per aquest motiu, es va plantejar la síntesi de SICHI mitjançant la combinació de monòmers d'N-alquilglicines. L'aplicació d'aquesta estratègia va obligar a desenvolupar una metodologia de síntesi dels mencionats monòmers. Es van desenvolupar un total de tres rutes sintètiques, utilitzant en cadascuna d'elles un grup protector diferent. Una vegada optimitzades, es va fer la síntesi de SICHI mitjançant l'acoblament d'aquests monòmers. El rendiment global de la síntesi va ser satisfactori, la qual cosa va permetre completar els estudis de funcionalitat d'aquest peptoide.En la segona part de la tesi, es va decidir sintetitzar una nova quimioteca optimitzada de 625 pentàmers d'N-alquilglicines i 20 mescles controlades, en fase sòlida i en format de rastreig posicional. La síntesi dels peptoides es va fer seguint l'estratègia del submonòmer, mitjançant cicles successius constituïts per una etapa d'acilació amb àcid bromoacètic i una etapa de desplaçament del bromoderivat corresponent per una amina primària. La innovació d'aquesta quimioteca radica en la utilització de la radiació de microones per accelerar les etapes de reacció. Per a les posicions de diversitat química es van escollir un total de 10 amines primàries, tenint en compte diferents criteris com hidrofobicitat, presència de grups aromàtics, possibilitat de formar ponts d'hidrogen, etc. D'acord amb el format del rastreig posicional, es va realitzar un estudi de reactivitat de les amines primàries utilitzades en les etapes d'introducció de diversitat per tal d'assegurar reactivitats similars entre elles. La quimioteca ha estat assajada fins al moment contra diverses dianes terapèutiques d'interés, amb resultats satisfactoris en l'àrea de la diabetis i el càncer. / Peptoids are oligomers of N-substituted glycines residues that have been developed as peptidomimetics but with improved stability and better pharmacological properties. For these reasons, peptoids have also been subjected of application of combinatorial approaches to identify bioactive molecules. In this context, the screening of a peptoid library identified a peptoid called SICHI as a potent inhibitor of semaphorin induced chemorepulsion activity. Subseqüent synthesis of this peptoid drove to detection of cyclic byproducts avoiding peptoid obtention in acceptable yield. For that reason, we proposed SICHI's synthesis through the combination of N-alkylglycine monomers. The application of this strategy forced us to develope a methodology of monomers synthesis. We developed three synthetic routes, using a different protecting group on each one. Once all of them were optimized, we synthesized SICHI by coupling those monomers. The yield was satisfactory, allowing us to complete functionality studies of this peptoid.In the second part of the thesis, we decided to synthesize a new optimized library of pentamers containing 625 compounds in 20 controlled mixtures, constructed on solid-phase by using the positional scanning format following the submonomer strategy. An important innovation was introduced by the application of microwave irradiation to accelerate the reaction steps. We selected 10 primary amines for diversity positions considering hydrofobic properties, presence of aromatic goups, possibility of hydrogen bridge formation, etc. As positional scanning requires, we developed a reactivity study of the primary amines used to insure similar reactivity between them. The library has been tested against different therapeutic targets, obtaining satisfactory results in the fields of diabetes and cancer.

Les malalties de transmissió alimentària, especialment les que posen en perill la vida, incideixen en un dels requisits bàsics per a la salut i el benestar de les persones: la necessitat d'aliments innocus i exempts de contaminació. Aquestes tipus de malalties han estat presents durant tota la història i en la societat actual han en alguns casos esdevingut un important problema de salut pública. El principal factor que ha contribuït a aquesta problemàtica és la globalització, la qual permet que de forma ràpida i extensa les intoxicacions alimentàries puguin afectar la població. La síndrome de l'oli tòxic (SOT) que va aparèixer repentinament a Espanya l'any 1981 va afectar a més de 20.000 persones i va provocar més de 400 morts. Estudis epidemiològics i d'anàlisi química d'olis relacionats amb la SOT van relacionar la malaltia amb el consum d'oli de colza desnaturalitzat amb anilina, refinat il·legalment, barrejat amb altres olis i venut com a comestible. Tot i que 25 anys més tard es continua sense identificar els veritables agents causants de la intoxicació, es coneix que les anilides dels àcids grassos són bons biomarcadors de l'oli adulterat i que els derivats acilats del 3-(fenilamino)propan-1,2-diol (PAP) ho són de l'oli tòxic. Per aquest motiu, aquests darrers composts han estat senyalats com els principals sospitosos d'haver causat la intoxicació i així es justifica l'interès que ha desvetllat el seu estudi en el últims anys. Els estudis realitzats en la present tesi han estat centrats en realitzar noves aportacions relacionades amb la SOT, les quals es poden resumir en tres punts. Per una banda s'ha dut a terme l'obtenció d'un model d'oli tòxic el qual reproduís de la forma més fidel els olis causants de la intoxicació. Aquests olis s'han obtingut amb concentracions d'anilides i de derivats del PAP de l'ordre dels associats amb la SOT. Per tal d'obtenir els nivells desitjats d'anilides i de derivats del PAP, s'ha desenvolupat un procés model de desodorització mitjançant el qual es controlaria l'efecte de les diverses variables que influeixen en la formació d'aquests derivats anilínics. Una altra aportació que s'ha realitzat és la síntesi d'estàndards de compostos de la família dels derivats del PAP els quals han estat identificats en els olis models realitzats en el nostre laboratori. Finalment s'ha dut a terme un estudi exhaustiu de la formació dels derivats anilínics en olis models, així com la seva interrelació i reactivitat en les condicions de desodorització i d'emmagatzematge, amb la finalitat de trobar una explicació a les diferències observades entre els olis tractats a Catalunya i els de Sevilla pel que fa a la seva composició química. / Toxic Oil Syndrome (TOS) was a food-born intoxication that occurred in Spain in 1981. It caused over 400 deaths and affected more than 20,000 people. TOS was attributed to the ingestion of rapeseed oil that had been adulterated with aniline, illegally refined and delivered for human consumption. Two chemical species derived from aniline have been identified in oil batches: fatty acid anilides, qualified as biomarkers of the adulterated oil, and fatty acid esters of 3-(N-phenylamino)propane-1,2-diol (PAP), considered toxic oil biomarkers. These compounds were generated by chemical processes during oil refining, specifically in the deodorization step, which involves treatment of the oil at high temperatures under vacuum to remove volatile contaminants. Taking precedent into account, the initial objective of the present thesis was to reproduce on a laboratory scale the deodorization process that would have taken place at the refinery involved with TOS. Specifically, the production of refined, aniline-denatured rapeseed oils with a composition of aniline derivatives similar to that found in the toxic oil batches was attempted. Such model oils would then be used for conducting further studies in animals. On the other hand, we have synthetised a family of PAP derivatives that have been identified in laboratory-processed oils. Finally, we focused on the formation, the interactions and the reactivity between OOPAP, OPAP, and OA. Of particular interest was the interaction observed between OOPAP and OA. This relationship was investigated in more depth to evaluate its potential relevance to the final composition of the toxic oil model as well as to the toxicity of TOS.

En la present Tesi Doctoral en primer lloc s’ha completat un estudi previ de reaccions aldòliques d’α-hidroxi metil cetones, tant per a grups protectors benzílics com silílics. Així, al Capítol 1 s’ha demostrat que la tria adequada del grup protector de l’α-hidroxi cetona i l’àcid de Lewis permet accedir a aldols 1,4-anti o 1,4-sin amb bons rendiments (5697%) i diastereoselectivitats en ocasions excel•lents (fins a rd 96:4), dins el context de l’aldòlica d’acetat. Les metodologies desenvolupades també s’han avaluat amb aldehids quirals en processos doblement asimètrics. La notable capacitat d’inducció asimètrica dels enolats de titani d’α-benziloxi metil cetones ha quedat demostrada per l’obtenció dels seus aldols amb unes diastereoselectivitats excel•lents, independentment de la configuració de l’aldehid. Fins i tot, un d’aquests aldols obtingut enantiomèricament pur s’ha utilitzat en la síntesi del fragment C12C16 de l’epotilona B. A més, una seqüència de reacció aldòlica-reducció desenvolupada anteriorment al grup s’ha aplicat a l’(S)-3-tert-butildimetilsililoxi-4-metil-2-pentanona per obtenir els corresponents triols 1,2-sin-2,4-sin amb rendiments excel•lents (9192%) i un control estereoquímic que depèn, majoritàriament, de la reacció aldòlica inicial (rd 80:2094:6). Al Capítol 2 s’ha demostrat la utilitat sintètica de les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi etil cetones desenvolupades anteriorment en el grup de recerca. Aquestes metodologies s’han aplicat amb èxit en la síntesi total de l’herboxidiè, contribuint a la construcció de gran part del seu esquelet carbonat i dels estereocentres requerits. La reacció aldòlica de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona i la seqüència d’aldòlica-reducció de l’(R)-2-tert-butildimetilsililoxi-3-pentanona han estat etapes clau en la síntesi dels fragments C1C9 (17%, deu etapes) i C10C19 (43%, set etapes), respectivament. La unió d’aquests fragments ha permès obtenir l’herboxidiè amb un 8% de rendiment global amb la seqüència lineal més llarga de catorze etapes. Després d’haver estudiat a fons les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi cetones, s’ha explorat la reactivitat d’aquests nucleòfils en altres processos de construcció d’enllaços CC. Al Capítol 3 s’ha desenvolupat l’addició de Michael de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a cetones α,β-insaturades, amb què s’han obtingut els corresponents adductes 1,3-anti-3,4-anti amb excel•lents diastereoselectivitats (rd ≥ 89:11). Partint del mateix nucleòfil, en aquest Capítol també s’ha iniciat un estudi d’addicions de Michael a nitro alquens. L’addició de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a l’(E)-4-metoxi-β-nitroestirè ha produït el corresponent adducte de Michael amb excel•lent diastereoselectivitat (rd ≥ 97:3). Aquests primers resultats són prou esperançadors i demostren l’interès sintètic que poden arribar a tenir aquestes reaccions, que actualment constitueixen una línia activa d’investigació al grup de recerca. Finalment, prenent com a punt de partida el caràcter biradicalari de determinats enolats de titani, en aquesta Tesi s’ha iniciat un estudi de la reactivitat d’aquests substrats en reaccions de formació d’enllaços CC i CO. Així, al Capítol 4 s’ha estudiat l’al•lilació d’N-acil oxazolidinones quirals amb al•lil estannans, amb què s’han obtingut els corresponents adductes amb un control estereoquímic excel•lent (rd ≥ 97:3). D’altra banda, en la constitució d’una nova línia d’investigació al grup, en el darrer Capítol també s’ha desenvolupat l’oxidació estereoselectiva d’N-acil oxazolidinones quirals amb TEMPO. S’ha demostrat que la utilització d’aquest radical estable permet l’oxidació dels corresponents enolats de titani i condueix als α-aminoxi derivats amb rendiments i diastereoselectivitats excel•lents (9095%, rd ≥ 93:7) i, a més, s’ha descrit l’aminoxilació estereoselectiva en la posició d’enolats conjugats. L’eliminació de l’auxiliar quiral i/o el trencament reductiu de l’enllaç NO han permès arribar a derivats sintèticament útils. Per últim, s’ha descobert que es pot assolir la hidroxilació directa d’aquests substrats a través de la reacció dels seus enolats de titani amb O2. / The first Chapter of the present text deals with substrate-controlled titanium-mediated aldol reactions of chiral α-hydroxy methyl ketones. The appropriate choice of the Lewis acid and the protecting group in the α-hydroxy ketone gives access to either 1,4-anti or 1,4-syn aldol adducts in good yields (5697%) and diastereoselectivities up to ≥ 97:3 with a broad range of aldehydes. Furthermore, a sequential aldol reaction-reduction transformation from (S)-3-tert-butyldimethylsilyloxy-4-methyl-2-pentanone provides 1,2-syn-2,4-syn triols in excellent yields (9192%) and a stereochemical control which mostly relies on the aldol step of the sequence (dr 80:2094:6). The usefulness of these methodologies is proven in Chapter 2 with its application in the total synthesis of herboxidiene. Most of the carbon backbone and the required stereocentres are constructed through an aldol reaction of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone and an aldol reaction-reduction sequence from (R)-2-tert-butyldimethylsilyloxy-3-pentanone, which are key steps in the synthesis of C1C9 fragment (17%, 10 steps) and C10C19 fragment (43%, 7 steps), respectively. Assembling of both fragments affords herboxidiene in 8% overall yield (14 steps, longest linear sequence). After a thorough study of aldol reactions of titanium enolates from α-hydroxy ketones, the reactivity of these nucleofiles is explored in other CC bond-forming reactions. In Chapter 3, the Michael addition of the titanium enolate of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone to α,β-unsaturated ketones is developed, which provides 1,3-anti-3,4-anti adducts in excellent diastereoselectivities (dr ≥ 89:11). Finally, considering the biradical character of certain titanium enolates, in Chapter 4 the reactivity of such substrates in some CC and CO bond-forming reactions is investigated. Allylation of chiral N-acyl oxazolidinones with allyl stannanes is achieved and the corresponding adducts are obtained with excellent levels of stereocontrol (dr ≥ 97:3). Moreover, the stereoselective oxidation of chiral N-acyl oxazolidinones with TEMPO is described. The use of this stable radical leads to α-aminoxy derivatives in excellent yields and diastereomeric ratios (9095%, dr ≥ 93:7), and the stereoselective oxidation in the position of conjugate enolates is also accomplished. Elimination of the chiral auxiliary and/or reductive cleavage of the NO bond provides synthetically useful derivatives.

The global emergence and spread of multidrug-resistant bacteria is an important public health issue. However, the antimicrobial pipeline remains unacceptably lean, in fact over the last 25 years, the number of antimicrobial agents that reach the market has sharply decreased. In this context, there is now a renewed interest in the search for drugs that have more than one target on the bacterial cell, rather than a specific chiral receptor or enzyme. Antimicrobial peptides (AMPs) are a class of antibiotics that have attracted great interest in the last few years because they rarely spur the development of resistant organisms as their mechanism of action involves disruption of the bacterial membrane. In this thesis we report the design, preparation and activity of new compounds based on the sequence of the polymyxins, a class of antibiotics highly active against Gramnegative bacteria, and used clinically as last resort treatment for multidrug-resistant pathogens. The compounds synthesized proved to be highly active against both Grampositive and Gram-negative bacteria, including several strains of resistant bacteria. Furthermore, biophysical experiments using liposomes and monolayers as model membranes and flow cytometry and transmission electron microscopy using bacteria were carried out to study the mechanism of action of these compounds. The results of the most active candidate indicate that an alternative, non-membrane dependent mechanism of action might be involved. In the second part of the thesis, a series of 9 peptides were designed and synthesized from repeated KIAGKIA motifs, based in the sequence of the antimicrobial peptide PGLa from the magainin family, with lengths between 14 and 28 amino acids. Circular dichroism spectroscopy showed that they all formed alpha-helices when found in a lipid environment. Biological assays for haemolysis and antimicrobial activity, as well as fluorescence vesicle leakage and solid-state NMR spectroscopy, were used to correlate peptide length with membrane activity. These data are fully consistent with the formation of transmembrane pores. Only peptides that are long enough to span the hydrophobic bilayer core can induce vesicle leakage, haemolysis, and inhibit bacterial growth. The shorter peptides do not show these effects. Solid-state NMR analysis in oriented bilayers with different thickness also demonstrated the need for a minimum peptide length to flip from a surface-bound alignment into a more inserted, possibly even transmembrane state. With increasing length the peptides start to tilt and perturb the bilayer. Since the threshold behaviour seen for biological activity closely matches the biophysical results, the peptides could be used as molecular rulers to determine the thickness of bacterial membranes, showing that E. coli (≈ 27 Å) < S. aureus and P. aeruginosa (≈ 30 Å) < E. faecalis (≈ 34 Å). / L'aparició i propagació mundial de bacteris resistents a múltiples fàrmacs s’ha convertit en un problema clínic molt important. No obstant això, el nombre de nous antimicrobians que es troben en les últimes etapes de desenvolupament és molt baix. Els pèptids antimicrobians són una classe d’antibiòtics que han despertat gran interès en els últims anys pel fet que poques vegades estimulen el desenvolupament d’organismes genèticament resistents ja que la seva diana terapèutica és principalment la membrana bacteriana. En aquesta tesi es descriu el disseny, preparació i activitat de nous compostos basats en la seqüència de les polimixines, un tipus de pèptids antimicrobians altament potents contra bacteris Gram-negatius i usats clínicament. Els compostos sintetitzats van presentar elevada activitat tant en bacteris Gram positius com Gram-negatius, incloent diverses soques resistents. Addicionalment, experiments biofísics usant liposomes i monocapes com a models de membrana i citometria de flux i microscòpia electrònica de transmissió usant bacteris es van usar per estudiar el mecanisme d’acció d’aquests compostos. Els resultats del candidat més actiu semblen indicar que presenta un mecanisme d’acció alternatiu on la membrana bacteriana no és l’única diana terapèutica. En la segona part de la tesi, es descriu el disseny i síntesi d’una sèrie de 9 pèptids, basats en la seqüència del pèptid antimicrobià PGLa de la família de les magainines. Els pèptids alfa-helicoïdals (vist mitjançant l’ús de dicroïsme circular), presenten repeticions del heptàmer KIAGKIA, amb llargades de 14 a 28 aminoàcids. Assaigs biològics, de fluorescència i de RMN de fases condensades es van usar per relacionar la llargada peptídica amb la activitat en la membrana. Les dades obtingudes són consistents amb la formació de porus transmembrana, només aquells pèptids prou llargs per travessar la bicapa lipídica indueixen permeabilització, hemòlisi i inhibeixen el creixement bacterià mentre que els pèptids curts no mostren aquests efectes. L’anàlisi usant RMN de fases condensades amb lípids de diferent llargada també va mostrar la necessitat d’una llargada mínima dels pèptids per passar d’un estat superficial a un estat més inserit, probablement transmembrana. Atès que els llindars observats per a l'activitat biològica coincideixen estretament amb els resultats biofísics, els pèptids van ser utilitzats com a regles moleculars per determinar el gruix de les membranes bacterianes, és a dir E. coli (≈ 27 Å) < S. aureus i P. aeruginosa (≈ 30 Å) < E. faecalis (≈ 34 Å).

This work is divided in 2 different parts: Part A: Cyclization and conjugation can confer on biomolecules better activity, resistance toward enzymatic degradation and better internalization properties. In order to develop a versatile methodology for polyamide conjugation and cyclization, several protected maleimide-containing monomers were synthesized and incorporated into polyamide sequences. Maleimide protection was accomplished by Diels-Alder reaction with 2,5-dimethylfuran. The resulting cycloadduct underwent a retro-Diels-Alder reaction upon heating. These monomers were included in peptide and peptoid sequences, and it was assessed in all cases that the maleimides obtained after deprotection were fully reactive. Double conjugates were obtained by incorporating both a free and a protected maleimide in the same sequence. These were peptides were selectively linked to two different biomolecules, namely a peptide-thiol or an oligonucleotide-diene. By assembling sequences containing both maleimide and cysteine, several cyclic polyamides were obtained. These could include almost all proteinogenic amino acids. By combining orthogonally-protected cysteines and free and protected maleimides, bicyclic peptides could also be synthesized. Cyclic peptide conjugates were synthesized, by taking advantage of the different protecting group schemes developed. These compounds could contain the conjugation spot within or outside the cycle, either at the C- or the N- terminus. All cyclizations were performed by Michael addition, and conjugations were performed by reactions such as Diels-Alder cycloaddition, Michael addition or Huisgen cycloaddition. Finally, a series of cyclic peptide – PNA conjugates were synthesized and tested as alternative splicing inducers. Unfortunately their activity did not surpass the one from previously tested conjugates. Part B: Foot-and-mouth disease virus (FMDV) promotes translation of its genetic material through a cellular mechanism, in which part of its RNA sequence, the IRES, plays a crucial role. FMDV IRES contains a GNRA loop, and AD2, a small molecule, is known to interact with these kind of loops. The initial goal of this part was to study the interaction between AD2 and the GUAA loop of the FMDV IRES. AD2 was synthesized, and in vitro assays were performed in order to assess its activity and binding site. By using a bicistronic RNA, a differential response was observed in the inhibition of the cap- and the IRES-dependent translation, assessing that AD2 was active. The binding site determination was attempted with the SHAPE assay, but no defined binding site could be established. At the same time a series of biophysical assays with synthetic RNA were performed. Thermal denaturation experiments and CD measurements, as well as isothermal titration calorimetry assays were carried out, but none of them afforded relevant data. However, EC50 values could be obtained by employing fluorescently-labeled RNA. These experiments showed that AD2 interacted with the desired loop, but also with a bulge nearby. The binding stoichiometry was determined by mass spectrometry. The masses of the different RNA-ligand complexes indicated high stoichiometries, that is, several AD2 molecules were interacting with relatively short RNA sequences. Considering the in vitro results, the EC50 values obtained in the fluorescence titrations and the observed stoichiometries, we could conclude that AD2 interacts with the desired loop with high affinity, but it also interacts, and even more strongly, with other RNA structures found in FMDV IRES. / Aquest treball està dividit en dues parts diferenciades. A la primera part s’ha desenvolupat una metodologia per obtenir conjugats i cicles de poliamides (pèptids i peptoides) fent ús de reaccions tipus “click” sobre maleimides, com ara addicions de Michael o cicloaddicions de Diels-Alder o Huisgen. Les maleimides s’incorporen a les cadenes de poliamida protegides amb dimetilfurà, i es desprotegeixen escalfant. Combinant en una mateixa seqüència maleimides protegides i desprotegides, cisteïnes amb grups protectors ortogonals entre ells, o alquins, s’han sintetitzat conjugats, dobles conjugats, cicles, bicicles i conjugats de pèptids cíclics. En tots els casos la poliamida s’ha ciclat amb una addició de Michael, i les conjugacions s’han dut a terme amb addicions de Michael o cicloaddicions de Diels-Alder o Huisgen. Tanmateix s’han sintetitzat conjugats tipus pèptid cíclic – PNA amb potencial activitat biològica, però malauradament els resultats no han millorat els obtinguts amb altres compostos similars. A la segona part s’ha estudiat la interacció de l’AD2, una molècula petita, amb el loop GUAA de l’IRES del virus de la febre aftosa. Els estudis biològics in vitro han indicat que inhibeix més la traducció mediada per IRES que la cap-dependent, però malauradament no s’ha pogut determinar de forma inequívoca el lloc d'unió. Paral•lelament s’han realitzat estudis biofísics amb RNAs sintètics. La determinació de la variació de la temperatura de fusió dicroisme circular i la calorimetria no han proporcionat informació útil. Amb estudis per fluorescència amb RNAs marcats, en canvi, s’ha determinat la EC50, i s’ha observat que l’AD2 és afí pel loop desitjat, però ho és encara més per un bulge proper. La determinació per ESI de l’estequiometria dels complexos mostra que l’AD2 és promiscu, ja que diverses molècules d’AD2 s’uneixen a cada seqüència curta d’RNA assajada. En resum, doncs, l’AD2 interacciona amb el loop desitjat amb alta afinitat, però també interacciona, i de forma més afí, amb altres estructures d’RNA presents a l’IRES.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Objectives: Objective 1 – Effect of mutations perturbing the ULBR of the Unique domain of c-Src. The first objective of this thesis was the in vitro characterization of the effect of mutations in the ULBR on the previously determined main interactions of the Unique domain: binding to lipids and to the SH3 domain. Objective 2 - Phosphorylation of c-Src Unique domain in Xenopus laevis oocytes and mammalian cell extracts. Phosphorylation of the Unique domain of c-Src is one of the modulation parameters affecting lipid binding and had previously been reported to affect c-Src activity. The second objective was to study the phosphorylation of the isolated Unique domain in Xenopus laevis oocytes, that enabled the study of phosphorylation in a living cell and in cell extracts, that allowed further manipulation of the phosphatase/kinase network. Objective 3 - Functional studies of the Unique domain in the context of the full-length protein. The last objective was the evaluation of the functional significance of the modifications investigated in the isolated Unique domain as objectives 1 and 2 in a human colorectal cell line and in the context of the full length protein. The present thesis addressed fundamental aspects of the biological role of the intrinsically disordered Unique domain of c-Src that until now was poorly understood. We have first characterized through a structural biology approach the effects of sitedirected ULBR mutations on the previously described interactions with lipids and with the folded SH3 domain. Then, we have investigated the phosphorylation events taking place on the Unique domain by state-of-the-art in-cell NMR techniques. Finally, we have shown the functional role of USrc in the context of normal and cancer cell lines. All together, our results have demonstrated that the Unique domain of human c-Src actively participates in the regulation mechanism in which the tyrosine kinase c-Src is involved. This study represents a new essential milestone in the understanding of how c-Src can control a wide variety of signaling events inside cells. Furthermore, it potentially opens the way to the possibility of new applications for cancer therapy through the development of novel selective drugs targeting functional active residues locating in the Unique domain. This thesis represents a “proof-of-concept” of how from the atomistic comprehension of a subject of interest (structural approach) it can be possible to understand and successively demonstrate the biological significance of the observed phenomena (functional approach). Conclusions: - Mutations in the Unique Lipid Binding Region affect the lipid binding capability of USrc but not the inter-domain interaction with the folded SH3. - Disruption of the conserved FGGF motif causes important local effects that affect the structure of the ULBR. - The SH3 domain of human c-Src loses its ability to interact with lipids in presence of a polyproline peptide. - Real-time NMR spectroscopy allowed the study of complex phosphorylation/dephosphorylation processes in USrc mediated by kinases and phosphatases in Xenopus laevis derived cells or cell extracts. - Three different phosphorylation sites present in the Unique domain that were unequivocally assigned to Ser 17, Ser 69 and Ser 75 have been identified in Xenopus laevis, COS-7, MEFs and HeLa cell systems. - It was the first time that phosphorylation of Ser 69 of c-Src was observed in those model systems. - The biological relevance of the ULBR has been firstly demonstrated in Xenopus laevis oocytes in the context of the full-length c-Src. - The functional roles of the described phosphorylation events together with ULBR mutations have been shown in HEK293T cells and in the human colorectal SW620 cancer cell lines in the context of the full-length protein. - A “positional regulation model” has been proposed as a new c-Src selectivity regulation mechanism. / Aquesta tesi, titulada “Caracterització estructural i funcional del domini únic intrínsecament desplegat de c-Src humana”, aborda els aspectes fonamentals de la funció biològica del domini Únic intrínsecament desordenat de c-Src (USrc) que fins ara ha sigut poc estudiat. Hem caracteritzat primer mitjançant tècniques de biologia estructural als efectes de les mutacions de la ULBR (Unique Lipid Binding Region) dirigides al lloc de les interaccions descrites anteriorment amb els lípids i amb el domini SH3. Llavors, hem investigat els esdeveniments de fosforilació que tenen lloc en el domini únic per tècniques de RMN en cèl•lules. Finalment, hem demostrat el paper funcional de USRC en el context de línies de cèl•lules normals i canceroses. En conjunt, els nostres resultats han demostrat que el domini únic de c-Src participa activament en el mecanisme de regulació en què la tirosina quinasa c-Src està implicada. Aquest estudi representa una nova fita essencial en la comprensió de com c-Src pot controlar una àmplia varietat d'esdeveniments de senyalització dins de les cèl•lules. A més, té el potencial d'obrir el camí a la possibilitat de noves aplicacions per al tractament del càncer mitjançant el desenvolupament de nous fàrmacs selectius dirigits residus actius funcionals localització en el domini únic. Aquesta tesi constitueix una "prova de concepte" de com des de la comprensió atomista d'un tema d'interès (enfocament estructural) pot ser possible entendre i successivament demostrar la importància biològica dels fenòmens observats (enfocament funcional).

En el context del camp de l’organocatàlisi, per una banda, de l’estudi de mecanismes de reaccions orgàniques, per l’altra, i de l’estudi de l’emergència de la quiralitat, s’han estudiat els següents temes: S’ha desenvolupat una metodologia per a l’addició enantioselectiva i organocatalítica de Michael d’oxazolones a maleïmides que proporciona accés a compostos amb possible interès biològic, amb dos centres estereogènics (un d’ells quaternari). La reacció empra com a catalitzador una base de Brønsted quiral comercial, derivada de la quinidina, i proporciona, en el cas d’un substituent fenil al carboni 4 de l’oxazolona, 47-80% rendiment com a un únic regioisòmer, relacions diastereomèriques des d’un 2:1 a un únic diastereòmer i 52-95% ee. En emprar un substituent alquil a l’oxazolona els resultats són similars però s’obté una mescla de regioisòmers. S’han estudiat els efectes cooperatius de la mescla arginina–àcid glutàmic com a catalitzador en la reacció aldòlica entre la ciclohexanona i el 4-nitrobenzaldehid. S’ha observat que la capacitat de cooperació és molt sensible a les condicions de reacció. En condicions de cooperació, la mescla d’aminoàcids proporciona millors selectivitats que els components per separat, tot i que també s’obté un elevat percentatge de producte d’eliminació. S’ha determinat que l’arginina és l’aminoàcid que actua com a catalitzador i s’han observat indicis d’un possible mecanisme autoinductiu. A més, s’ha estudiat la interacció entre la prolina i el guanidini de l’arginina protegida. S’ha investigat el mecanisme de la reacció entre un aldehid a,ß-insaturat i un nitroalquè en catàlisi per dienamina. S’ha caracteritzat un intermedi del cicle catalític que és propi d’un camí de reacció diferent al que havien proposat els autors que van desenvolupar la reacció. S’ha observat una clara diferència en les reaccions que empren catalitzadors basats en repulsions estèriques i aquells que tenen una posició nucleòfila lliure, i s’han estudiat els equilibris entre reactius, intermedis i el producte. D’acord amb els resultats obtinguts s’ha proposat un nou mecanisme de la reacció segons els dos tipus de catalitzador estudiats. S’ha examinat el trencament espontani de la simetria en la reacció aldòlica entre l’acetona i el 4-nitrobenzaldehid en absència d’un catalitzador extern. S’ha comprovat el fenomen i s’ha determinat que aquest té lloc en els primers instants del procés. S’ha aïllat una espècie del cru de reacció provinent d’una segona reacció aldòlica i se n’ha estudiat la possible relació amb el trencament espontani de la simetria. A més, s’ha proposat un nou model de xarxa de reaccions que condueix a un trencament espontani de la simetria sota control cinètic i posteriorment a un sistema racèmic. S’ha investigat la reacció autocatalítica asimètrica de Mannich entre cetones i imines derivades del glioxilat. En el cas d’utilitzar acetona, s’ha aconseguit preparar un mímic del producte de reacció però aquest no va presentar activitat catalítica. En utilitzar hidroxiacetona, s’ha observat que la reacció és favorable en un medi àcid però que és inhibida per bases, i s’ha descobert que el diastereòmer minoritari (anti) que s’obté en la mescla dels productes de reacció és millor catalitzador que el diastereòmer més abundant (sin), utilitzant RMN i microcalorimetria. A més, s’ha arribat a la conclusió que aquest és un procés no enantioselectiu. S’ha desenvolupat una variació d’un mètode ja existent per a la preparació més efectiva organocatalítica, diastereoselectiva i enantioselectiva dels adductes de Mannich anti. Finalment, s’ha proposat un mecanisme per a la reacció de Mannich autocatalítica en les reaccions d’hidroxiacetona. S’ha observat que la reacció de Morita–Baylis–Hillman entre la 2-ciclohexenona i el 1-metil-2-imidazolecarbaldehid té lloc sense utilitzar catalitzadors externs. A més, també s’ha observat el producte de reacció aldòlica. S’ha monitoritzat la reacció per RMN i espectrometria de masses tàndem, però no s’ha aconseguit determinar si es tracta d’un procés autocatalític, catalitzat pels reactius o bé un mecanisme competitiu on tenen lloc els dos processos. / In a context in the fields of organocatalysis, reaction mechanism studies and processes with emergence of chirality, the following studies have been made: A new method for the enantioselective organocatalytic Michael addition of oxazolones to maleimides has been developed, using chiral Brønsted bases derived from quinine as the catalyst. It allows the stereoselective synthesis of a-maleido-a-amino acids. The cooperative effects from the mixture arginine–glutamic acid as catalysts in the aldol reaction between cyclohexanone and 4-nitrobenzaldehyde have been studied, concluding that higher stereoselectivities are obtained when both amino acids are used at the same time. The origin of the cooperation has been examined, as well as the interaction between the amino acids and the reagents and product. The mechanism of the organocatalytic conjugated formal [2 + 2] cycloaddition between nitroalkenes and enals under dienamine catalysis has been investigated by screening different types of aminocatalysts and studying catalytic species by NMR. Evidences pointing to a different reaction pathway from the established one have been found. The spontaneous symmetry breaking in the aldol reaction between acetone and 4-nitrobenzaldehyde has been examined. We have seen that it occurs in the first reaction instances and a species that could be related to the process has been found. A new model for a reaction experiencing a spontaneous symmetry breaking has been proposed. The autocatalytic Mannich reaction has been investigated. Mechanistic studies have been performed by monitoring the reaction. Different situation have been examined: while in some cases the reaction can be enantioselective, in other cases the process it is totally racemic. A Morita-Baylis-Hillman reaction between 2-cyclohexenone and 1-methyl-2-imidazolecarbaldehyde in the absence of an external catalyst has been developed. The reaction can be reagent-catalyzed or autocatalytic, and evidences pointing to both pathways have been found by monitoring the reaction crude both by NMR studies and by MS2 studies.

Glycosylation is a posttranslational modification affecting the fast majority of cellular surfaces through glycolipids and glycoproteins. It has been estimated that over 80% of all proteins are glycosylated and that the glycans decorating the periphery of these molecules are fundamental for the biological function of the entity. Many of these functions have yet to be unraveled. As the modification is a secondary-gene event, it depends on the availability and activity of a set of glycosyltransferases, the availability of both donor and acceptor substrate (both in time and place), as well as many other factors that may include temperature, pH, etc. As a consequence a single glycosylation site may express a certain number of different glycans, i.e., structural microheterogeneity. The importance of glycosylation as primary mediators of cellular communication, protein-protein cross-talk, and even cell-pathogen interaction has been attributed precisely to this phenomenon. In the past few years substantial advancements have been made in the understanding of the function of particular glycosidic epitopes, such as the most relevant blood group antigens ABO, and Sda, (sialyl)Lewisx,y,a,b, the HNK-1 antigen, etc., but many more structures have been identified without an attributed functionality, either as a stand-alone epitope or in conjunction with the underlying peptide structure. Similarly, a serious lack of knowledge still exists on the carbohydrate recognizing molecules, i.e. lectins and their function; even so they have been recognized over the last decades as decisive players in numerous biological processes, ranging from cell-cell communication, fertilization, pathogen-cell adhesion to metastasis. Both deficiencies are directly related to the absence of proper tools to elaborate well-defined carbohydrate epitopes for the study of their interaction characteristics and their employment in the discovery of new complementary molecules. Consequently, there is an increasing interest in finding powerful and nanosized tools to screen for these molecules and to study their carbohydrate interactions in detail. In this Thesis, two complementary approaches are described to characterize lectin-carbohydrate interactions with high sensitivity, low sample consumption, and without the need for sample labeling: SPR and CREDEX-MS. In SPR, we have developed an approach where the sugar is immobilized onto a sensor surface through a tailor-made peptide module that allows (1) to capture the lectin, (2) to characterize the interaction through kinetic and thermodynamic parameters, and (3) to identify the interacted protein by mass spectrometry. In CREDEX-MS, based on proteolytic excision of protein-carbohydrate complexes and mass spectrometric analysis, the peptides conforming the carbohydrate binding domain are identified. After completing a preliminary phase where the above mentioned methodologies are optimized and used for the study of carbohydrate-protein interactions using purified well-known lectins; the established platforms are employed to analyze carbohydrate-driven interactions in more complex systems. Specifically, SPR and CREDEX-MS techniques are applied in a research project on molecular aspects of reproduction with the main objective of disclosing the molecular elements that participate in the first steps of fertilization in bovine species, namely: formation of the sperm reservoir in the oviductal epithelium and gamete recognition (oocyte (ZP)-sperm interaction). / La glicosilació, el procés enzimàtic que uneix sacàrids per produir glicans que s'adhereixen a proteïnes, lípids o altres molècules biològiques, és una modificació co-traduccional i post-traduccional present a la pràctica totalitat de components cel•lulars, on trobem glicoproteïnes, glicolípids i altres glicoderivats. Pel que fa específicament a les proteïnes, s’estima que més d’un 80% estan glicosilades i que aquests glicans són fonamentals en processos biològics com la senyalització cel•lular, el cicle infecciós de certs patògens, les respostes inflamatòria i immune, la fertilització, etc. En els últims anys s’ha avançat substancialment en el coneixement bàsic de la funció de determinats epítops o cadenes glicosídiques concretes. No obstant, es desconeixen les funcions de moltes altres estructures glicosídiques. D’altra banda, també existeix un cert desconeixement sobre les molècules que reconeixen els carbohidrats, les lectines “lectores del codi glicòmic”. Aquestes proteïnes es caracteritzen per reconèixer i unir-se de forma reversible i específica a certs monosacàrids o epítops oligosacàrids donant lloc a interaccions similars a les reaccions antigen-anticòs o enzim-substrat. El paper de les lectines en processos com l'aglutinació i la definició de grups sanguinis, la inflamació (selectines), la mielinització del teixit nerviós, la progressió tumoral, etc., demostra la ubiqüitat i diversitat d'activitats en què es veuen implicades aquestes proteïnes. Per això, disposar d'una eina ràpida i fiable per al seu aïllament i identificació, previ a l'estudi de les seves interaccions amb polisacàrids, constitueix un objectiu de màxim interès en l'actual investigació biomèdica. En la present Tesi Doctoral, es descriuen dues aproximacions complementàries mitjançant les quals es poden caracteritzar les interaccions lectina-carbohidrat amb gran sensibilitat, poca mostra i sense la necessitat de cap marcatge. En la tècnica de ressonància de plasmó superficial (SPR), el sucre és immobilitzat sobre una superfície a través d'un mòdul peptídic, la qual cosa permet (1) capturar la lectina, (2) caracteritzar la seva interacció mitjançant paràmetres cinètics i termodinàmics i (3) identificar posteriorment la proteïna mitjançant espectrometria de masses. Complementàriament, la tècnica CREDEX-MS, basada en l'excisió proteolítica del complex proteïna-sucre i posterior anàlisi per espectrometria de masses, ens permet identificar els pèptids que formen part del domini d'unió al sucre.

Synthesis of Cys-containing peptides has long been posed as an attractive challenge for peptide chemist. Protecting groups for the nucleophilic beta-thiol group of Cys residues must be stable during peptide elongation, and can be removed under mild conditions when necessary. Synthesis of peptides with multiple-disulfide bonds frequently demands the implementation of additional orthogonal dimensions into the protection schemes. Therefore, combinations of orthogonal and/or compatible protecting groups for each pair of Cys residues enable the regioselective formation of disulfide bridges. The development and study of novel protecting groups for the side-chain of the Cys residue may increase the number of synthetic tools for the efficient synthesis of Cys-containing peptides. The solid-phase strategy has been applied for the preparation of small, medium-sized peptides. Nevertheless, the elongation of large peptide sequences through a stepwise solid-phase peptide synthesis is limited and convergent strategies, such as fragment condensation approach should be adopted. The preparation of fully protected peptide fragments on solid phase for convergent synthesis calls for handles with maintain intact the side-chain protecting groups upon cleavage. The present thesis has focused on the development and application of novel orthogonal strategies for the synthesis of complex peptides, including Cys-containing peptides and long and difficult peptide sequences by fragment condensation approach. Specifically, different Cys-protecting groups have been evaluated and a handle has been designed and developed. / Recientemente, el péptido linaclotide ha sido aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) y por la European Medicines Agency (EMA) para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales tales como el estreñimiento crónico (EC) y el síndrome del intestino irritable (SII)1. Linaclotide es administrado oralmente, y es un potente agonista selectivo del receptor de la guanilato ciclasa tipo C (GC-C) localizado en el intestino. Desde un punto de vista estructural, este péptido de cadena corta presenta un elevado número de residuos de cisteínas que le confieren una conformación bien definida debido a la presencia de tres enlaces disulfuro intramoleculares entre los residuos Cys1-Cys6, Cys2-Cys10 y Cys5-Cys13. El diseño y la optimización de una estrategia sintética eficiente para la obtención de cantidades que permitan satisfacer el mercado en un futuro, se presenta como un reto debido a la presencia de sus tres puentes disulfuro. Para la optimización de dicha síntesis es fundamental establecer y discutir sus dos principales limitaciones: el riesgo de racemización de los residuos de cisteína durante la síntesis lineal de la cadena peptídica; y el posterior plegamiento y formación de los enlaces disulfuros correctamente. Se diseñaron y estudiaron diversas estrategias regioselectiva, semi-regioselectiva y se exploró la posibilidad de preparar el péptido linaclotide siguiendo una estrategia aleatoria, utilizando un esquema de protección de los residuos de cisteína no selectivo. La elección de los grupos protectores del grupo tiol de las cisteínas, su posición en la secuencia, la influencia de los grupos protectores vecinos, además del orden de plegamiento y formación de los enlaces disulfuro fueron objeto de estudio. Finalmente, el péptido completamente plegado y oxidado se analizó detenidamente con el fin de confirmar que la conectividad establecida entre los residuos de cisteína coincidían con los enlaces disulfuro nativos presentes en Linaclotide.

Aquesta tesi doctoral s’ha basat en el desenvolupament de nous compostos amb capacitat per interaccionar de forma selectiva i específica amb l’estructura secundària localitzada al final de l’exó 10 del pre-mRNA codificant de la proteïna tau, ja que l’aparició de mutacions que la desestabilitzen està relacionada amb l’aparició de malalties degeneratives, com ara la FTDP-17 (Demència Frontotemporal i Parkinsonisme associat al cromosoma 17). La identificació dels lligands, s’ha dut a terme mitjançant la química combinatòria dinàmica (DCC) a travès de reaccions reversibles de bescanvi d’enllaços tiol-disulfur sobre una biblioteca dinàmica formada per un total de 10 compostos orgànics derivatitzats amb un grup tiol, tots ells amb capacitat per interaccionar amb els diversos motius estructurals presents a l’RNA. Concretament, s’han sintetitzat quatre molècules denominades Janus amb l’objectiu de reconèixer específicament els parells G-U, que es troben tant a la seqüència nativa com a les mutades, i un derivat de l’ametantrona amb capacitat per intercalar-se a la regió del bulge present a l’estructura de l’RNA diana. A més, també s’ha incorporat un compost heteroaromàtic per al reconeixement de bases desaparellades, dos derivats aminoglicosídics i l’agent intercalant acridina. Els resultats obtinguts han confirmat que els lligands derivats de l’ametantrona interaccionen preferentment amb la seqüència nativa de la diana d’RNA en comparació amb els que contenen acridina, on la combinació amb l’aminoglicòsid ha estat la més afavorida. A continuació, tant la seva síntesi a gran escala com la d’un segon grup de compostos de segona generació, basats en la guanidinilació del fragment neamina i en la doble funcionalització del residu amentatrona, s’ha dut a terme en solució. Un cop sintetitzats els diferents compostos, en una segona part del treball s’ha estudiat la seva interacció amb la diana a través de diverses tècniques biofísiques (espectroscòpia de fluorescència, d’UV-visible i d’RMN), amb l’objectiu de determinar, d’una banda, l’afinitat i l’especificitat amb la seqüència oligoribonucleotídica i, de l’altre, el seu lloc d’unió. Finalment, també s’ha determinat la capacitat estabilitzant dels lligands amb la seqüència nativa i les mutades, clau per al desenvolupament de nous fàrmacs que permetin regular el processat alternatiu de l’exó 10 del pre-mRNA de tau. / RNA plays an essential role in many cellular processes, from the regulation of gene expression to protein synthesis, as well as in the progression of viral diseases. Hence, the discovery of selective and, more importantly, specific ligands for this macromolecule represents a challenge for medicinal and bioorganic chemistry and therapy. Moreover, the potential for targeting RNA with small molecules is immense given its ability to adopt complex three-dimensional structures, similar to those observed in proteins. Most of the known RNA-binding ligands can each bind to several different RNA targets of unrelated sequence and structure, which compromises their biological applications. We hypothesize that affinity and specificity could be improved by combining two or more small molecules with different abilities to recognize some of the secondary structural motifs present in a particular RNA target. This fragment-based lead-discovery search approach offers new perspectives and opportunities for identifying RNA ligands with improved properties, as well as for increasing our understanding of RNA recognition mechanisms. In this PhD thesis, we have used dynamic combinatorial chemistry (DCC) to identify ligands for the stem-loop structure located at the exon 10-5’-intron junction of tau pre-mRNA, which is involved in the onset of several tauopathies, including frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). These compounds bind to the stem-loop RNA target with high affinity (70 – 300 nM) and are able to stabilize both the wild-type and the +3, +14 and +16 mutated sequences associated with the development of FTDP-17. In addition, some of them seem to have a preferred binding site in the target RNA, as inferred from spectroscopic studies (UV-visible, fluorescence and NMR).