Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aims to validate an analytical multi-mycotoxin method using UPLC-MS/MS for 12 mycotoxins determination in wheat and maize matrices. The parameters evaluated for the validation were: calibration curve and linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy (recovery%), precision (RSD %) and matrix effect. The extraction of mycotoxins was performed using the modified QuEChERS method, whereby were used 12.5 g of slurry (suspension between sample and water), 4.5 g MgSO4 anhydrous and 10 ml of acidified acetonitrile at 1% acetic acid. After method validation, it was used to search, quantitatively, the occurrence of mycotoxins in 646 samples, 476 samples of wheat (the field trials, exported and imported grain type, grain processing and their fractions (flour and bran) and flour collected in supermarkets) and 170 samples of maize (grain exported type, flour collected in supermarkets, grains and brewer for the manufacture of animal feed). The results were satisfactory for all evaluated parameters, thus showing that the method validated for the matrices of wheat and maize, it is effective to determine these 12 mycotoxins studied. The matrix effect for some mycotoxins was outside the range -20 to +20%. These results for some analytes were compensated by matrix-mached calibration. All were contaminated by at least one of 12 mycotoxins in the study, regardless of origin. The mycotoxin DON was predominantly found in wheat samples, while fumonisin were determined in maize. In the field trials, factors such as genotype, environment and fungicide treatment had influence on DON concentration. Wheat grain for exportation and imported from Argentina had DON contamination in all samples. In wheat for exportation, also been determined contamination for FB1, FB2, ZEN and OTA. There is evidence that this is the first study to report the presence of fumonisins in Brazilian wheat, since it was not found other reports in the literature. In the sub-products of milling was observed redistribution of DON, a decreased concentration in white flour and increased in bran fraction when compared to the initial concentration in the grain, showing that this process is not effective for mycotoxins removal. It was determined DON and ZEN mycotoxins in flour samples purchased either in the city of Cruz Alta as Santa Maria as well. In maize samples for exportation was observed concomitant contamination by DON, ZEN, FB1 and FB2 and AFLA B1. In maize flour samples collected from supermarkets all samples were contaminated with fumonisins. Besides fumonisins evidenced the presence of DON, ZEN and AFLA B1 in some samples. Samples destined for the production of animal feed were determineted with aflatoxins (B1, B2, G1, G2), fumonisins (B1 and B2), DON and ZEN, and in some samples, the concentrations were higher than Brazilian MRL. The extraction method combined with modern chromatographic technique for the determination of analytes, were effective for the analysis of mycotoxins in wheat and maize. Even in concentrations below the legal limits, human been exposure to mycotoxins can occur constantly. Monitoring of mycotoxins in foods is extremely important for public health, seeking quality to make healthy products available at all points of the supply and commercial chain. / O trabalho teve por finalidade validar um método analítico multimicotoxinas empregando UPLC-MS/MS para determinação simultânea de 12 micotoxinas em matrizes de trigo e milho. Os parâmetros avaliados para validação do método foram: curva analítica e linearidade, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), exatidão (recuperação%), precisão (RSD%) e efeito matriz. A extração das micotoxinas foi realizada empregando o método QuEChERS modificado, no qual foram utilizados 12,5 g de slurry (suspensão entre amostra e água), 4,5 g MgSO4 anidro e 10 mL de acetonitrila acidificada a 1% com ácido acético. Após a validação do método, o mesmo foi empregado para pesquisar, quantitativamente, a ocorrência de micotoxinas em 646 amostras, sendo 476 amostras de trigo (ensaios a campo, grãos tipo exportação e importação, grãos para processamento e respectivas frações (farinha e farelo) e farinhas comercializados em supermercados) e 170 amostras de milho (grãos tipo exportação, farinhas coletadas em supermercados, grãos e quirera destinados à fabricação de ração animal). Os resultados obtidos foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, mostrando desta forma, que o método validado para as matrizes de trigo e milho, é eficaz para determinar as 12 micotoxinas em estudo. O efeito matriz, para algumas micotoxinas ficou fora da faixa de -20 a +20%. Esse efeito pronunciado para alguns analitos foi compensado pela calibração por superposição da matriz. Este método pode então ser utilizado para avaliação das amostras, em que todas apresentaram contaminação por pelo menos uma das 12 micotoxinas estudadas, independente da origem. A micotoxina DON foi predominantemente encontrada em amostras de trigo, enquanto fumonisinas foram as micotoxinas predominante determinadas em milho. Nos ensaios a campo, fatores como genótipo, ambiente e tratamento fungicidas tiveram influência sobre as concentrações de DON. Grãos de trigo tipo exportação e importados da Argentina apresentaram contaminação por DON em todas as amostras. Em trigo tipo exportação, também foi determinado contaminação por FB1, FB2, ZEN e OTA. Há evidências de que este seja o primeiro trabalho a relatar a presença de fumonisinas em trigo brasileiro, visto que não foi encontrado outros relatos na literatura. Nos subprodutos derivados da moagem foi verificado redistribuição de DON, com redução das concentrações na farinha branca e incremento na fração farelo, quando comparados a concentração inicial no grão, evidenciando que tal processo não é eficaz para eliminação de micotoxinas. Foram determinadas as micotoxinas DON e ZEN em amostras de farinhas adquiridas tanto na cidade de Cruz Alta quanto de Santa Maria. Nas amostras de milho tipo exportação foi evidenciada contaminação concomitante por DON, ZEN, FB1 e FB2 e AFLA B1. Nas amostras de farinha de milho coletadas em supermercados todas estavam contaminadas por fumonisinas. Além de fumonisinas foi evidenciado a presença de DON, ZEN e AFLA B1 em algumas amostras. Em amostras destinadas a fabricação de ração animal foi determinada aflatoxinas (B1, B2, G1, G2), fumonisinas (B1 e B2), DON e ZEN, sendo que em alguns casos, as concentrações foram superiores aos limites tolerados pela legislação brasileira. O método de extração, aliado com a técnica cromatográfica para determinação dos analitos mostraram-se eficientes para a análise de micotoxinas em trigo e milho. Mesmo em concentrações abaixo dos limites legais, a exposição humana a micotoxinas pode ocorrer constantemente. O monitoramento de micotoxinas em alimentos é de extrema importância para a saúde pública, visando a disponibilização de produtos de qualidade em todos os pontos da cadeia produtiva e comercial.

For providing a balanced composition, among fresh food, the milk is considered one of the most nutritionally complete, being a product very well accepted in the market with consumers of all ages. Thus, the analysis of milk quality is great importance for consumer information and verification of the parameters required by law. Considering all the problems involving the many chemicals used for several purposes in agriculture, and the possibility of these compounds directly or indirectly the milk and cause damage to population health, this work aimed to develope and validate a method for a multiresidue determination of 48 pesticides in cattle milk, using modified QuEChERS method and GC-MS/MS. The extraction procedure consisted of 5.0 mL of sample (milk) extracted with 5.0 mL of acetonitrile, acidified with 1% of acetic acid (v/v), followed by manual shaking for 1 min for partition step was used 2.0 g of anhydrous MgSO4 and 0.85 g of anhydrous sodium acetate. Manual agitation was repeated for 1 min, and subsequently it was performed centrifugation at 3400 rpm for 8 min. The dispersive clean up step consisted in add 1.0 mL of supernatant extract, 150.0 mg of anhydrous MgSO4, 125.0 mg of C18 and 62.0 mg of PSA in an eppendorf tube, which was shaked in a vortex for 1 min, centrifuged at 10000 rpm for 3 min. After centrifugation, the extract was transferred to a glass insert for the injection into the GC-MS/MS system. It was evaluated the linearity, limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ), the matrix effect, accuracy and precision of the analytical method. The method proved to be efficient, with satisfactory results for recoveries, with values in a range between 71.1 and 117.4% for 45 of the 48 compounds analyzed. RSD values lowerd than 17,3%, values of LODi and LODm ranged between 0.3 to 3.0 μg L-1 and LOQi and LOQm ranged between 1.0 to 10.0 μg L-1. The validated method was applied for the determination of residues of 45 pesticides/degradation products in samples of milk UHT. The method developed was adequate for the analysis of pesticide residues in cattle milk, as all the validation parameters were within the limits required for validation of chromatographic methods, achieving satisfactorily the objectives outlined in this paper. / Por oferecer uma composição equilibrada, o leite é considerado um dos alimentos in natura mais completos nutricionalmente, sendo um produto muito bem aceito no mercado e tendo consumidores de todas as idades. Sendo assim, a análise da qualidade do leite é de grande importância para informação do consumidor e verificação dos parâmetros exigidos pela legislação. Considerando toda a problemática envolvendo as inúmeras substâncias químicas utilizadas com finalidades diversas na agropecuária, e a possibilidade destas chegarem direta ou indiretamente até o leite e causarem danos a saúde da população, neste trabalho foi desenvolvido e validado um método multirresíduo para a determinação de 48 agrotóxicos em leite de vaca, empregando método QuEChERS modificado e GCMS/ MS. O procedimento de extração consistiu em 5,0 mL de amostra (leite integral) extraída com 5,0 mL de acetonitrila acidificada com 1% de ácido acético (v/v), seguido de agitação manual por 1 min, para a etapa de partição utilizou-se 2,0 g de MgSO4 anidro e 0,85 g de acetato de sódio. Repetiu-se a agitação manual por 1 min, e posteriormente foi realizada a etapa de centrifugação a 3400 rpm, durante 8 min. A etapa de limpeza dispersiva, consistiu em 1,0 mL de extrato sobrenadante, 150 mg de MgSO4 anidro, 125 mg de C18 e 62 mg de PSA em tubo eppendorf, os quais foram agitados em vortex por 1 min centrifugados a 10000 rpm por 3 min. Após a centrifugação, o extrato foi transferido para o insert de vidro para injeção no sistema GC-MS/MS. Avaliou-se a linearidade, os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), o efeito matriz, a exatidão e a precisão do método analítico. O método demonstrou ser eficiente, apresentando resultados satisfatórios para recuperações, as quais se situaram na faixa entre 71,1 e 117,4%, para 45 dos 48 compostos avaliados, com valores de RSD ≤ 17,3%, os valores de LODi bem como o LODm variaram entre 0,3 e 3,0 μg L-1 e o LOQi e o LOQm variaram entre 1,0 e 10 μg L-1. O método validado foi aplicado para a determinação de resíduos de 45 agrotóxicos/produtos de degradação em amostras de leite UHT. O método desenvolvido mostrou-se adequado a análise de resíduos de agrotóxicos em leite, pois todos os parâmetros de validação encontraram-se dentro dos limites exigidos para validação de métodos cromatográficos, atendendo satisfatoriamente os objetivos traçados neste trabalho.

The use of pesticides and their residues have become a problem due to possible contamination of soil, impacting on the environment and causing trouble to public health. In this research, an analytical method was optimized and validated to determine the residues of thiamethoxan, imazapic, imazethapyr, clomazone, propiconazole, fipronil and trifloxystrobin in soil from rice paddy field, applying a modified QuEChERS extraction method and Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) with Electrospray ionization source in ESI (+/-) mode. The modified QuEChERS method developed consisted of an initial extraction step using 5.0 g of soil into which 20 mL of saturated solution of calcium hydroxide pH 12.0 and 10 mL of acetonitrile were added, followed by a partition step after the addition of a mixture of anhydrous salts (4.0 g of magnesium sulfate and 3.0 g of sodium chloride). After this, a step for adjustment of the pH to 3.0 by adding 390 μL of 6 mol L-1 HCl, followed by centrifugation at 3900 rpm for 10 min. A clean-up step was then conducted with 250 mg of magnesium sulfate in 2 mL of extract, followed by LC-MS/MS analysis. After the optimization of the extraction and determination parameters the method was validated evaluating the analytical curve, linearity, LOD, LOQ, precision (repeatability and intermediate precision) and accuracy. Calibration curves presented linearity between 0.2 and 20.0 μg L-1 for propiconazole and 1.0 and 100.0 μg L-1 for thiamethoxan, imazapic, imazethapyr, clomazone, fipronil and trifloxystrobin, with determination coefficients greater than 0.99. The values of the method LOQ were 0.4 μg kg-1 for propiconazole and 2.0 μg kg-1 for the others pesticides. The method showed good precision, with RSD values < 20%, and good accuracy, with recoveries between 70 and 120% for most compounds. Concerning the Matrix Effect for all compounds evaluated, this was compensated by using calibration curves prepared in the matrix extract for quantification. The optimized method showed as major advantages: speed, simplicity, low cost, low consumption of organic solvents, besides the simplification of slow and laborious steps usually employed in traditional methods for extraction of pesticides in soil. The method was considered suitable for analysis of pesticide residues in soil from rice paddy fields, since all the validation parameters were within the limits suggested for validation of chromatographic methods. After the validation, the method was applied for determination of residues of these pesticides in soil samples from an experiment carried out at the UFSM Campus, revealing great efficience. / O uso de pesticidas e seus resíduos tornaram-se um problema devido à possível contaminação do solo, podendo impactar o meio ambiente e causar danos à saúde pública. Neste trabalho, otimizou-se e validou-se um método analítico para a determinação de resíduos de tiametoxam, imazapique, imazetapir, clomazona, propiconazol, fipronil e trifloxistrobina em solo proveniente de lavoura de arroz irrigado utilizando o método de extração QuEChERS modificado e Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas sequencial (LC-MS/MS), com fonte de ionização por Eletronebulização no modo ESI (+/-). O método QuEChERS modificado desenvolvido consistiu em uma etapa de extração inicial utilizando 5,0 g de solo no qual foi adicionado 20 mL de solução saturada de hidróxido de cálcio pH 12,0 e 10 mL de acetonitrila, seguida por uma etapa de partição após a adição de uma mistura de sais anidros (4,0 g de sulfato de magnésio e 3,0 g de cloreto de sódio). Após, foi realizada uma etapa de ajuste em pH 3,0, através da adição de 390 μL de solução aquosa de HCl 6 mol L-1, seguido de centrifugação a 3900 rpm por 10 min. Na sequência, foi realizada a etapa de clean-up com 250 mg de sulfato de magnésio em 2 mL de extrato, seguido de análise por LC-MS/MS. Após otimização dos parâmetros de extração e de quantificação, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, LOD, LOQ, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão. As curvas analíticas apresentaram linearidade entre 0,2 e 20,0 μg L-1 para propiconazol e entre 1,0 e 100,0 μg L-1 para tiametoxam, imazapique, imazetapir, clomazona, fipronil e trifloxistrobina, com valores de coeficiente de determinação maiores que 0,99. Os valores de LOQ para o método foram 0,4 μg kg-1 para propiconazol e 2,0 μg kg-1 para os demais pesticidas. O método apresentou boa precisão, com valores de RSD < 20%, e boa exatidão, com recuperações entre 70 e 120% para a grande maioria dos compostos analisados. Com relação ao Efeito Matriz avaliado para todos os compostos, este foi compensado através da utilização de curvas analíticas preparadas no extrato da matriz para a quantificação. O método otimizado apresentou como vantagens principais: rapidez, simplicidade, baixo custo, baixo consumo de solventes orgânicos, além da simplificação de etapas lentas e trabalhosas geralmente empregadas em métodos tradicionais de extração de pesticidas em solo. O método foi considerado adequado para a análise de resíduos de pesticidas em solo proveniente de lavoura de arroz irrigado, visto que todos os parâmetros de validação atenderam os limites sugeridos para validação de métodos cromatográficos. Após ser validado, o método foi aplicado para determinação de resíduos destes pesticidas em amostras de solo provenientes de um experimento realizado no Campus da UFSM, mostrando-se bastante eficiente.