La vaccination est un moyen de prévention très efficace contre les infections. La majorité des vaccins sont administrés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire avec des adjuvants et stimulent ainsi des réponses immunitaires adaptatives systémiques. Les muqueuses représentent une porte d’entrée majeure pour de nombreux pathogènes ayant un impact en Santé Publique. Cependant, peu de vaccins sont délivrés par les muqueuses en raison du manque d’adjuvants adaptés à ces voies. Ainsi le développement d'adjuvants muqueux permettrait la stimulation de réponses immunitaires locales et une protection efficace avant la dissémination des pathogènes. Les agonistes des Toll-Like-Receptors (TLR) sont développés comme adjuvants vaccinaux car ils stimulent l’immunité innée et adaptative. Au laboratoire, la flagelline de Salmonella enterica qui est un puissant agoniste de TLR5 est utilisée comme modèle afin de disséquer les mécanismes d’action des adjuvants muqueux. En effet, l'administration intranasale de vaccins adjuvantés par la flagelline se caractérise par une réponse T CD4+ de type Th1/Th2, une réponse en anticorps sécrétoires dans le compartiment respiratoire et une réponse systémique contre les antigènes vaccinaux. Seule l’activation de TLR5 dans le compartiment épithélial est nécessaire à l’activité adjuvante.Dans un premier temps, l'analyse transcriptionnelle du tissu pulmonaire a permis d'identifier une signature épithéliale spécifique du recrutement de cellules immunitaires, en particulier de monocytes et de neutrophiles ainsi que de l'activation fonctionnelle des cellules dendritiques. L'analyse de la dynamique cellulaire au niveau du tractus respiratoire et des ganglions drainants a ensuite été réalisée en réponse à l’administration intranasale de vaccin adjuvanté. Bien que les monocytes inflammatoires et les neutrophiles infiltrent massivement les poumons et capturent les antigènes, ils ne jouent pas de rôle majeur dans l’activation de la réponse immunitaire. Au contraire les cellules dendritiques conventionnelles CD11b+ capturent, migrent et présentent efficacement l’antigène aux lymphocytes T CD4+. A l'instar de l’effet adjuvant, l’activation de ces cellules dendritiques par la flagelline n'est pas directe mais requiert une expression de TLR5 dans les cellules structurales incluant les cellules épithéliales de la muqueuse. De plus, nos travaux suggèrent que les interleukines de la famille IL-1 ne sont pas à l'origine de la transactivation des cellules dendritiques.En conclusion, ce travail de thèse ouvre des perspectives intéressantes quant au développement d’adjuvants muqueux. / Many pathogens of public health concern (including the influenza and respiratory syncytial viruses, and bacteria such as Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) enter the body via the respiratory tract in general and the lung mucosa in particular. Mucosal vaccines induce a local adaptive immune response (i.e. secretory antibodies and specific T cells) and constitute a unique means of directly preventing these infections. Most vaccines are delivered systemically and use systemic adjuvants. Although the few commercially available mucosal vaccines are generally effective, mucosal adjuvant candidates have not demonstrated sufficient levels of potency and safety. TLR signaling is instrumental for the induction of innate immunity and the concomitant ignition of adaptive immune responses. Thus TLR agonists are largely used as vaccine adjuvants. In the lab we use flagellin from Salmonella enterica (a potent TLR5 agonist) as a model to better understand the mode of action of mucosal adjuvants. The intranasal adjuvant effect of flagellin is characterized by an antigen-specific Th1/Th2 cell response, and a strong mucosal and systemic antibody response. However this adaptive immune response mainly depends on TLR5-mediated epithelial signaling.We used molecular profiling to show that cytokine/chemokine and dendritic cell maturation pathways are surrogate signatures for flagellin activation in the lung. Neutrophils and inflammatory monocytes were massively recruited to the lungs but were not essential for the adjuvant activity. In contrast, flagellin signaling did not induce a significant recruitment of conventional dendritic cells but enhanced their maturation and migration to the lymph nodes. In particular, CD11b+ migratory dendritic cells were essential for induction of a CD4+ T-cell response. Importantly, the functional activation of dendritic cells was independent of direct signaling via TLR5, suggesting the role of inflammatory cytokines produced by the activated epithelium. However or data suggest that IL-1 and IL-36 interleukins are not responsible for transactivation of dendritic cell. In conclusion, this thesis project opens up new perspectives for the development of mucosal adjuvants.

Les éosinophiles sont des cellules à fonctionnalités multiples, impliquées dans de nombreux processus effecteurs et inflammatoires. Ils expriment à leur surface de nombreux récepteurs participant à l'immunité adaptative, mais aussi à l'immunité innée et libèrent, après activation, différents médiateurs, dont des protéines hautement cytotoxiques et des cytokines. Leur fonction exacte dans la réponse immunitaire innée reste encore inconnue. Outre leur présence au cours de certains processus granulomateux retrouvés lors de la schistosomiase ou dans la maladie de Crohn, une accumulation d'éosinophiles a été observée au sein de granulomes pulmonaires dans différents modèles d'infections mycobactériennes.<br />L'objectif de notre travail a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans les interactions entre les éosinophiles humains et Mycobacterium bovis BCG, choisi comme modèle de mycobactéries.<br />Après avoir démontré l'activité chimiotactique du BCG vis-à-vis des éosinophiles nous avons ensuite montré que les éosinophiles pouvaient, après activation en présence de BCG, produire des espèces réactives de l'oxygène et libérer la peroxydase de l'éosinophile par dégranulation. La mise en évidence de l'expression membranaire des récepteurs Toll-like (TLR) 2 et 4 sur les éosinophiles nous a permis de démontrer l'implication majoritaire de TLR2 dans l'interaction éosinophiles/BCG ainsi que l'activation des voies MAP kinases et de la voie NF-κB. Enfin, nous démontrons que les éosinophiles sont capables d'exercer une fonction cytotoxique vis-à-vis du BCG, mécanisme faisant intervenir à la fois des défensines et la protéine cationique de l'éosinophile (ECP).<br />Dans la continuité de la démonstration de l'expression par les éosinophiles de molécules partagées avec les lymphocytes T, nous nous sommes intéressés à d'autres molécules pouvant être impliquées dans les interactions éosinophiles/BCG, et plus particulièrement celles participant à l'immunité innée. C'est ainsi que, grâce à différentes approches de cytométrie en flux, de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons mis en évidence l'expression du complexe CD3/TCRγδ à la surface d'une sous-population d'éosinophiles, puis nous avons montré la fonctionnalité de ce récepteur, après activation par des anticorps monoclonaux spécifiques ou des ligands physiologiques. Enfin, nous avons démontré, en utilisant des anticorps neutralisants ou un inhibiteur spécifique que CD3/TCRγδ participe à l'activation des éosinophiles induite par le BCG.<br />Ce travail représente la première étude extensive des mécanismes intervenant dans les interactions entre éosinophiles humains et M. bovis BCG. Il ouvre des perspectives nouvelles quant à la fonction des éosinophiles dans l'immunité innée, impliquant de manière originale deux récepteurs différents : TLR2 et CD3/TCRγδ. Nos résultats suggèrent également que les éosinophiles expriment des molécules de la famille des défensines, qui vient s'ajouter à leur arsenal cytotoxique et qui agirait en synergie avec l'ECP. En conclusion, ces résultats suggèrent que les éosinophiles puissent reconnaître directement des signaux de danger, incluant les mycobactéries, et, comme les lymphocytes Tγδ, représenter un nouveau lien entre immunité innée et immunité adaptative.

Les récepteurs de type Toll (TLR) sont des récepteurs cellulaires jouant un rôle pivot dans le déclenchement de la réponse immunitaire après une infection ou une blessure, c'est-à-dire une inflammation. L'activation de la signalisation TLR a été associée à l’épilepsie. Dans ce projet, j'utilisai trois modèles distincts pour étudier comment le déclenchement des TLR contribue à l'épileptogenèse. Il existe une corrélation entre les malformations corticales développementales telle la dysplasie corticale focale (FCD) et convulsions fébriles dans les enfants de bas âge. Récemment, une réponse neuro-inflammatoire fut identifiée dans les lésions FCD. Nous postulâmes que l'inflammation induite par le FCD peut augmenter la sensibilité aux crises (chapitre 2). Nous modélisâmes FCD en induisant une congélation-lésion corticale chez le rat néonatal. La lésion corticale déclencha des effecteurs en aval de TLR4, spécifiquement le précurseur de la cytokine Caspase-1, dans l'hippocampe ipsilatéral à la lésion. Les rats lésés développèrent des crises fébriles expérimentales nettement plus rapidement que les rats témoins. Le blocage de l'activité de la Caspase-1 prolongea significativement la latence des crises chez les rats lésés. Nos résultats impliquent l'inflammation médiée par la Caspase-1 en tant que déclencheur des crises fébriles chez les enfants avec FCD préexistante. Des études antérieures déterminèrent que l'activation systémique de la cascade TLR4 abaisse le seuil de crise. Nous étudiâmes si la pénétration des cellules immunitaires périphériques dans le cerveau pendant la stimulation TLR4 favorise l'activité ictal en stimulant la voie TLR4 dans les leucocytes prélevés sur la rate de rat (splénocytes). Ensuite, nous co-cultivâmes des splénocytes avec des coupes organotypiques dérivées du cerveau in vitro (chapitre 3). L'ajout de splénocytes stimulés par TLR4 donna lieu à une neuro-inflammation et à une excitation neuronale accrue. L’ajout de splénocytes non-stimulés n’eut aucun effet pro-inflammatoire ou pro-excitateur dans les coupes organotypiques. De plus, l'inhibition de la Caspase-1 dans des coupes organotypiques co-cultivées avec des splénocytes stimulés diminua la neuro-inflammation et l'hyperexcitabilité neuronale. Nos résultats suggèrent que l'infiltration de leucocytes activés par TLR4 dans le cerveau augmente la prédisposition aux crises via les mécanismes médiés par la Caspase-1. Précédemment, des rapports montrèrent que l'activation de la signalisation TLR3 facilite l'évolution des crises. L'introduction d'un agoniste synthétique TLR3 chez la souris in vivo et des coupes organotypiques hippocampiques in vitro produisirent des mécanismes anti-inflammatoires dépendants de la dose et du temps (chapitre 4). La stimulation TLR3 supprimait les crises d'hippocampe in vivo et réduisait l'excitabilité synaptique dans le réseau hippocampique à la fois in vivo et in vitro. Nous avons déterminé que les effets anticonvulsivants médiés par TLR3 étaient principalement provoqués par les cascades en aval IRF3 / IFN-β. Ainsi, nos données suggèrent que l'activation de TLR3 peut protéger le cerveau contre les crises par la production d'IFN-β. Nos résultats donnent un aperçu des nouveaux mécanismes cellulaires sous-jacents à la modulation inflammatoire de l'excitabilité neurale. Notre découverte des rôles de la Caspase-1 et de l'IFN-β dans l'influence du seuil de crise améliorera notre compréhension des fondements moléculaires de la génération de crises ce qui pourraient améliorer le traitement de l'épilepsie. / Toll-like receptors (TLRs) are cellular receptors that play a pivotal role in initiating immune response following infection or injury, i.e. inflammation. Nevertheless, activation of TLR signaling has been associated with seizure manifestation. In this research, I employed three distinct models to study how triggering TLRs contributes to ictogenesis. There is a correlation between developmental cortical malformations, e.g. focal cortical dysplasia (FCD), and fever-provoked, i.e. febrile, seizures in young children. Recently, neuroinflammation was reported in FCD lesions. Therefore, we posited that FCD-induced inflammation may increase seizure susceptibility (Chapter 2). To recapitulate FCD pathology, we induced a cortical freeze-lesion in neonatal rats. Lesioning the cortex triggered TLR4 downstream effectors, specifically the cytokine precursor Caspase-1, in the hippocampus ipsilateral to the lesion. Further, lesioned rats developed experimental febrile seizures markedly faster than sham control rats. Strikingly, blocking Caspase-1 activity prior to seizure induction significantly prolonged seizure latency in lesioned rats. Our results implicate Caspase-1-mediated inflammation as a main driver of febrile seizures in children with pre-existing brain malformations. In addition, previous reports determined that systemic activation of TLR4 cascade lowers seizure threshold. Hence, we developed an in vitro model to investigate whether penetration of peripheral immune cells into the brain during TLR4 stimulation promotes ictogenic activity (Chapter 3). First, we stimulated TLR4 pathway in leukocytes harvested from rat spleen, i.e. splenocytes. Thereafter, we co-cultured splenocytes with brain-derived organotypic slices in vitro. Adding TLR4-stimulated splenocytes gave rise to neuroinflammation and enhanced neuronal excitation, whereas adding unstimulated splenocytes failed to evoke pro-inflammatory or proexcitatory effects in organotypic slices. Moreover, Caspase-1 inhibition in organotypic slices cocultured with stimulated splenocytes diminished neuroinflammation and neuronal hyperexcitability. Our findings suggest that infiltration of TLR4-activated leukocytes into the brain elevate seizure predisposition via Caspase-1-mediated mechanisms. Beside TLR4 pathway, it was previously shown that activation of TLR3 signaling facilitates seizure evolution. In chapter 4, introducing a synthetic TLR3 agonist to mice in vivo and to hippocampal organotypic slices in vitro yielded anti-inflammatory mechanisms in a dose- and time-dependent manner. Also, we found that TLR3 stimulation suppressed hippocampal seizures in vivo and reduced synaptic excitability in the hippocampal network both in vivo and in vitro. Finally, we determined that TLR3-mediated anticonvulsive effects were chiefly driven by IRF3/IFN-β downstream cascades. Thus, our data suggests that TLR3 activation may protect the brain from seizures through production of IFN-β. Altogether, our findings provide insight into novel cellular mechanisms underlying inflammatory modulation of neural excitability. Furthermore, our discovery of the roles of Caspase-1 and IFN-β in influencing seizure threshold will improve our understanding of the molecular underpinnings of seizure generation, which may ultimately have therapeutic benefits for epilepsy treatment.