Somites are repeated epithelial segments that are generated in a rhythmic manner from the presomitic mesoderm (PSM) in the embryonic tailbud. Later, they differentiate into skeletal muscle, cartilage and dermis. Somitogenesis is regulated by a complex interplay of different pathways. Notch/Delta signaling is one of the pathways well characterized in zebrafish through mutants affected in its different components. Previous work in mouse, chicken and zebrafish has shown that also additional components are required during somitogenesis, most importantly through an FGF and Retinoic acid (RA) gradient, as well as Wnt signaling. However, no zebrafish mutants with defects in these pathways showing specific somite malformations are described. This was explained by functional redundancies among related genes that have resulted from a whole genome duplication which occurred in a teleost fish ancestor 350 million years ago. As distinct duplicates exist in different teleost species, a large scale mutagenesis screen in the medaka (Oryzias latipes) has been performed successfully in Kyoto, Japan. I analyzed nine of the isolated medaka mutants that show variable aspects of somitic phenotypes. This includes a complete or partial loss of somite boundaries (e.g. bms and sne), somites with irregular sizes and shapes (e.g. krz and fsl) or partially fused and enlarged somites (e.g. dpk). Although some of these medaka mutants share characteristics with previously described zebrafish somite mutants, most of the mutants represent unique phenotypes, not obtained in the zebrafish screens. In-situ hybridization analyses with marker genes implicated in the segmentation clock (e.g. her7), establishment of anterior-posterior (A-P) polarity (e.g. mesp) and differentiation of somites (e.g. myf5, lfng) revealed that the medaka mutants can be separated into two classes. Class I shows defects in tailbud formation and PSM prepatterning, and lateron somite boundary formation was impaired in these mutants. A unique member of this class with a novel phenotype is the doppelkorn (dpk) mutant that has single fused or enlarged somites. This phenotype has not been reported till now in zebrafish somite mutants. In-situ analyses on dpk showed that stabilization of the cyclically expressed somitogenesis clock genes must be affected in this mutant. This is accompanied by a disrupted regulation of A-P polarity genes like mesp. This suggests that dpk is a mutant deficient in the wave front, which is necessary for the down-regulation of oscillating genes in the anterior PSM. Furthermore, as the initiation of oscillation of all three cyclic her genes was unaffected in dpk embryos, I could exclude that this mutant in affected in the Notch/Delta pathway. Another mutant that belongs to this class is the samidare (sam) mutant. Morphologically, sam mutants are similar to zebrafish after eight (aei). In both cases, the first 7-9 somites are formed properly, but after this somite formation ceases. Different to the situation in aei, sam mutant embryos presented an additional defect in the mid-hindbrain boundary (MHB) region. Similar MHB defects were described in the zebrafish fgf8 mutant acerebellar (ace). In ace zebrafish mutant, somites were only slightly defective, although FGF signaling has been shown to be important for somite formation in chicken, mouse and zebrafish. This was explained by functional redundancy between fgf8 and fgf24 ligands in the tailbud of zebrafish. Thus, it is interesting to suggest that the sam mutant, based on the parallel defects in somites and MHB, is a potential member of the FGF signaling pathway muatnts. It was shown that FGF plays a crucial role during MHB formation in medaka. In addition, I showed that fgf8 acts non-redundantly during tailbud formation and somitogenesis in medaka. Furthermore, I showed that FGF signaling regulates somite size also in medaka and that fgfr1 is the only FGF receptor expressed in the tailbud and somites. In class II medaka somite mutants, PSM prepatterning appears normal, whereas A-P polarity, boundary formation, epithelialization or the later differentiation of somites appears to be affected. Such mutants have not been isolated so far in zebrafish, mice or chicken. Therefore, medaka class II somite mutants seem to be a novel group of mutants that opens new perspectives to analyze A-P polarity regulation, determination and boundary formation in the presence of a normally functioning clock in the PSM. Identifying the encoding genes for all analyzed medaka somite mutants will contribute to the understanding of the molecular interactions of different signaling pathways involved during somitogenesis, and is expected to result in the identification of new components. / Die Somitogenese stellt einen entscheidenden Prozess bei der Entwicklung von Wirbeltierembryonen dar. Somiten sind transiente Strukturen, die sich im Verlauf der Embryonalentwicklung zu Skelettmuskulatur, Dermis und Wirbelkörper differenzieren. Somiten entstehen in einem sich regelmäßig wiederholenden Zyklus aus Stammzellen des präsomitischen Mesoderms (PSM), einer Wachstumszone am caudalen Ende des Embryos. Ein wichtiger Bestandteil der Somitogenese ist ein molekularer Oszillator, das so genannte „Segmentierungs-Uhrwerk“. Die periodische Segmentierung des präsomitischen Mesoderms wird reguliert durch eine Reihe komplexer Interaktionen von unterschiedlichen Signale wegen. Der Notch/Delta Signalweg spielt dabei eine zentrale Bedeutung, da hierbei Komponenten entdeckt wurden, die während der Somitogenese zyklisch im PSM exprimiert werden. Außer dem Notch/Delta Signalweg spielen auch ein FGF und Retinolsäure Gradient, sowie Wnt Signale eine wichtige Rolle bei der Somitogenese. Trotz mehrerer Mutagenese Screens im Zebrafisch wurden bislang keine Mutanten im FGF oder Wnt Signalweg entdeckt, die einen spezifischen Somiten Defekt besitzen. Die wurde durch eine funktionelle Redundanz unterschiedlicher Gene erklärt, die durch eine Duplikation im Genom von Teleostieren vor 350 Millionen Jahren enstanden ist. Da unterschiedliche Duplikate in verschiedenen Fischspezies existieren, wurde in den letzten Jahren ein grosser Mutagenese Screen bei Medaka (Oryzias latipes) in Kyoto, Japan durchgeführt. In meiner Arbeit habe ich neue Somitogenese Mutanten aus dieser Screen isoliert und Phänotypisch charakterisiert. Die neun isolierten Mutanten zeigten unterschiedliche Somiten Phänotypen. Einige Mutanten hatten wenige oder gar keine Somitengrenzen (z.B bms oder sne), andere hatten unregelmäßige Somiten Formen (z.B. krz oder fsl) oder unterschiedlich große Somiten (z.B dpk). Manche dieser Medaka wiesen Änlichkeiten Mutanten zu im Zebrafisch beschriebenen Somiten Mutanten auf. Die Mehrzahl der Mutanten zeigten jedoch Phänotypen, die bis jetzt noch nicht in Zebrafisch Screens gefunden worden. In-Situ Analysen mit Hilfe unterschiedlicher, neu isolierter Somitenmarker, wie z.B. her7 einem Bestandteil des molekularen Oszillators, mesp einem anterior-posterioren Gen oder den Somitendifferenzierungsgenen lfng oder myf5 erlaubten, die Medaka Mutanten in zwei unterschiedliche Gruppen zuzuordnen. Gruppe I zeigt Defekte in der Bildung der Schwanzknospe und der Musterbildung im PSM. Ein besonderes Beispiel dieser Gruppe ist die Mutante doppelkorn (dpk), die einen bislang nicht beschriebenen Somitenphänotyp besitzt. In-situ Analysen von dpk zeigten, dass zyklische Gene im anterioren PSM dieser Mutante nicht stabilisiert werden und auch A-P Polaritätsgene fehlerhaft reguliert werden. Das deutet darauf hin, dass in der dpk Mutante ein Faktor der sogenannten „Wavefront“ betroffen sein könnte, der wichtig ist für die Regulation von oszillierenden Genen im anterioren PSM ist. Ich konnte zeigen, daß der wichtige Notch/Delta Signalweg in dieser Mutante nicht betroffen ist, weil alle unterschiedlichen zyklischen Gene, her1, her5 und her7, eine normale dynamische initiation ihrer Expression zeigten. Gruppe II Mutanten zeigen Defekte bei der Bildung der Somitengrenzen und Epithelialisierung der Somiten trotz normales, Musterbildung im PSM. Solche Mutanten wurden bislang weder in Zebrafisch, noch in Maus oder Hühnchen gefunden. Deshalb sollten nach der molekularen Identifiezierung der mutierten Gene neue Faktoren erhalten werden, die vor allem für die Regulation später Somitogenese-phasen wichtig sind.

Malignant melanoma is the most severe form of all skin cancers with a particular poor prognosis once metastases have developed. Angiogenesis, the formation of new blood vessels, is a prominent feature of human melanoma, which have angiogenic activity already early in development. This is at least partly ascribed to the action of MAPK- and PI3K pathways which are hyperactivated in most melanoma. Animal models which combine in depth in vivo examinations with the opportunity to perform small molecular screens are well suited to gain a more detailed insight into how this type of cancer modulates its angiogenic program. Here, a first transgenic melanoma angiogenesis model was established in the fish species Oryzias latipes (Japanese medaka). In this model, tumors are generated by the pigment cell-specific expression of the oncogenic receptor tyrosine kinase Xmrk. Xmrk is a mutated version of the fish Egfp. Furthermore, to get an angiogenesis model, a medaka line with endothelial cell specific GFP expression was used. By using crosses between these Xmrk- and GFP transgenic fishes, it was shown that angiogenesis occurs in a reactive oxygen species- and NF-κB-dependent manner, but was hypoxia-independent. It was observed that blood vessel sprouting and branch point formation was elevated in this model and furthermore that sprouting could even be induced by single transformed cells. The mouse melanocytes expressing the oncogenic receptor tyrosine kinase Xmrk as well human melanoma cells, which display various oncogenic alterations, produced pro-angiogenic factors, most prominently angiogenin, via NF-κB signaling. Furthermore, inhibiting NF-κB action prevented tumor angiogenesis and even led to the regression of existing tumor blood vessels. In summary, the present medaka melanoma angiogenesis model displays a high sensitivity for angiogenesis detection and is perfectly suited as in vivo model for the testing of anti-angiogenesis inhibitors, as exemplified by the NF-kappaB inhibitor. Furthermore, results indicate that it might be a promising anti-tumor strategy to target signaling pathways such as the NF-κB pathway which are able to induce angiogenesis-dependent as well as -independent pro-tumorigenic effects. / Das maligne Melanom ist die schwerste Form aller Hautkrebsarten und hat eine besonders schlechte Prognose, sobald sich Metastasen gebildet haben. Angiogenese, die Bildung von neuen Blutgefäßen aus bestehenden Gefäßen, ist bei humanen Melanomen häufig zu beobachten. Es wurde gezeigt, dass diese Tumore eine hohe angiogene Aktivität besitzen. Diese wird zumindest teilweise der Aktivität der MAKP und PI3K Signalwege zugeschrieben, welche in den meisten Melanomen hyperaktivert sind. Tiermodelle, die sowohl in vivo Untersuchungen als auch „small molecular screens“ erlauben, sind gut geeignet, um detaillierte Kenntnisse über pro-angiogene Programme zu erlangen. In dieser Arbeit wurde ein erstes transgenes Melanom-Angiogenese-Model in der Fischspezies Oryzias latipes (Medaka) etabliert. In diesem Model werden Tumore durch eine pigmentzell-spezifische Expression der onkogenen Tyrosinkinase Xmrk erzeugt. Xmrk ist eine mutierte Version des Egfp im Fisch. Weiter gibt es in diesem Modellorganismus eine endothelzell-spezifische GFP-Linie. Durch Kreuzen der Xmrk- und GFP-transgenen Linien konnte das beschriebene Tumorangiogenese-Modell generiert werden. An Hand dieses Models konnte gezeigt werden, dass Angiogenese in einer reaktiven Sauerstoffspezies- und NF-κB-abhängigen Weise auftrat, jedoch unabhängig von Hypoxie stattfand. Es wurde beobachtet, dass die Sprossung- und Verzweigungsvorgänge der Blutgefäße sogar durch einzelne transformierte Pigmentzellen induziert wurden. Sowohl Mausmelanozyten, die die onkogene Rezeptortyrosinkinase Xmrk expriemieren, als auch humane Melanomzellen produzieren pro-angiogene Faktoren, wie zum Beispiel Angiogenin, über den NF-κB-Signalweg. Eine Hemmung von NF-κB hatte eine Verminderung der Tumorangiogenese zur Folge und führte sogar zur Rückbildung von bestehenden tumorösen Blutgefäßen. Zusammenfassend zeigt das Medaka-Melanom-Angiogenese-Model eine hohe Sensitivität für den Nachweis von Angiogeneseprozessen und ist vortrefflich geeignet als in vivo Modell zur Durchführung von Angiogenese-Inhibitor-Tests, wie beispielsweise mit dem NF-κB-Inhibitor gezeigt wurde. Eine pharmakologische Hemmung multi-potenter Signalwege mit Angiogenese-abhängigen und –unabhängigen pro-tumorigenen Effekten wie beispielsweise den NF-κB-Signalweg könnte eine erfolgsversprechende Antitumorstrategie darstellen.

Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat. Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen­‐zu­‐Männchen Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert. / Primordial Germ Cells (PGCs) are the only cells, which can transport genetic information from one generation to the next one. In all investigated teleost fish the different number of germ cells is the foist recognizable difference between mal and female. Therefore the question arises, if the number of germ cells is the sex determining mechanism, or if the somatic cells of the gonad stimulate the PGCs to proliferate. To investigate the connection between germ cell number and sex determination in medaka, i manipulated the number of germ calls and followed their fate through embryonic development. Furthermore i investigated the influence of temperature on sex determination and behavior and number of germ cells. I could show, that it is possible to ablate all PGCs by DND morpholino injection. While total absence of PGCs led to infertile male development with string like gonads, increasing the number of PGCs by bucky ball mRNA injection showed no influence on sexual development. Interestingly I observed that even when I increased the number early in embryonic development by more than two-­fold, PGC number after some time went down to the untreated embryo level. This points to a non‐cell autonomous mechanism, which limits PGC number according to the somatic SD process.

The process of sex-determination can be better understood through examinations of developing organs and cells, which are involved in the formation of undifferentiated gonad. This mechanisms show in fish a broad variety, ranging from hermaphroditism to gonochorism and environmental to genetic sex determination. Hormones and abiotic factors such as temperature and pH can influence teleost development and reproductive traits. These factors are vulnerable to pollutants and climate changes. Therefore, it is important to examine gonad development and sex-determination/differentiation in teleost fish. Teleost fish are the largest known group of vertebrates with approximately 25,000 species and are used for such kind of examinations as model organisms. Recently, in Oryzias latipes (medaka), dmrt1bY (or dmy), a member of the Dmrt gene family, has been described as testis-determining gene. However, this gene is not the universal master sex-determining gene in teleost fish. Although dmrt1bY is present in the most closely related species of the genus, namely Oryzias curvinotous, it is absent from other Oryzias species, like Oryzias celebensis, and other fish. During my thesis, I studied gonad development in medaka and in the closely related species Oryzias celebensis. Germ cell specification in medaka seems to be dependent on maternally provided cytoplasmatic determinants, so called germ plasm. Nanos and vasa are such germ cell specific genes. In zebrafish they are asymmetrically localized in the early embryo. I have shown that nanos mRNA is evenly distributed in the early embryo of medaka. A similar pattern has been already described for the medaka vasa homolog, olvas. This suggests differences in PGC specification in zebrafish and medaka. Further, the vasa homolog was isolated and the expression pattern examined in O. celebensis. The results show that it can be used as a germ cell specific marker. Additionally, the primordial germ cell migration in O. celebensis was followed, which is similar to medaka PGC migration. Primordial germ cell migration in vertebrates is dependent on the chemokine stromal cell-derived factor 1 (Sdf-1). Medaka has two different sdf-1 genes, sdf-1a and sdf-1b. Both genes are expressed in the lateral plate mesoderm (LPM). During late embryonic development, I could show that sdf-1a is expressed in newly formed somites and not longer in the LPM. Sdf-1b expression persisted in the posterior part of the lateral plate mesoderm in the developing gonad. In terms of early and late functions, this suggests subfunctionalization of sdf-1a and sdf-1b. In “higher” vertebrates, genes that are involved in the process of gonad development have been studied in detail, e.g. Wt1, Sox9, and Amh. I have analyzed the expression pattern of wt1 and sox9 co-orthologs and amh. In both, the medaka and O. celebensis, wt1a transcripts were localized in the LPM and its expression was similar to sdf-1a gene expression in medaka. Wt1b expression was restricted to the developing pronephric region. During later embryonic development, wt1a is specifically expressed in the somatic cells of the gonad primordium in both sexes. This is the first time that in fish wt1 gene expression in developing gonads has been described. Therefore, this result suggests that wt1a is involved in the formation of the bipotential gonad. Furthermore, I have analyzed the gonad specific function of the wt1 co-orthologs in medaka. I could show that a conditional co-regulation mechanism between Wt1a and Wt1b ensures PGC maintenance and/or survival. The expression of sox9 genes in medaka and sox9b in O. celebensis were detected in the somatic cells of the gonad primordium of both sexes. Additionally, I have shown that amh and amhrII in medaka are expressed in somatic cells of the gonad primordium of both sexes. This suggests that sox9b, amh and amhrII are involved in gonad development and have specific functions in the adult gonad. In O. celebensis I could detect an expression of dmrt1 already six days after fertilization in half of the embryos, which is similar to the dmrt1bY expression in medaka. Whether the expression of dmrt1 is male specific in O. celebensis is currently under investigation. Altogether, the obtained results provide new insights into gene expression patterns during the processes of gonad development. Furthermore, no differences in the expression pattern of wt1a and sox9b during gonad development between the medaka and O. celebensis could be detected. This might indicate that the genetic mechanisms during gonad development are similar in both species. / Die Untersuchung der Keimzellwanderung in O. celebensis zeigte hohe Ähnlichkeiten zu der bereits Beschriebenen im Medaka. Die Keimzellwanderung in Wirbeltieren ist abhängig von stromal cell-derived factor 1 (Sdf-1), einem chemotaktisch wirkendem Zytokinin. Im Medaka existieren zwei sdf-1 Gene, sdf-1a und sdf-1b, die während der embryonalen Entwicklung im Seitenplattenmesoderm (LPM) exprimiert werden. Die Expression der beiden Gene unterscheiden sich jedoch zeitlich und auch örtlich im LPM. Dies lässt vermuten, dass sich im Verlauf der Evolution eine frühe und eine späte keimzellspezifische Funktion zwischen sdf-1a und sdf-1b aufgeteilt hat. In „höheren“ Wirbeltieren wurden schon verschiedene Gene, z.B. Wt1, Sox9 und Amh, in dem Prozess der Gonadenentwicklung beschrieben. Die Expressionsmuster von wt1 und sox9 Co-Orthologen und amh habe ich während meiner Arbeit untersucht. Im Medaka und in O. celebensis wird wt1a im LPM transkribiert und ähnelt der von sdf-1a im Medaka. Die Expression von wt1b erfolgt hingegen nur in der Region der Vorläufer-Niere. Im weiteren Verlauf der Embryogenese ließen sich wt1a Transkripte erstmalig in somatischen Zellen des Gonaden-Vorläufers nachweisen. Wt1a spielt vermutlich eine Rolle in der Entwicklung der bipotentialen Gonade. Die funktionelle Analyse von wt1 Genen im Medaka zeigte, dass durch eine konditionale Co-Regulation zwischen wt1a und wt1b die Keimzellen überleben bzw. erhalten bleiben. Die Expression von sox9b im Medaka und in O. celebensis ließ sich in somatischen Zellen des Gonaden-Vorläufers nachweisen. Zusätzlich werden amh und amhrII ebenfalls in somatischen Zellen beider Geschlechter exprimiert, daher kann man eine wichtige Rolle dieser Gene während der Gonadenentwicklung und in der adulten Gonade annehmen. Die Expression von dmrt1 in O. celebensis konnte ich, in etwa der Hälfte der beobachteten Embryonen, bereits schon früh in der embryonalen Entwicklung (6 Tage nach der Befruchtung) nachweisen. Das Transkriptionsmuster von dmrt1 in O. celebensis ist ähnlich der Expression von dmrt1bY im Medaka. Inwieweit diese Expression in O. celebensis spezifisch für Männchen ist wird zurzeit noch untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen neue Einblicke in die Genexpressionsmuster der Gonadenentwicklung von Medaka und O. celebensis und weisen neue Möglichkeiten für weitere Forschungen auf. Des Weiteren konnte ich im Verlauf der Gonadenentwicklung keine Unterschiede in der Genexpression von wt1a und sox9b zwischen Medaka und O. celebensis nachweisen. Dies deutet an, dass die genetischen Mechanismen der Gonadenentwicklung zwischen den beiden nahverwandten Arten sehr ähnlich sind.

Melanoma arises from the malignant transformation of melanocytes and is one of the most aggressive forms of human cancer. In fish of the genus Xiphophorus, melanoma development, although very rarely, happens spontaneously in nature and can be induced by interspecific crossing. The oncogenic receptor tyrosine kinase, Xmrk, is responsible for melanoma formation in these fishes. Since Xiphophorus are live-bearing fishes and therefore not compatible with embryonic manipulation and transgenesis, the Xmrk melanoma model was brought to the medaka (Oryzias latipes) system. Xmrk expression under the control of the pigment cell specific mitf promoter leads to melanoma formation with 100% penetrance in medaka. Xmrk is an orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and activates several downstream signaling pathways. Examples of these pathways are the direct phosphorylation of BRAF and Stat5, as well as the enhanced transcription of C-myc. BRAF is a serine-threonine kinase which is found mutated at high frequencies in malignant melanomas. Stat5 is a transcription factor known to be constitutively activated in fish melanoma. C-myc is a transcription factor that is thought to regulate the expression of approximately 15% of all human genes and is involved in cancer progression of a large number of different tumors. To gain new in vivo information on candidate factors known to be involved in melanoma progression, I identified and analysed BRAF, Stat5 and C-myc in the laboratory fish model system medaka. BRAF protein motifs are highly conserved among vertebrates and the results of this work indicate that its function in the MAPK signaling is maintained in medaka. Transgenic medaka lines carrying a constitutive active version of BRAF (V614E) showed more pigmented skin when compared to wild type. Also, some transiently expressing BRAF V614E fishes showed a disrupted eye phenotype. In addition, I was able to identify two Stat5 copies in medaka, named Stat5ab/a and Stat5ab/b. Sequence analysis revealed a higher similarity between both Stat5 sequences when compared to either human Stat5a or Stat5b. This suggests that the two Stat5 copies in medaka arose by an independent duplication processes. I cloned these two Stat5 present in medaka, produced constitutive active and dominant negative gene versions and successfully established transgenic lines carrying each version under the control of the MITF promoter. These lines will help to elucidate questions that are still remaining in Stat5 biology and its function in melanoma progression, like the role of Stat5 phosphorylation on tumor invasiveness. In a third project during my PhD work, I analysed medaka C-myc function and indentified two copies of this gene in medaka, named c-myc17 and c-myc20, according to the chromosome where they are located. I produced conditional transgenic medaka lines carrying the c-myc17 gene coupled to the hormone binding domain of the estrogen receptor to enable specific transgene activation at a given time point. Comparable to human C-myc, medaka C-myc17 is able to induce proliferation and apoptosis in vivo after induction. Besides that, C-myc17 long-term activation led to liver hyperplasia. In summary, the medaka models generated in this work will be important to bring new in vivo information on genes involved in cancer development. Also, the generated transgenic lines can be easily crossed to the melanoma developing Xmrk medaka lines, thereby opening up the possibility to investigate their function in melanoma progression. Besides that, the generated medaka fishes make it possible to follow the whole development of melanocytes, since the embryos are transparent and can be used for high throughput chemical screens. / Melanome entstehen durch die krankhafte Transformation von Melanozyten und sind eine der aggressivsten Krebsarten beim Menschen. In Fischen der Gattung Xiphophorus können, wenn auch sehr selten, spontan Melanome entstehen oder durch spezielle Artenkreuzungen induziert werden. Grundlage für das Entstehen der Melanome in diesen Fischen ist die Rezeptortyrosinkinase Xmrk. Da alle Xiphophorus-Arten lebendgebärend sind und keine Manipulationen an Embryonen vorgenommen werden können, wurde ein Xmrk Melanommodel für Medaka (Oryzias latipes) etabliert. Die Expression von Xmrk in Pigmentzellen dieser Fischart resultiert mit 100%iger Penetranz in Melanomen. Das Xmrk ist ein Ortholog des menschlichen „epidermal growth factor“ (EGFR) und aktiviert verschiedene nachgeschaltete Signalwege. Beispiele für diese Aktivierungen sind die Phosphorylierung von BRAF, Stat5 und die erhöhte Expression von c-myc. BRAF ist eine Serin-Threoninkinase, welche oft in malignen Melanomen mutiert ist. Stat5 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher dauerhaft in Fischtumoren aktiviert ist. C-myc ist ein Transkriptionsfaktor, welcher etwa 15% aller menschlichen Gene sowie die Entstehung vieler menschlicher Tumore reguliert. Um neue Einsichten in die Funktion der Kanidatengene im Prozess der Melanomentstehung in vivo zu erlangen, habe ich Orthologe von BRAF, Stat5 und C-myc bei Medaka identifiziert und analysiert. Die Domänen des BRAF Proteins sind hoch konserviert in allen Vertebraten. Weiterhin deuten die Ergebnisse meiner Arbeit auf eine Beibehaltung der Funktionen im MAPK Signalweg hin. Transgene Medakalinien, welche eine dauerhaft aktive Version des BRAF Gens (V614E) exprimieren, weisen einerseits eine stärkere Hautpigmentierung auf. Weiterhin treten in diesen Fischen Veränderungen der Augen auf. In einem weiteren Projekt meiner Arbeit gelang es mir, zwei Kopien des Stat5 Gens im Medaka zu identifizieren, Stat5ab/a und Stat5ab/b. Sequenzanalysen zeigten eine höhere Übereinstimmung zwischen den beiden Genkopien, als zwischen denen von Medaka und Menschen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Medaka Gene durch eine unabhängige Duplikation entstanden. In meiner Arbeit habe ich beide Gene des Medakas kloniert und jeweils eine konstitutiv aktive und eine dominant negative Version der Gene hergestellt. Weiterhin konnte ich erfolgreich für jede Genversion eine transgene Medakalinie etablieren, welche die verschiedenen Genvarianten unter der Kontrolle des pigmentzellspezifischen Promoters des mitf Gens exprimieren. Diese Linien werden in Zukunft helfen, den Einfluss von Stat5 Signalen auf den Prozess der Melanomverbreitung und dessen Invasivität zu erklären. In einem dritten Projekt meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Vorkommen und die Funktion der C-myc Gene des Medakas. Ich konnte zwei Genkopien identifizieren, c-myc17 und c-myc20, welche auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Ich konnte induzierbare, stabil transgene Linien herstellen, welche ein Fusionsprotein aus C-myc17 und der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors von Maus exprimiert. Diese Linie ermöglichte eine induzierbare Aktivität des Transgens. Vergleichbar zum menschlichen MYC ist C-myc17 fähig, nach Aktivierung Proliferation und Apoptose in vivo auszulösen. Dauerhafte Aktivierung über einen längeren Zeitraum führt in diesen Linien zu Hyperplasie in Leber. Die verschiedenen Fischmodelle, die während dieser Arbeit generiert wurden, werden essentiell sein, um neue Einsichten in die Rolle diese Faktoren während der Krebsentwicklung in vivo zu erlangen. Weiterhin ermöglichen diese transgenen Linien durch einfaches Auskreuzen auf Xmrk Linien, deren Einfluss auf die Verbreitung von Melanomen zu untersuchen. Letztendlich sind mit diesen Linien auch Untersuchungen der Entwicklung von Pigmentzellen über Zeit möglich, da die Embryonen transparent sind und sich für chemisches Hochdurchsatz-Screening eignen.

Sex determination (SD) is a complex and diverse developmental process that leads to the decision whether the bipotential gonad anlage will become a testis or an ovary. This mechanism is regulated by gene cascades, networks and/or chromosomal systems, and can be influenced by fluctuations of extrinsic factors like temperature, exposure to hormones and pollution. Within vertebrates, the group of fish show the widest variety of sex determination mechanism. This whole diversity of processes and mechanisms converges to the formation of two different gametes, the eggs and the sperm, the first bigger and static, and the second smaller and motile. Meiosis is crucial for the formation of both types of gametes, and the timing of meiosis entry is one of the first recognizable differences between male and female in vertebrates. The germ cells go into meiosis first in female than in male, and in mammals, this event has been shown to be regulated by retinoic acid (RA). This small polar molecule induces in the germ cells the expression of the pre-meiotic marker Stra8 (stimulated by retinoic acid gene 8), which is necessary for meiosis initiation. Interestingly, genome analyzes have shown that the majority of fish (including medaka) lack the stra8 gene, adding a question mark to the role of RA in meiosis induction in this group. Since a role of RA in entry of meiosis and sexual development of fish is still far from being understood, I investigated in medaka (Oryzias latipes) a possible signaling function of RA during the SD period in embryos and in reproductively active gonads of adults. I generated a transgenic medaka line that reports responsiveness to RA in vivo. With this tool, I compared RA responsiveness with the expression of the main gene involved in the synthesis of RA. My results show that there is a de-correlation between the action of RA with its source. In adults, expression of the RA metabolizing enzymes show sexually dimorphic RA levels, with aldh1a2 levels being higher in testis, and cyp26a1 stronger in female gonad. In ovary, the responsiveness is restricted to the early meiotic oocytes. In testis, RA is acting directly in the pre-meiotic cells, but also in Sertoli and Leydig cells. Treatment experiments on testis organ culture showed that RA pathway activation leads to a decrease in meiosis markers expression levels. During the development, RA responsiveness in the germ cells was observed in both sexes much earlier than the first female meiosis entry. Treatments with RA-synthesis inhibitor show a decrease in meiosis markers expression levels only after the sex differentiation period in female. Expression analyzes of embryos treated with exogenous RA showed induction of dmrt1a at the gonad levels and an increase of amh levels. Both genes are not only involved in male formation, but also in the regulation of germ cell proliferation and differentiation. RA is important in meiosis induction and gametogenesis in adult medaka. However, there is no evidence for a similar role of RA in initiating the first meiosis in female germ cells at the SD stage. Moreover, contrary to common expectation, RA seems to induce sex related genes that are involved indirectly in meiosis inhibition. In this thesis, I showed for the first time that RA can be involved in both induction and inhibition of meiosis entry, depending on the sex and the developmental stage in a stra8-independent model organism. / Geschlechtsbestimmung ist ein komplexer und vielfältiger Entwicklungsprozess, der zu der Entscheidung führt, ob sich aus der bipotenten Gonadenanlage Hoden oder Ovarien entwickeln. Dieser Mechanismus ist durch Genkaskaden, Netzwerke und/oder chromosomale Systeme reguliert, kann aber auch durch Fluktuation äußerer Faktoren wie beispielsweise Temperatur, durch Hormonexposition oder durch Umweltverschmutzung beeinflusst werden. Innerhalb der Wirbeltiere zeigen Fische die größte Vielfalt in Bezug auf die Mechanismen der Geschlechtsbestimmung. Die unterschiedlichen Mechanismen der Geschlechtsbestimmung konvergieren in der Entstehung von der beiden unterschiedlichen Geschlechtszellen, der Eizelle und des Spermiums. Die Eizelle ist groß und statisch, das Spermium hingegen ist kleiner und beweglich. Die entscheidende Rolle für die Entstehung der Geschlechtzellen spielt die Meiose. Der Zeitpunkt, an dem zum ersten Mal in der Entwicklung die Meiose einsetzt, ist der erste erkennbare Unterschied in der Gonadenentwicklung zwischen männlichen und weiblichen Wirbeltieren. Die Meiose der Keimzellen beginnt bei Weibchen früher als bei Männchen. Bei Säugetieren reguliert Retinsäure (RA) diesen Prozess. Dieses kleine polare Molekül induziert die Expression des Prä-Meiose-Markers Stra8 (stimulated by retinoic acid gene 8) in den Keimzellen, welcher für den Eintritt in die Meiose essentiell ist. Interessanterweise haben Genomanalyzen gezeigt, dass das stra8 Gen in Medaka sowie in den meisten anderen Fischarten nicht vorhanden ist. Dies stellt eine vergleichbare Rolle von RA für die Induktion der Meiose wie bei Säugetieren in diesen Fischen in Frage. Da die Rolle von RA für den Eintritt in die Meiose sowie für die Geschlechtsentwicklung in Fischen bisher nur unzureichend untersucht und verstanden ist, habe ich bei Medaka (Oryzias latipes) eine mögliche Funktion von RA für die Geschlechtsdetermination in Embryonen sowie in Gonaden geschlechtsreifer Tiere untersucht. Ich habe im Rahmen dieser Arbet eine transgene Medakalinie generiert, die in vivo eine RA induzierte Genexpression durch ein GFP Reportergen anzeigt. Mit Hilfe dieser Linie wurde die transkriptionsreulierende Aktivität von RAmit der Expression der wichtigsten Gene, die in die RA Synthese involviert sind, verglichen. Meine Ergebnisse zeigen eine Diskrepanz zwischen dem Wirkungs- und Syntheseort von RA. Die RA metabolisierenden Enzyme zeigten eine geschlechtsdimorphe Expression in adulten Medakas, mit einer höheren aldh1a2 Expression im Hoden sowie einer stärkeren cyp26a1 Expression in weiblichen Gonaden. Im Ovar sind lediglich frühe meiotische Eizellen RA-sensitiv. Im Hoden wirkt RA direkt in prä-meiotische Zellen, aber auch in Sertoli und Leydig Zellen. Stimulations-Experimente an Hoden Organkulturen ergaben, dass eine Aktivierung des RA Signalwegs zu einer Abnahme des Expressionslevels von Meiose-Markern führt. Während der Embryonalentwicklung konnte in den Keimzellen beider Geschlechter eine transkriptions-induziernende Aktivität von RA bereits zu einem Zeitpunkt beobachtet werden, der deutlich vor dem ersten Meiose Eintritt in Weibchen liegt. Behandlungen mit einem RA-Synthese Inhibitor zeigten lediglich nach der Geschlechtsdifferenzierung in Weibchen eine verminderte Expression der Meiose-Marker. Expressionsanalysen von Embryonen, die mit exogener RA behandelt wurden, ergaben eine Induktion von dmrt1a in den Gonaden und ein Anstieg von amh. Beide Gene sind sowohl in die männliche Geschlechtsentwicklung involviert, als auch in die Regulation der Keimzellproliferation und –differenzierung. Zusammen ergaben meine Untersuchungen, dass RA für die Induktion der Meiose und der Gametogenese in adulten Medakas wichtig ist. Allerdings gibt es keinen Hinweis für eine ähnliche Rolle 11 von RA bei der Initiierung der ersten Meiose in weiblichen Keimzellen während der Geschlechtsdetermination. Im Gegensatz zur bisher beschriebenen Situation, scheint darüber hinaus RA die Expression geschlechtsspezifischer Gene zu induzieren, die indirekt in die Inhibition der Meiose involviert sind. In der vorliegenden Arbeit konnte in einem stra8-unabhängigen Modelorganismus das erste Mal gezeigt werden, dass RA – abhängig vom Geschlecht und vom Stadium der Entwicklung - sowohl in die Induktion als auch in die Inhibition des Meiose-Eintritts involviert ist.

Puberty is an important period of life with physiological changes to enable animals to reproduce. Xiphophorus fish exhibit polymorphism in body size, puberty timing, and reproductive tactics. These phenotypical polymorphisms are controlled by the Puberty (P) locus. In X. nigrensis and X. multilineatus, the P locus encodes the melanocortin 4 receptor (Mc4r) with high genetic polymorphisms. Mc4r is a member of the melanocortin receptors, belonging to class A G-protein coupled receptors. The Mc4r signaling system consists of Mc4r, the agonist Pomc (precursor of various MSH and of ACTH), the antagonist Agrp and accessory protein Mrap2. In humans, MC4R has a role in energy homeostasis. MC4R and MRAP2 mutations are linked to human obesity but not to puberty. Mc4rs in X. nigrensis and X. multilineatus are present in three allele classes, A, B1 and B2, of which the X-linked A alleles express functional receptors and the male-specific Y-linked B alleles encode defective receptors. Male body sizes are correlated with B allele type and B allele copy numbers. Late-maturing large males carry B alleles in high copy number while early-maturing small males carry B alleles in low copy number or only A alleles. Cell culture co-expression experiments indicated that B alleles may act as dominant negative receptor mutants on A alleles. In this study, the main aim was to biochemically characterize the mechanism of puberty regulation by Mc4r in X. nigrensis and X. multilineatus, whether it is by Mc4r dimerization and/or Mrap2 interaction with Mc4r or other mechanisms. Furthermore, Mc4r in X. hellerii (another swordtail species) and medaka (a model organism phylogenetically close to Xiphophorus) were investigated to understand if the investigated mechanisms are conserved in other species. In medaka, the Mc4r signaling system genes (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) are expressed before hatching, with agrp1 being highly upregulated during hatching and first feeding. These genes are mainly expressed in adult brain, and the transcripts of mrap2 co-localize with mc4r indicating a function in modulating Mc4r signaling. Functional comparison between wild-type and mc4r knockout medaka showed that Mc4r knockout does not affect puberty timing but significantly delays hatching due to the retarded embryonic development of knockout medaka. Hence, the Mc4r system in medaka is involved in regulation of growth rather than puberty. In Xiphophorus, expression co-localization of mc4r and mrap2 in X. nigrensis and X. hellerii fish adult brains was characterized by in situ hybridization. In both species, large males exhibit strikingly high expression of mc4r while mrap2 shows similar expression level in the large and small male and female. Differently, X. hellerii has only A-type alleles indicating that the puberty regulation mechanisms evolved independently in Xiphophorus genus. Functional analysis of Mrap2 and Mc4r A/B1/B2 alleles of X. multilineatus showed that increased Mrap2 amounts induce higher cAMP response but EC50 values do not change much upon Mrap2 co-expression with Mc4r (expressing only A allele or A and B1 alleles). A and B1 alleles were expressed higher in large male brains, while B2 alleles were only barely expressed. Mc4r A-B1 cells have lower cAMP production than Mc4r A cells. Together, this indicates a role of Mc4r alleles, but not Mrap2, in puberty onset regulation signaling. Interaction studies by FRET approach evidenced that Mc4r A and B alleles can form heterodimers and homodimers in vitro, but only for a certain fraction of the expressed receptors. Single-molecule colocalization study using super-resolution microscope dSTORM confirmed that only few Mc4r A and B1 receptors co-localized on the membrane. Altogether, the species-specific puberty onset regulation in X. nigrensis and X. multilineatus is linked to the presence of Mc4r B alleles and to some extent to its interaction with A allele gene products. This is reasoned to result in certain levels of cAMP signaling which reaches the dynamic or static threshold to permit late puberty in large males. In summary, puberty onset regulation by dominant negative effect of Mc4r mutant alleles is a special mechanism that is found so far only in X. nigrensis and X. multilineatus. Other Xiphophorus species obviously evolved the same function of the pathway by diverse mechanisms. Mc4r in other fish (medaka) has a role in regulation of growth, reminiscent of its role in energy homeostasis in humans. The results of this study will contribute to better understand the biochemical and physiological functions of the Mc4r system in vertebrates including human. / Die Pubertät ist ein wichtiger Lebensabschnitt mit physiologischen Veränderungen, die die Fortpflanzung von Tieren ermöglichen. Xiphophorus Fische weisen einen Polymorphismus in Bezug auf Körpergröße, Pubertätszeit und Fortpflanzungstaktik auf. Diese phänotypischen Polymorphismen werden durch den Pubertäts (P) Locus gesteuert. In X. nigrensis und X. multilineatus kodiert der P Locus den Melanocortin-4-Rezeptor (Mc4r) mit hohen genetischen Polymorphismen. Mc4r gehört zu den Melanocortin-Rezeptoren, die zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Das Mc4r-Signalsystem besteht aus Mc4r, dem Agonisten Pomc (Prohormon der verschiedenen MSH und des ACTH), dem Antagonisten Agrp und dem akzessorischen Protein Mrap2. Beim Menschen spielt MC4R eine Rolle bei der Energiehomöostase. MC4R und MRAP2 Mutationen stehen im Zusammenhang mit menschlicher Fettleibigkeit, jedoch nicht mit der Pubertät. Mc4rs in X. nigrensis und X. multilineatus sind in drei Allelklassen vorhanden, A, B1 und B2, von denen die X-chromosomalen A Allele funktionelle Rezeptoren exprimieren und die spezifischen männlichen Y-chromosomalen B Allele für defekte Rezeptoren kodieren. Die männliche Körpergröße korreliert mit dem B Alleltyp und der Kopienzahl des B Allels. Spätreife große Männchen tragen B Allele in hoher Kopienzahl, während frühreife kleine Männchen B Allele in niedriger Kopienzahl oder nur A Allele tragen. Koexpressions-Experimente in Zellkultur zeigten, dass B Allele als dominant negative Mutanten-Rezeptor auf A Allele wirken können. In dieser Studie war das Hauptziel die biochemische Charakterisierung des Mechanismus der Pubertätsregulation durch Mc4r in X. nigrensis und X. multilineatus. Dabei wurde untersucht, ob die Regulation durch eine Mc4r Dimerisierung und/oder Mrap2 Interaktion mit Mc4r oder durch andere Mechanismen erfolgt. Des Weiteren wurde Mc4r in X. hellerii (einer anderen Schwertträger Art) und Medaka (ein phylogenetisch naheliegender Modellorganismus von Xiphophorus) untersucht, um zu verstehen, ob die untersuchten Mechanismen in anderen Arten konserviert sind. In Medaka werden die Gene des Mc4r Signalsystems (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) vor dem Schlüpfen exprimiert, wobei agrp1 während des Schlüpfens und der ersten Fütterung stark hochreguliert wird. Im adulten Medaka werden diese Gene hauptsächlich im Gehirn exprimiert und die Transkripte von mrap2 und mc4r kolokalisieren, was auf eine Funktion bei der Modulation der Mc4r-Signaltransduktion hinweist. Ein funktionaler Vergleich zwischen Wildtyp- und mc4r-Knockout Medaka zeigte, dass der Mc4r-Knockout das Pubertäts-Timing nicht beeinflusst, das Schlüpfen jedoch aufgrund der verzögerten embryonalen Entwicklung von Knockout-Medaka signifikant verzögert. Daher ist das Mc4r System in Medaka eher an der Regulation des Wachstums als an der Pubertät beteiligt. Bei Xiphophorus wurde die Lokalisierung von mc4r und mrap2 in erwachsenen Gehirnen von X. nigrensis und X. hellerii durch in situ Hybridisierung charakterisiert. Bei beiden Spezies zeigen große Männchen eine auffallend hohe Expression von mc4r, während mrap2 bei großen und kleinen Männchen und Weibchen ein ähnliches Expressionsniveau zeigt. Im Gegensatz dazu weist X. hellerii nur Allele vom A-Typ auf, was darauf hinweist, dass sich die Pubertätsregulationsmechanismen in dem Genus Xiphophorus unabhängig voneinander entwickelt haben. Die funktionelle Analyse der Mrap2 und Mc4r A/B1/B2 Allele von X. multilineatus zeigte, dass erhöhte Mrap2-Mengen eine höhere cAMP-Antwort induzieren, die EC50-Werte sich jedoch bei der Mrap2-Coexpression mit Mc4r nicht wesentlich ändern (nur A Allel oder A und B1 Allele). A und B1 Allele wurden in großen männlichen Gehirnen höher exprimiert, während B2 Allele kaum exprimiert wurden. Mc4r A-B1 Zellen haben eine geringere cAMP-Produktion als Mc4r A Zellen. Zusammengenommen deutet dies auf eine Rolle von Mc4r-Allelen, jedoch nicht von Mrap2, bei der Signalgebung zur Regulation des Pubertätsbeginns hin. Interaktionsstudien mit den FRET-Methoden zeigten, dass Mc4r A und B Allele in vitro Heterodimere und Homodimere bilden können, jedoch nur für einen bestimmten Anteil der exprimierten Rezeptoren. Die Einzelmolekül-co-lokalisierungsstudie unter Verwendung von der hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM bestätigte, dass nur wenige Mc4r A und B1 Rezeptoren auf der Membran co-lokalisiert sind. Insgesamt ist die artspezifische Regulation des Pubertätsbeginns bei X. nigrensis und X. multilineatus auf das Vorhandensein von Mc4r B Allelen und teilweise auf deren Interaktion mit Genprodukten des A Allels zurückzuführen. Dies wird dadurch begründet, dass ein bestimmtes cAMP Niveau (statische oder dynamische Schwelle) erreicht werden muss, um die Pubertät einzuleiten. In großen Männchen wird dieses cAMP Niveau später erreicht und so die Pubertät später eingeleitet. Zusammenfassend ist die Regulation des Pubertätsbeginns durch die dominante negative Wirkung von mutierten Mc4r Allelen ein spezieller Mechanismus, der bisher nur bei X. nigrensis und X. multilineatus zu finden ist. Andere Xiphophorus Arten haben offensichtlich durch andere Mechanismen die gleiche Funktion des Signalwegs entwickelt. In anderen Fischen (Medaka) spielt Mc4r eine Rolle bei der Regulation des Wachstums und erinnert an seine Rolle bei der Energie-Homöostase beim Menschen. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, die biochemischen und physiologischen Funktionen des Mc4r-Systems bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, besser zu verstehen.

Das Studium der Entwicklung von Tieren ist eine der ältesten Disziplinen in der Biologie. Die gesammelten Daten von unzähligen Untersuchungen an den verschiedensten Spezies wurden dazu benutzt, um ein generelles Verständnis des tierischen Lebenszykluses zu formulieren. Ein wichtiges Ergebnis der intensiven Untersuchungen war vor etwa einem Jahrhundert die Entdeckung spezifischer morphologischer Veränderungen, die sich während der Teilungsphase, der Zeitperiode die der Befruchtung und Aktivierung des Eies am Anfang der Embryogenese folgt, vollziehen. Diese Befunde führten schlussendlich zur Formulierung des Konzepts einer „Mid-Blastula Transition“ (MBT). Bisher gibt es nur eine Theorie die die Regulierung der MBT in befriedigender Weise erklärt. Dies ist das Model des Kern/Plasma-Verhältnis, welches sich aus dem Verhältnis DNA-Menge zu Zytoplasmavolumen ableitet. Es erklärt die MBT-Aktivierung durch bisher unbekannte, maternal deponierte Faktoren im Ei, welche die MBT Aktivierung kontrollieren, deren Konzentration allerdings mit jeder Zellteilung verdünnt wird, bis sie schließlich ihre blockierende Funktion verloren haben. Zwar wurde die Existenz dieses Mechanismuses schon in zahlreichen Spezies experimentell bewiesen, allerdings bleibt er nur eine ungenaue Beschreibung der ablaufenden Prozesse und lässt weiterhin viele Fragen unbeantwortet. Vor diesem Hintergrund hat diese Arbeit gezeigt, dass die Zellzyklen in Embryonen von Medaka (Oryzias latipes) ihre Synchronität schon nach dem vierten oder fünften Teilung verlieren, und diese durch ein Teilungsmuster ersetzt wird, das als „metasynchron“ bezeichnet wird. In diesem Teilungsmuster verlaufen die Zellteilungen in Wellen, die im Zentrum des Embryos beginnen und sich von dort nach außen hin radial ausbreiten. Noch ist der Sinn einer auf diese Art verlaufenden Zellteilung unbekannt, auch wenn es verschiedene Theorien gibt die versuchen den zugrunde liegenden Mechanismus zu erklären. Allen voran steht die Theorie eines unterschiedlichen Zugangs zu Faktoren innerhalb des Dotters. Allerdings wird diese Theorie durch die Beobachtungen in verformten Embryonen wiederlegt, in denen sich die Teilungswellen von einer Seite des Embryos zur gegenüberliegenden Seite ausgebreitet haben. Somit bleibt der Mechanismus für diese Art der Zellteilung weiterhin unklar. Nicht zu vergessen ist, dass diese deformierten Embryonen eine der möglichen Konsequenzen asymmetrischer Furchung während einer frühen Zellteilung sind. Asymmetrische Teilungen treten in Medaka in einer erheblichen Anzahl von Embryonen auf und haben einen direkten Einfluss auf die gleichmäßige Verteilung des Zytoplasma. Leider war es nicht möglich die Auswirkungen einer solchen ungleichmäßigen Verteilung aufzudecken, auch wenn man davon ausgehen kann, dass ein ausreichend großes Ungleichgewicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten der MBT-Aktivierung in verschiedenen Zellgruppen führen müsste. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits in anderen Spezies gemacht, und es wurde vermutet, dass diese in ungleichmäßigen Zellteilungen begründet lagen. Weiterhin wurde bewiesen, dass die zygotische Transkription schon wesentlich vor dem bisher angenommenen frühesten Zeitpunkt aktiv ist. Darüber hinaus wurden Hinweise gefunden, die darauf hindeuten, dass die Transkription in Embryonen von Medaka in zwei Schritten einsetzt. Der erste Zeitpunkt ist das 16-Zellen-Stadium, in dem die ersten Zellen identifiziert wurden, die Phosphorylierung für RNAPII zeigten, und der zweite das64-Zellen Stadium, in dem der Anteil an p-RNAPII positiven Zellen signifikant anstieg. Ein schrittweiser Anstieg der Transkription wurde bereits in anderen Spezies beobachtet, auch wenn in diesen Fällen nur eine Erhöhung der mRNA-Menge festgestellt wurde, und nicht die unterschiedliche Anzahl an transkriptionell aktiven Zellen untersucht wurde.Zusammenfassend bestätigen und erweitern die hier gezeigten Daten die grundliegenden Kenntnisse über die Prozesse vor und währen der MBT, liefern darüber hinaus aber auch Anzeichen für viele Prozesse vor und während der MBT, die nur wenig oder gar nicht verstanden sind. / The study of animal development is one of the oldest disciplines in the field of biology and the collected data from countless investigations on numerous species have formed a general understanding of the animal life-cycle. Almost one century ago, one consequence of these intense investigations was the discovery of specific morphological changes that occur during the cleavage phase, a period that follows fertilization and egg activation at the very beginning of animal embryogenesis. These observations resulted into the formulation of the concept of a midblastula transition (MBT). So far, the mechanism of the nucleo-cytoplasmic ratio model is the only one that explains MBT regulation in a satisfying way. It suggests that the MBT is controlled by several maternal repressive factors in the egg, which are titrated out by every cell division until they lose their repressing potential. Although this regulatory mechanism was proven for several species and in different approaches, it is still only a rudimentary model for MBT control and leaves numerous questions unanswered. On this conceptual background, this thesis has shown that embryos from the medaka fish (Oryzias latipes) lose their cell cycle synchrony already after the fourth or fifth round of cell divisions, and replace it by a metasynchronous divisions pattern, in which cell division occurs in clear waves beginning in the embryo's center. The reason for this change in division mode is still unknown, although several hypotheses were put forward, most notable a difference in yolk-access between cells. However, this theory was weakened by division waves that progressed from one embryonic pole to the opposing one, which were occasionally observed in deformed embryos, leaving the mechanism for this phenomenon furthermore unclear. Those deformed embryos were most likely the result of asymmetric cell divisions at very early stages, a phenomenon which occurred in a significant percentage of medaka embryos and which directly influenced the equal distribution of cytoplasmic material. It could not beuncovered what kind of effects this unequal distribution of cytoplasm exerted on the progression of embryonic development, but it can be argued that relevant differences in cell volumes could result in cell clusters that will enter MBT at different time points. Comparable observations were already made in other species and it was hypothesized that they were the direct results of early unequal cell cleavages. Finally, it was demonstrated that zygotic transcription in medaka embryos is activated prior to the hitherto assumed time of the first transcriptional initiation. Moreover, indications were found that strongly speak for a transcriptional activation that occurs in two steps; a first step at the 16-cell stage when first cells were identified positive for RNAPII phosphorylation, and a second step at the 64-cell stage, when the number of p-RNAPII positive cells significantly increased. A stepwise activation of zygotic transcription was already observed in other species, but only for the overall increasing amount of mRNAs and irrespective of the actual number of transcriptionally active cells within the embryos. .. Overall, these data confirm and expand the basic knowledge of pre-MBT embryos and about the MBT itself. Furthermore, they also suggest that many early processes in pre-MBT embryos are only rudimentarily understood or still totally unknown.

Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. / Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way.

In cultured medaka testis fragments, cells remained viable for the entire culture period (17h), and spermatids that developed from spermatocytes were viable and motile. Primary cultures were characterized over a period of two days with respect to cell viability and the distribution of adherent and suspended cells. These two cell populations were maintained in dynamic equilibrium in vitro for several days. Proliferating cells were predominant among clusters of suspended cells, as determined by BrdU labeling, and CFSE and propidium iodide PI labeling. Based on cytological criteria, the proliferating cells were mostly spermatogonia and possibly also preleptotene spermatocytes. Differentiation of spermatocytes into spermatids or spermatozoa was also observed, mainly among the suspended cells. These results suggest that the organ and primary culture systems are suitable systems for studying the effects of substances that interfere with spermatogenesis in the medaka, a model vertebrate. The organ and primary culture systems were used to analyze the effects of a synthetic estrogen, EE2, on cell proliferation in medaka testis. Both organ and primary culture were suitable for this purpose consistently small concentrations (0.01 and 1 nM) of EE2 stimulated cell proliferation slightly, while higher concentrations (100 nM) had an inhibitory effect. To investigate the effect of phytoestrogens on cell proliferation in spermatogenesis, selected flavonoids [genistein (1, 10, 100 µg/ml), quercetin (0.01, 1, 100 µM), and 8-prenylnarigenin (0.001, 0.1, 1, 10 µM)] were added to medaka testis primary cultures. Genistein and quercetin inhibited cell proliferation in the cultures while 8-prenylnarigenin had no effect. In a second series of experiments the addition of genistein (10 µg/ml) to primary cultures significantly inhibited both cell proliferation and cell differentiation as determined by flow cytometry using CFSE/PI labeling.