A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

Das humanes WU Polyomavirus wurde im Jahr 2007 als ein neues Virus in Proben des Respirationstraktes beschrieben und gehört zur Familie der Polpymaviridae. Das Ziel der Arbeit war es, eine WUPyV-rea-time-PCR zu etablieren und zu evaluieren und mit dieser neuen Methode WUPyV-DNA in Nasenrachenskreten (NRS) zu detektieren und zu quantifizieren. Insgesamt wurden 1232 NRS von Patientin mit akuten respiratoischen Erkrankungen, die an der Universitätskinderklinik Würzburg im Zeitraum von Januar 2002 bis September 2005 und Januar 2007 bis July 2007 stationär behandelt worden waren, auf WUPyV-DNA getestet. Zusätzlich wurden 14 Serum- und 14 Stuhlproben von Kindern mit WUPyV-DNA-pos. NRS getestet. Mit der real-time PCR wurde WUPyV-DNA in 5,2 % der 1232 NRS detektiert. Der Viruslastmedian aller WUPyV-positiven NRS betrug 950 Kopien/m. Neben einigen sehr hohen Viruslasten (4,7 % > E9 Kopien/ml) wurden vor allem niedirge Viruslaten (51,6 % < 1000 Kopien/ml) mit der WUPyV-real-time PCR nachgewiesen. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Zusammenhänge zwischen der Viruslast und der Koinfektionen mit anderen respiratorischen Viren, mit klinischer Diagnose, mit dem Alter der infizierten Kinder und mit dem jahreszeitlichen Auftreten. In 3 der 14 Serum und 2 der 14 Stuhlproben konnte WUPyV-DNA detektiert werden. Virämische Kinder hatten tendenzen zu höhrer Viruslast im NRS.Weitere Studien sind notwendig um die pathogenetische Relevanz des WUPyV für den Menschen zu untersuchen. Die in dieser Arbeit etablierte real-time PCR zur WUPyV-Quantifizierung kann dabei zur Anwendung kommen. / The human WU polyomavirus (WUPyV) has been recently described as a novel virus in respiratory tract samples. To investigate the viral load of WUPyV in nasopharyngeal aspirates (NPA´s), stool samples, and serum samples of pediatric patients with acute respiratory tract diseases, obtained between 2002 and 2007, we etablished a real-time PCR for WUPyV DNA. WUPyV was found in 5,2 % of 1232 NPA. The median viral load in the NPA was 950 copies/ml (maximun: 3.4 E10 copies/ml). The WUPyV load in NPA was neither associated wtih the coinfection status nor with the clinical diagnoses. WUPyV was found in 3 of 14 serum samples and 2 of 14 stool samples. The WUPyV load in NPA tended to be hihger in viremic children. Further stuies are necessary to determine whether WUPyV is a human pathogen.

Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. / Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way.

<p>Evidence has shown that hypoxic hearts have greater heart/fetus mass ratio. However, it is still unclear if either hyperplasia or hypertrophy causes the relatively increased heart mass. Furthermore, the genes that might be involved in the process have not yet been identified. In the present study, the cardiac transcriptome was analyzed to identify differentially expressed genes related to hypoxia. Eggs were incubated for 15 and 19 days in two different environments, normoxic and hypoxic. Normalized microarray results were analyzed to isolate differentially expressed probes using the Affymetrix chip. Total RNA was also isolated from another set of fetuses incubated in the same conditions and used to perform a qPCR in order to confirm the microarray results. In the four groups (15N, 15H, 19N, 19H), some probes were differentially expressed. From the eggs incubated for 15 days, the microarray revealed five probes that were differentially expressed according to the criteria (p<0.01 and absolute fold change FC>2) in the two programs (PLIER & RMA) used to normalize the data. From the eggs incubated up to 19 days, eight probes were differentially expressed in both programs. No further tests were performed on the 19 days fetuses since there was no significant difference in that group after incubation for the heart/fetus mass ratio. Apolipoprotein-A1, p22, similar to ENS-1 and b2 adrenergic receptor were further tested in qPCR (15 days sample). The differently expressed genes are linked to cell division and should be further studied to identify their function, especially the similar to ENS-1.</p>

Evidence has shown that hypoxic hearts have greater heart/fetus mass ratio. However, it is still unclear if either hyperplasia or hypertrophy causes the relatively increased heart mass. Furthermore, the genes that might be involved in the process have not yet been identified. In the present study, the cardiac transcriptome was analyzed to identify differentially expressed genes related to hypoxia. Eggs were incubated for 15 and 19 days in two different environments, normoxic and hypoxic. Normalized microarray results were analyzed to isolate differentially expressed probes using the Affymetrix chip. Total RNA was also isolated from another set of fetuses incubated in the same conditions and used to perform a qPCR in order to confirm the microarray results. In the four groups (15N, 15H, 19N, 19H), some probes were differentially expressed. From the eggs incubated for 15 days, the microarray revealed five probes that were differentially expressed according to the criteria (p&lt;0.01 and absolute fold change FC&gt;2) in the two programs (PLIER &amp; RMA) used to normalize the data. From the eggs incubated up to 19 days, eight probes were differentially expressed in both programs. No further tests were performed on the 19 days fetuses since there was no significant difference in that group after incubation for the heart/fetus mass ratio. Apolipoprotein-A1, p22, similar to ENS-1 and b2 adrenergic receptor were further tested in qPCR (15 days sample). The differently expressed genes are linked to cell division and should be further studied to identify their function, especially the similar to ENS-1.

Anaerobic digestion process which has long been known to successfully reduce the organic content of sludge is one of the most common alternatives to meet pathogen reduction requirements for particular classes of biosolids. However, it has recently been reported that, significantly higher densities of indicator bacteria have been measured in dewatered cake samples compared to samples collected right after anaerobic digestion. In addition, this increase in bacterial population has been commonly observed after centrifugation but not after belt filter dewatering. Even though several theories have emerged to explain this occurrence, with the use of molecular tools such as Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q

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Ramularia collo cygni (Rcc), der Erreger der Sprenkelkrankheit an Gerste, gewinnt zunehmend an Bedeutung. Das pilzliche Pathogen wird den Deuteromyceten zugeordnet. Typisch für die Krankheit ist ein auffallend spätes Auftreten von Symptomen in der Vegetationsperiode. Nach Abschluss der Blüte nimmt die Befallsstärke stark zu, was sich in einer Verbräunung und Absterben der Blätter innerhalb von 12 Tagen zeigt. Klassische Untersuchungsmethoden der Rcc-Gerste-Interaktion werden kontinuierlich durch molekulare Untersuchungen zur Befallsdynamik unterstützt. So stehen seit kurzem PCR-basierte Verfahren zum Nachweis von Rcc in Pflanzengewebe zur Verfügung. Ziel dieses Projektes waren Untersuchungen zur Epidemiologie und Pathogenität von Rcc, weiterhin wurde die Herkunft des Inokulums und die Verbreitung des Pathogens untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt war die Entwicklung von robusten Phänotypisierungs-Assays zur Bewertung der Resistenz unterschiedlicher Gersten-Genotypen sowohl unter Gewächshaus- als auch unter Feldbedingungen. Zunächst wurde eine auf SYBR-Green basierende quantitative Real-Time PCR (qPCR)-Methode zum Nachweis von pilzlicher DNA in Pflanzengewebe entwickelt. Die Nachweisgrenze der pilzlichen DNA lag hier bei 0,1 pg in Flüssigkultur, sowie in Pflanzengewebe und in Samenmaterial; auch in Regenwasser und Schnee konnte diese DNA-Konzentration noch nachgewiesen werden. Mittels qualitativer PCR konnte eine Übertragung des Pathogens von Samen auf Keimlinge gezeigt werden. Die Untersuchungen bestätigten auch, dass die weitere Ausbreitung des Pathogens in älteren Pflanzen ohne Ausbildung von Symptomen erfolgte. Unter Gewächshausbedingungen traten in infizierten Pflanzen erste Symptome erst zur Abreife und Kornentwicklung auf. Eine Desinfektion der Samen mit heißem Wasser führte nicht zur Abtötung von Rcc und somit zur Verbreitung des Pathogens in der Pflanze. In weiteren Untersuchungen wurde die Wirkung von Saatgutbehandlung und Blattfungiziden zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien der infizierten Pflanze getestet. Die Beizmittel Zardex G (Cyproconazol und Imazalil) und das systemische Blattfungizid Proline (Prothioconazole) wurden zu unterschiedlichen Wachstumsphasen der Pflanze appliziert und die Verbreitung von Rcc mittels Real-Time PCR analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fungizide bei separater Anwendung keine Wirkung hatten, eine Kombination der beiden Pflanzenschutzmittel jedoch Effekte zeigte. So konnte nach Beizung mit Zardex G und anschließender Anwendung von Proline im Wachstumsstadium 39-41 ein starker inhibitorischer Effekt auf das pilzliche Wachstum demonstriert werden. In einer weiteren Studie wurde die Verbreitung und Mobilität von Rcc Inokulum über die Luft mittels Sporenfallen untersucht, die entweder in der Nähe eines Gerstenfeldes oder weiter enfernt aufgestellt wurden. Im späten Herbst und in den Wintermonaten wurden Sporen von Rcc in größerer Entfernung von Gerstenfeldern und in höheren Lagen nachgewiesen. Rcc Inokulum ist demnach weit verbreitet und kann auch über größere Distanzen durch die Luft, im Regenwasser oder Schnee transportiert werden. Interessanterweise ist Inokulum auch auch in kühleren Jahreszeiten nachweisbar. Zur Identifizierung resistenter Genotypen erfolgten Phänotypisierungen von Blattsegmenten in der Klimakammer und parallel dazu wurden Screenings unter Feldbedingungen im Reifestadium 73-75 durchgeführt. Es konnten signifikant unterschiedliche Anfälligkeiten gegenüber Rcc sowohl im Feld, als auch unter kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus und der Klimakammer gezeigt werden. So konnten einige Genotypen identifiziert werden, die besonders gute Resistenzen aufwiesen wie z. B. die Sorte IPZ 24727. Eine signifikante Korrelation konnte zwischen den Gewächshausdaten (Inokulation ganzer Pflanzen) und den Felddaten 2009 (p=0,005, rs=0,483) und 2010 (p=0,03, rs=0,384) nachgewiesen werden. Ein Vergleich der Daten des Blattsegment-Assays und der ermittelten Befallsstärke im Gewächshausversuch zeigte eine signifikante Korrelation (p=0,0002, rs=0,592). Darüber hinaus korrelierten die Werte des Assays mit den Felddaten aus dem Jahr 2009 (p=0,0005, rs=0,576) und 2010 (p=0,002, rs=0,513). Eine signifikante Korrelation wurde auch zwischen den Daten der Feldversuche der beiden untersuchten Jahren gezeigt (p=0,04, rs= 0,419). Mittels qPCR wurde Rcc in allen getesteten Genotypen nachgewiesen, d.h., dass keiner der Genotypen komplett resistent war. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Nachweis des Pathogens in frühen Wachstumsstadien bereits vor der Symptomausbildung mittels PCR möglich ist. QPCR Analysen zeigten eine starke Korrelation (p=0,00179, rs=0,851) zwischen den visuellen Boniturdaten und der pilzlichen DNA-Konzentration im F-1Blatt. Eine Anwendung der qPCR zur Selektion resistenter Gerste Genotypen ist daher möglich. Weiterhin wurde mittels HPLC eine neue Detektionsmethode für das Rcc Phototoxin Rubellin entwickelt. Mit dieser sensitiven Methode konnten Konzentrationen des Toxins bereits vor der Symptomausbildung in frühen Wachstumsstadien der Pflanze nachgewiesen werden. Die gemessenen Toxinwerte in infiziertem Blattgewebe korrelierten stark mit den Werten der Sichtbonitur (p=0,00005, rs=0,966657). Diese Methode ist daher zur Identifizierung von resistenten Gerste-Genotypen unter kontrollierten Bedingungen geeignet.

The effects of diurnal temperature fluctuation and the utility of degree days for modeling clubroot on canola (Brassica napus L.) caused by Plasmodiophora brassicae Woronin were assessed using microscopy and qPCR, and in field trials. Temperature fluctuation had little effect on pathogen development. The optimal temperature for root hair infection was 25° C. Air and soil degree days and rainfall were used as metrics for estimating clubroot development, with only limited success. Several cultivars of cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) with unknown clubroot resistance mechanism(s) were assessed using staining and microscopy, and qPCR. In field trials, ‘Bronco’ was susceptible to clubroot (100 DSI), ‘Kilaherb’ was resistant (0 DSI), and ‘B-2819’ was intermediate (53 DSI). Plasmodiophora brassicae was present in cortical tissue of all cultivars. A delayed disease phenotype in ‘B-2819’ may indicate a quantitative resistance genotype that could be exploited in research on resistance genes and breeding.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.