L'identité et la réactivité cellulaires sont établies, maintenues et modulées grâce à l'orchestration de programmes transcriptionnels spécifiques. Les éléments régulateurs, des régions particulières de la chromatine responsables de l'activation ou de la répression des gènes, sont au coeur de cette opération. Ces dernières années, de nombreuses études ont révélé le rôle central des « enhancers » dans ce processus. En effet, des centaines de milliers « enhancers » seraient éparpillés dans le génome humain, majoritairement dans sa portion non-codante, et contrairement au promoteur, leur activation varierait selon le type ou l'état cellulaire ou en réponse à une stimulation physiologique, pathologique ou environnementale. Les « enhancers » sont, en quelque sorte, des carrefours où transitent une multitude de protéines régulées par les signaux intra- et extra-cellulaires et un dialogue s'établit entre ces diverses protéines et la chromatine. L'identification des « enhancers ainsi qu'une compréhension de leur mode de fonctionnement sont donc cruciales, tant au plan fondamental que clinique. La chromatine joue un rôle indéniable dans l'activité des éléments régulateurs, tant par sa composition que par sa structure, en régulant, entre autres, l'accessibilité de l'ADN. En effet, l'ADN des régions régulatrices est bien souvent masqué par un nucléosome occlusif, lequel doit être déplacé ou évincé afin de permettre la liaison des protéines régulatrices, notamment les facteurs de transcription (FTs). Toutefois, la contribution de la composition de la chromatine à ce processus reste incomprise. Le variant d'histone H2A.Z a été identifié comme une composante de la chromatine aux régions accessibles, dont des « enhancers » potentiels. Toutefois son rôle y est inconnu, bien que des études récentes suggèrent qu'il pourrait jouer un rôle important dans la structure de la chromatine à ces régions. Par ailleurs, un lien étroit existe entre H2A.Z et la voie de signalisation des oestrogènes (notamment la 17-[beta]-estradiol (E2)). Ainsi, H2A.Z est essentiel à l'expression de plusieurs gènes cibles de l'E2. Les effets de l'E2 sont en partie exercés par un FT, le récepteur alpha des oestrogènes (ER[alpha]), lequel se lie à l'ADN suite à son activation, et ce majoritairement à des « enhancers », et permet l'établissement d'un programme transcriptionnel spécifique. Cette thèse vise à définir le rôle d'H2A.Z aux « enhancers », et plus particulièrement son influence sur l'organisation des nucléosomes aux « enhancers » liés par ER[alpha]. D'abord, mes travaux effectués à l'échelle du génome ont démontré qu'H2A.Z n'est présent qu'à certains ER[alpha]-« enhancers » actifs. Cette particularité a fait en sorte que nous avons pu comparer directement les « enhancers » actifs occupés par H2A.Z à ceux non-occupés, afin de mettre en évidence sa relation à l'environnement chromatinien. Étonnamment, il est apparu qu'H2A.Z n'introduit pas une organisation unique ou particulière des nucléosomes aux « enhancers ». Par ailleurs, nos résultats montrent qu'H2A.Z joue un rôle crucial dans la régulation de l'activité des « enhancers ». En effet, nous avons observé que suite à leur activation par l'E2, les « enhancers » occupés par H2A.Z recrutent l'ARN polymérase II (ARNPII) et produisent un transcrit. Ils recrutent également RAD21, une composante du complexe cohésine impliqué, entre autres, dans des interactions chromosomiques entre « enhancers » et promoteurs. De façon intéressante, nous avons mis en évidence que ces trois évènements, connus pour leur importance dans l'activité des « enhancers », sont dépendants d'H2A.Z. Ainsi, la présence d'H2A.Z à l' « enhancer » pourrait permettre un environnement chromatinien favorable à trois aspects clés de l'activité des « enhancers » : la présence de l'ARNPII, la transcription et la formation d'une boucle d'interaction, et par la suite, de par la proximité « enhancer »-promoteur ainsi créée, augmenter la concentration d'ARNPII à proximité du promoteur favorisant l'expression du gène cible. Un tel rôle central d'H2A.Z dans l'activité d' « enhancers » spécifiques pourrait participer à un mécanisme épigénétique ciblé de la régulation de l'expression des gènes.

Les œstrogènes, et en particulier l’œstradiol E2, régulent un nombre considérable de fonctions physiologiques au sein de l’organisme et permettent notamment l’établissement et le maintien des fonctions reproductives chez tous les vertébrés. L’E2 agit localement dans de multiples organes cibles via l’intermédiaire de ses récepteurs : ERα et ERβ. Par son action proliférative contribuant au renouvellement de l’épithélium mammaire, l’E2 ainsi que son récepteur ERα ont été associés au développement pathologique de tumeurs mammaires. Celles-ci sont qualifiées d’hormono-dépendantes car elles répondent pour la majorité d’entre elles à l’utilisation de l’hormonothérapie visant à bloquer leur croissance. Malheureusement, on estime que 30 à 40% des tumeurs mammaires finissent par présenter une résistance aux traitements anti-oestrogéniques, par des mécanismes extrêmement complexes. Les travaux présentés dans ce manuscrit ont pour objectifs de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le phénomène d’échappement des cellules tumorales mammaires au contrôle hormonal. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés à deux facteurs capables de moduler l’activité d’ERα : l’hypoxie, qui désigne l’appauvrissement en oxygène du microenvironnement cellulaire, et la voie RhoA/MKL1 fréquemment mise en place au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse. L’hypoxie est une caractéristique majeure des tumeurs solides, et des études lui suggèrent un rôle dans l’apparition de résistance endocrine. Nous montrons que le stress hypoxique inhibe fortement l’expression d’ERα, principalement au niveau protéique, et qu’il abolit la prolifération et la survie cellulaire induites par l’E2. L’analyse transcriptomique démontre qu’un certain nombre de gènes cibles d’ERα sont également régulés par l’hypoxie, qui peut soit réprimer (CXCL12…) ou bien augmenter leur expression (AREG…). Par ailleurs, l’analyse du cistrome d’ERα démontre une perte massive du nombre d’ERBSs (Estrogen Receptor Binding Site) par l’hypoxie, mais également une apparition d’ERBSs hypoxie-spécifiques. Nos résultats suggèrent que le fort recouvrement de régulation entre ERα et l’hypoxie puisse moduler l’efficacité des thérapies antihormonales. Enfin, l’équipe a démontré que l’activation de la voie RhoA/MKL1 provoque une forte inhibition de la fonction AF1 d’ERα. Afin de mieux appréhender les effets de cette voie de signalisation sur l’activité d’ERα, une lignée cellulaire MCF7 exprimant stablement un mutant constitutivement actif du facteur MKL1 a été générée. Nous montrons que son expression modifie profondément le contexte cellulaire en provoquant le basculement d’un phénotype luminal vers un phénotype basal-like. L’analyse transcriptomique de la réponse à l’E2 montre que le changement d’orientation cellulaire induit par MKL1 abolit toute régulation transcriptionnelle des gènes cibles d’ERα. Ce changement d’orientation cellulaire s’accompagne d’une reprogrammation massive du cistrome d’ERα avec une perte importante de ses sites de fixation à la chromatine, mais également de façon inattendue, un enrichissement en nouveaux ERBSs. Enfin, nous montrons une forte augmentation des interactions « non-génomiques » d’ERα avec des partenaires cytoplasmiques tels que PI3K, MSK1 et Src. Ces données suggèrent que dans des cellules agressives de type mésenchymal exprimant ERα, l’activité du récepteur repose majoritairement sur son action « non-génomique ». De façon intéressante, l’utilisation de l’anti-œstrogène pur ICI 182 780 n’a aucun effet inhibiteur sur ces interactions, pour lesquelles un rôle fonctionnel reste à établir. / Estrogens, and in particular estradiol E2, regulate a considerable number of physiological functions in the body and allow the establishment and maintenance of reproductive functions in all vertebrates. E2 acts locally in multiple target organs via its receptors: ERα and ERβ. By its proliferative action contributing to the renewal of the mammary epithelium, E2 as well as its ERα receptor have been associated with the pathological development of mammary tumors. These are qualified as hormone-dependent because they, for the majority of them, respond to the use of hormone therapy to block their growth. Unfortunately, it is estimated that 30-40% of mammary tumors end up with resistance to anti-estrogen treatments, through extremely complex mechanisms. The work presented in this manuscript aims to better understand the molecular and cellular mechanisms involved in the escape of mammary tumor cells to hormonal control. In this thesis, we looked at two factors that can modulate the ERα activity: hypoxia, which refers to oxygen depletion in the cellular microenvironment, and the RhoA/MKL1 pathway that is frequently activated during the epithelial-mesenchymal transition. Hypoxia is a major feature of solid tumors, and studies suggest a role in the development of endocrine resistance in breast cancer. We show that hypoxic stress strongly inhibits the expression of ERα, mainly at the protein level, and that it abolishes E2-induced cell proliferation and survival. Transcriptomic analysis shows that a certain number of ERα target genes are also regulated by hypoxia, which can either repress (CXCL12) or increase their expression (AREG ...). Moreover, the analysis of the ERα cistrome demonstrates a massive loss of the number of ERBSs (Estrogen Receptor Binding Site) by hypoxia, but also an appearance of hypoxia-specific ERBSs. Our results suggest that the strong regulatory overlap between ERα and hypoxia may modulate the efficacy of anti-hormonal therapies. Finally, the team demonstrated that the activation of the RhoA/MKL1 pathway causes a strong inhibition of the ERα AF1 function. In order to better understand the effects of this signaling pathway on ERα activity, an MCF7 cell line stably expressing a constitutively active mutant of the MKL1 factor was generated. We show that its expression profoundly modifies the cellular context by causing the switch from a luminal phenotype to a basal-like phenotype. The transcriptomic analysis of the E2 response shows that the MKL1 induced change in cell fate abolishes any transcriptional regulation of ERα target genes. This change in cellular orientation is accompanied by massive reprogramming of the ERα cistrome with a significant loss of its chromatin binding sites, but also unexpectedly, an enrichment of new ERBSs. Finally, we show a strong increase of "non-genomic" ERα interactions with cytoplasmic partners such as PI3K, MSK1 and Src. These data suggest that in aggressive mesenchymal cells expressing ERα, the receptor activity is mainly based on its "non-genomic" action. Interestingly, the use of pure anti-estrogen ICI 182 780 has no inhibitory effect on these interactions, for which a functional role remains to be established.