L’analyse protéomique consiste à caractériser l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule, dans un état et à un temps donné (le protéome). L’analyse protéomique tend aujourd’hui à fournir des informations quantitatives, cependant, pour pouvoir générer des données fiables et sensibles, des optimisations méthodologiques doivent être apportées à chaque problématique biologique. L’objectif de cette thèse a été d’adapter les stratégies protéomiques quantitatives existantes à diverses problématiques biologiques. Ce travail de thèse a ainsi contribué à apporter des résultats originaux concernant l’étude de désordres métaboliques. Il a également permis la mise au point d’une méthode de suivi du statut reproducteur de la tortue Luth. Finalement, il a permis d’évaluer la réponse d’une lignée cellulaire hépatique à une intoxication chronique à l’acide valproique. Ces données alimenteront des algorithmes de prédiction de toxicité hépatique chronique au travers du consortium NOTOX (EU). / Proteomics consists in the characterization of all the proteins expressed in a physiological state and at a given time (the proteome). Today, proteomics tends to bring quantitative information. However, in order to generate reliable, sensitive and robust data, whatever the biological question, methodological improvements need to be done. The aim of this PhD thesis was to apply and adapt quantitative proteomics strategies to specific biological issues as there is no universal quantifying method. This PhD thesis contributed to bringing original results concerning the study of metabolic disorders. It has also contributed to setting-up a targeted approach in order to quantify the level of reproductive effort of Leatherback Turtles. Finally, this PhD thesis also contributed, through the consortium NOTOX (EU), to the evaluation of physiological answers of hepatic cell lines exposed to valproic acid. These data will be used in order to generate hepatotoxicity prediction algorithms.

L'extrême complexité des échantillons biologiques, la variabilité technique et la dépendance de la protéomique envers les banques protéiques empêchent l'analyse complète d'un protéome. Ce travail de thèse s'est focalisé sur le développement de méthodes pour la protéomique quantitative et la protéogénomique afin d'améliorer la caractérisation du protéome. Premièrement mon travail s'est centré sur le développement de méthodes quantitatives globales et ciblées. La mise en place de standards pour évaluer les performances de tous les niveaux de la stratégie analytique est aussi décrite. Ces méthodes ont été optimisées pour répondre à diverses questions biologiques. Mon doctorat s'est focalisé aussi autour de la protéogénomique. Une méthode d'analyse N-terminomique à haut débit a été développée et appliquée à l'étude de la mitochondrie humaine. Enfin, ce manuscrit présente une approche multi-omique visant à améliorer l'analyse du protéome avec la création de banques de données personnalisées . / The high intrinsic complexity of biological samples, the technical variability and the dependency of Bottom-up Proteomics to consensus protein sequence databases handicap the comprehensive analysis of an entire Proteome. My doctoral work was focused on method development in quantitative Proteomics and Proteogenomics in order to achieve a better proteome characterization. First, I focused on the development of global and targeted quantitative methods. The introduction and development of standard samples to assess the performances at any level of the analytical workflow is also described. These methods were applied to answer different biological questions. My PhD also focused on Proteogenomic method development. A high throughput N-terminomic analysis approach was developed and applied to the analysis of the human mitochondria. Finally, this manuscript presents a personalized multi-omics profiling strategy to improve the proteome analysis with the use of personalized databases.

No description available.

L’objectif principal de cette thèse était d’identifier et de quantifier les protéines de la matrice organique qui contrôlent le type polymorphique et la morphologie des cristaux présents dans la coquille d’oeuf de poule à différents stades du processus de minéralisation afin de mettre en évidence les composants impliqués dans la calcification à chacun de ces stades. Au total, 64 et 175 protéines différentiellement abondantes durant le processus de minéralisation ont été identifiées dans le milieu de formation (fluide utérin) et la matrice organique. Parmi celles-ci, les fonctions de 24 protéines du fluide utérin et de 77 issues de la coquille sont potentiellement reliées au processus de minéralisation. Nous décrivons plus particulièrement 20 protéines du fait de leur abondance et de leurs fonctions directe ou indirecte sur le processus de calcification. Des études complémentaires sur ces candidats permettront de confirmer leur implication dans la minéralisation de la coquille d’oeuf. / The aim of this PhD was to identify and quantify eggshell organic matrix proteins which control polymorphic type and morphology of crystals at different time points of the eggshell mineralization process in order to highlight particular components involved in calcification at each calcification stage. A total of 64 and 175 proteins differentially abundant during mineralization process were identified in the forming milieu (uterine fluid) and in the eggshell organic matrix respectively. Out of them, 24 uterine fluid and 77 eggshell proteins are functionally related to the mineralization process. We paid particular attention to 20 overabundant proteins with direct or indirect functional evidences related to calcification. Further studies will be necessary to confirm their involvement in the chicken eggshell mineralization.

<p>The identification and quantification of protein-protein interactions in large scale is critical to understanding biological processes at a systems level. Current approaches for the analysis of protein -protein interactions are generally not quantitative and largely limited to certain types of interactions such as binary and strong binding interactions. They also have high false-positive and false-negative rates. Described here is the development of and application of mass spectrometry-based proteomics metehods to detect and quantify the strength of protein-protein and protein-ligand interactions in the context of their interaction networks. Characterization of protein-protein and protein-ligand interactions can directly benefit diseased state analyses and drug discovery efforts. </p><p>The methodologies and protocols developed and applied in this work are all related to the Stability of Unpurified Proteins from Rates of amide H/D Exchange (SUPREX) and Stability of Protein from Rates of Oxidation (SPROX) techniques, which have been previously established for the thermodynamic analysis of protein folding reactions and protein-ligand binding interactions. The work in this thesis is comprised of four parts. Part I involves the development of a Histidine Slow H/D exchange protocol to facility SURPEX-like measurements on the proteomic scale. The Histidine Slow H/D exchange protocol is developed in the context of selected model protein systems and used to investigate the thermodynamic properties of proteins in a yeast cell lysate. </p><p>In Part II an isobaric mass tagging strategy is used in combination with SPROX (i.e., a so-called iTRAQ-SPROX protocol) is used to characterize the altered protein interactions networks associated with lung cancer. This work involved differential thermodynamic analyses on the proteins in two different cell lines, including ADLC-5M2 and ADLC-5M2-C2. </p><p>Parts III and IV of this thesis describe the development and application of a SPROX protocol for proteome-wide thermodynamic analyses that involves the use of Stable Isotope Labeling by Amino acid in cell Culture (SILAC) quantitation. A solution-based SILAC-SPROX protocol is described in Part III and a SILAC-SPROX protocol involving the use of cyanogen bromide and a gel-based fractionation step is described in Part IV. The SILAC-SPROX-Cyanogen bromide (SILAC-SPROX-CnBr) protocol is demonstrated to significantly improve the peptide and protein coverage in proteome-wide SPROX experiments. Both the SILAC-SPROX and SILAC-SPROX-CnBr porotocols were used to characterize the ATP binding properties of yeast proteins. Ultimately, the two protocols enabled 526 yeast proteins to be assayed for binding to AMP-PNP, an ATP mimic. A total of 140 proteins, including 37 known ATP-binding proteins, were found to have ATP binding interactions.</p> / Dissertation

An acetonitrile based protein extraction method was developed that demonstrated high efficient and effective removal of high abundant proteins from both human and murine serum. The protein content of the extract was characterised using gel electrophoresis, the Bradford assay and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with database searching. Selected reaction monitoring (SRM) analysis was used to quantify the levels of high abundant serum proteins to further validate the extraction methodology. The ACN depletion method, in combination with artificial neural networks (ANNs) data mining software, was applied to a murine growth hormone (GH) gene doping study with the aim of identifying biomarker ions capable of detecting gene doping. The LC-MS and ANNs analysis approach failed to conclusively identify a biomarker to gene doping in the mouse model. However, the application of the same technique to serum from a rhGH administration study in humans, returned models capable of discriminating between rhGH treated placebo states. The ion identified as being the most discriminatory was characterised using mass spectrometry, and was derived from the protein leucine-rich a-2-glycoprotein (LRG). Multiple LRG related tryptic peptides were identified as being up-regulated upon dosing with recombinant human GH (rhGH). A high throughput LC-MS/MS and SRM approach was developed to quantify proteins in human serum. The approach was validated by comparison of LC-MS/MS derived APO A1 concentrations with those obtained using established clinical analyser technologies. The LC-MS/MS methodology was applied to a large cohort of 257 serum samples from two rhGH administration studies performed at Royal Free Hospital . The two administrations included serum samples from 15 individuals who had been dosed daily with rhGH. Serum concentrations of the established rhGH biomarker insulin-like growth factor-I (IGF-I) were quantified by LC-MS/MS and compared well with those determined using two different immunoassay-based methodologies. Serum concentrations of the LRG protein were measured simultaneously with IGF-I and appeared to increase in 14 of the 15 rhGH dosed individuals. Combining the LRG and IGF-I data further increased the separation of rhGH treated and placebo states within each individual, and the application of ANNs analysis showed that the combination of the two proteins increased the discrimination characteristics over using IGF-I alone. The murine equivalent of the LRG protein was identified and SRM transitions for a tryptically derived peptide were developed, along with transitions for monitoring a peptide from the murine IGF-I protein. These transitions were used to quantify the two proteins in the remaining aliquots from a murine GH gene doping experiment, however neither protein appeared to increase in the GH +ve plasmid samples that were analysed.

In quantitative proteomics, many of the LC-MS based approaches employ stable isotopic labelling to provide relative quantitation of the proteome in different cell states. In a typical approach, peptides are first detected and identified by tandem MS scans prior to quantifying proteins. This provides the researcher with a large amount of data that are not useful for quantitation. It is desirable to improve the throughput of current approaches to make proteomics a more routine experiment with an enhanced capacity to detect differentially expressed proteins. This thesis reports the developments towards this goal, including an assessment of the viability of stable dimethyl labelling for comparative proteomic measurements and the evaluation of a dynamic algorithm called Parallel Isotopic Tag Screening (PITS) for the detection of isotopically labelled peptides for quantitative proteomics without the use of tandem MS scans.

L’iode est un composant essentiel aux hormones thyroïdiennes. Les cellules thyroïdiennes captent l’iode circulant et le concentrent vers le colloïde. Il est alors incorporé à la thyroglobuline, protéine précurseur des hormones, par un mécanisme d’organification. La capacité de captation de l’iode par la thyroïde est finement régulée notamment par la « Thyroid Stimulating Hormone » (TSH) mais aussi l’iode circulant. En effet, en cas d’une élévation de l’iode circulant, la thyroïde déclenche un mécanisme d’autorégulation appelée l’effet Wolff-Chaikoff. Ce phénomène se traduit par une limitation transitoire de production des hormones thyroïdiennes qui s’accompagne notamment d’une diminution de l’expression du NIS (Natrium Iodide Symporter), la protéine responsable du transport actif de l’iode dans la thyroïde. Dans cette étude, des approches omiques globales ont été mises à profit pour étudier cette régulation dans le contexte de l’administration d’un produit iodé et de souris invalidées pour un gène codant pour un transporteur de monocarboxylate exprimé dans la thyroïde. Dans la première partie, l’effet des agents de contraste iodés (ICA), couramment utilisés en imagerie médicale, a été étudié. L’administration de ces agents entraine une réduction de la captation de l’iode souvent expliquée par un effet Wolff-Chaikoff associé à un potentiel relargage d’iode. Par une approche de protéomique quantitative global, le protéome de thyroïde de souris, après administration d’ICA, a été comparé au protéome en conditions d’excès d’iode. Après un traitement des données et une analyse bioinformatique, nos résultats mettent en évidence l’existence de peu de mécanismes en commun induits par l’iode et les ICA mais cependant de plus importantes variations d’expression de protéines sont déclenchées uniquement par les ICA. Cette étude est en accord avec une durée plus importante de l’inhibition de la fonction après une administration d’ICA comparée à celle de l’iode stable. Dans la deuxième partie, le rôle de SLC5A8 dans la fonction thyroïdienne et les mécanismes sous-jacents à l’effet Wolff-Chaikoff ont été étudiés chez des souris invalidées pour le gène Slc5a8 (Solute carrier family 5 number 8) et des souris non mutées. SLC5A8 est une protéine membranaire identifiée au laboratoire et exprimée dans la membrane apicale du thyrocyte. Cette protéine catalyse un transport de monocarboxylate dans différents organes mais son rôle dans la thyroïde demeure non élucidé. L’invalidation n’entraine pas d’effet majeur sur la fonction thyroïdienne. En mettant à profit une approche multiomique comparative, combinant la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique, les effets de cette invalidation et/ou de la régulation par l’iode de la thyroïde ont été explorés. Le traitement des data révèle de nombreuses voies activées dans les différentes conditions avec des mécanismes de compensation de l’effet de l’invalidation par l’administration d’iode. Les résultats indiquent que la perte de fonction de SLC5A8 affecte l’organification et/ou maturation de la thyroglobuline, le contrôle du stress oxydatif et de l’iode libre dans la thyroïde. / Iodine is an essential component of thyroid hormones. Thyroid cells capture the circulating iodine and concentrate it in the colloid. Then, it is incorporated into the thyroglobulin, the hormone precursor protein, by an organification mechanism. The iodine uptake capacity by the thyroid is finely regulated, not only by the Thyroid Stimulating Hormone (TSH) but also by circulating iodine. Indeed, in case of high circulating iodine, the thyroid actives a self-regulating mechanism called the Wolff-Chaikoff effect. This phenomenon results in a transient limitation of thyroid hormone production which is accompanied by a decrease in the expression of NIS (Natrium Iodide Symporter), the protein that is responsible for the active transport of iodine in the thyroid. In this study, global omics approaches were used to study this regulation in the context of the administration of an iodized product and mice invalidated for a gene coding a monocarboxylate transporter expressed in the thyroid. In the first part, the effect of iodinated contrast media (ICM), commonly used in medical imaging, has been studied. The administration of these agents leads to a reduction in the uptake of iodine often explained by a Wolff-Chaikoff effect associated with an iodine release potential. Through an overall quantitative proteomic approach, the mouse thyroid proteome, after administration of ICM, was compared to the proteome under conditions of excess iodine. In the second part, the role of SLC5A8 in thyroid function and the mechanisms underlying the Wolff-Chaikoff effect were studied in mice invalidated for the Slc5a8 gene (Solute carrier family 5 number 8) and wild type mice. SLC5A8 is a membrane protein identified in the laboratory and expressed in the thyrocyte apical membrane. This protein catalyzes the monocarboxylates transport in different organs but its role in the thyroid remains unsolved. Invalidation does not have a major effect on thyroid function. By using a comparative multiomic approach which combines transcriptomics, proteomics and metabolomics, the effects of this invalidation and / or regulation by iodine in the thyroid have been explored. Data processing reveals many pathways activated under different conditions with mechanisms to compensate for the effect of invalidation by the administration of iodine. The results indicate that the loss of SLC5A8 function affects the organization and / or maturation of thyroglobulin, the control of oxidative stress and of free iodine in the thyroid.

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines / Staphylococcal enterotoxin B is a highly heat-resistant enteric toxin and it is responsible for over 50% of enterotoxin food poisoning. It represents a particular challenge during food processing since, even if the bacteria have been destroyed, the biological activity of the toxin remains unchanged. The objective of this study was to develop and validate a new method based on a novel proteomic strategy to detect and quantify SEB in food matrices. Tryptic peptide map was generated and 3 specific tryptic peptides were selected and used as surrogate peptides from 9 identified proteolytic fragments (sequence coverage of 35%). Peptides were label with light and heavy form of acetic anhydride to create an isobaric tag that will allow quantification. The linearity was tested using mixtures of different molar ratios and the results showed that measurements by LC-MS/MS were within generally accepted criteria for bioassays with slope values near to 1, values of R2 above 0.98 and less than 8% coefficient of variation (%CV). The precision and accuracy of the method were assessed using chicken meat homogenate samples spiked with SEB at 0.2, 1 and 2 pmol/g. The results indicated that the method can provide accuracy within 84.9 – 91.1% range. Overall, the results presented in this thesis show that proteomics-based methods can be effectively used to detect, confirm and quantify SEB in food matrices. Keywords: mass spectrometry; stable isotope labeling; quantitative proteomics; enterotoxins

L'ingénierie métabolique vise à développer des souches très performantes permettant de produire des composés d'intérêts. Pour cela, des modèles de prédiction des flux métaboliques sont développés (GEMs = GEnome-scale Models), intégrant un ensemble de données OMICS. En particulier, l'estimation des quantités exactes d'enzymes est cruciale afin de déterminer les paramètres cinétiques, mais reste difficile à obtenir de manière multiplexe et exacte. Ces travaux de doctorat ont permis de développer une méthode analytique afin de générer des données protéomique quantitative exactes et multiplexes, basée sur l'utilisation de protéines standards couplée à une technique de spectrométrie de masse appellée « Selected Reaction Monitoring ». Cette méthode analytique a été appliquée à une souche référence et deux souches modifiées d'E. coli, optimisées pour produire des quantités élevées de NADPH. Les résultats obtenus démontrent que ce type de données, couplées à des données de flux, permettent de distinguer différents niveaux de régulation, soit au niveau de la quantité d'enzyme, soit de l'activité enzymatique. De plus, la mesure exacte et multiplexe des quantités d'enzyme est une avancée technique majeure dans le développement de modèles prédictifs dynamiques en ingénierie métabolique. / Metabolic engineering aims at designing high performance strains to produce compounds of interest. For this purpose and to predict metabolic fluxes, GEnome-scale Models (GEMs) are developed, integrating multi-OMICS experimental data. Particularly, accurate enzymes amounts are crucial data to determine kinetic parameters but remain difficult to obtain in a multiplexed and accurate fashion. In this Ph.D work we developed a highly accurate and multiplexed workflow for generating quantitative proteomic data, using full length protein labelled standards coupled to a mass spectrometry-based technique called Selected Reaction Monitoring. This workflow was applied to E. coli strains: a wild-type strain and two other strains optimized for higher NADPH production. Results demonstrated that such data combined with measurements of metabolic fluxes, allow apprehending different levels of regulation, namely enzyme abundance and activity. In addition, accurate measurement of enzyme concentration is a key technology for the development of predictive kinetic models in the context of metabolic engineering.