La production porcine utilisant des antibiotiques, il est primordial d'évaluer son impact sur la présence d'entérobactéries résistantes aux antibiotiques. L'objectif du projet était d'évaluer l'impact d'un traitement de chlortétracycline administré à des porcs trois semaines après le sevrage sur l'abondance des entérobactéries résistantes aux antibiotiques et sur leur contenu en gènes de résistance. Pour y répondre, 600 porcelets ont été séparés en deux groupes à l'entrée en pouponnière. Un groupe a reçu une alimentation supplémentée en chlortétracycline (660 mg/kg d'aliment) pendant 21 jours, alors que l'autre groupe a reçu une alimentation sans antibiotiques. Des échantillons de fèces et des frottis du groin ont été récoltés 16, 38, 45, 98 et 143 jours après le sevrage. Les entérobactéries totales ainsi que celles résistantes à la tétracycline, au cotrimoxazole ainsi qu'au céfotaxime ont été dénombrées. Un sous-ensemble d'entérobactéries a été isolé et testé pour sa susceptibilité à 24 antibiotiques. Le génome bactérien de certains isolats a été séquencé. L'abondance des entérobactéries totales ainsi que celles résistantes au cotrimoxazole étaient plus élevée 16 jours après le sevrage (P < 0,05). Les entérobactéries résistantes au céfotaxime étaient plus abondantes chez tous les porcs en engraissement (jours 98 et 143; P < 0,05). Le profil de résistance des isolats était différent selon le milieu de sélection et le type d'échantillon. Le contenu en gènes de résistance était similaire entre les deux groupes. Les gènes tetA et tetB étaient les déterminants de la résistance à la tétracycline les plus prévalent et ont été identifiés sur des plasmides à proximité d'autres gènes de résistance. L'administration de chlortétracycline en pouponnière n'a pas eu d'impact significatif, sauf pour l'abondance des entérobactéries fécales résistantes au céfotaxime en période de finition. Il est tout de même primordial d'utiliser tous les antibiotiques judicieusement en raison du potentiel de co-sélection de résistances. / Since swine industry uses antibiotics, it is primary to assess the impact of this use on the presence of antibiotic-resistant enterobacteria. The aim of this study was to evaluate the impact of a chlortetracycline treatment given to pigs three weeks after weaning on the abundance of enterobacteria and their antibiotic resistance genes content. To achieve this goal, 600 weaners were split into two groups when arriving in nursery. One group was fed, for 21 days, a diet supplemented with chlortetracycline (660 mg/kg of feed), while the other group received an antibiotic-free diet. Samples of feces and swabs of snouts were collected 16, 38, 45, 98 and 143 days after weaning. Total enterobacteria as well as tetracycline-, co-trimoxazole- and cefotaxime-resistant enterobacteria from samples were counted. A subset of enterobacteria was isolated and tested for its susceptibility to 24 antibiotics. Some of those enterobacteria isolates were whole-genome sequenced. Abundance of total enterobacteria as well as co-trimoxazole-resistant enterobacteria was higher 16 days after weaning (P < 0.05). Cefotaxime-resistant enterobacteria were more abundant for all pigs in fattening (days 98 and 143; P < 0.05). Antibiotic resistance profiles of the isolates were different according to the selection medium used and the sample type. The content of antibiotic resistance genes was similar between both groups. tetA and tetB genes were the most prevalent determinants for tetracycline resistance and were identified on plasmids near other antibiotic resistance genes. The administration of in-feed chlortetracycline in nursery pigs did not have a significant impact, except for the abundance of fecal cefotaxime-resistant enterobacteria found in finishing phase. It is still primary to use all antibiotics wisely since there are risks for co-selection of resistance.

Étant donné l'émergence de résistance aux molécules antifongiques chez les mycètes pathogènes, un problème qui ne cesse de prendre de l'ampleur, la désaminase de cytosine Fcy1, codée par le gène *FCY1 chez Saccharomyces cerevisiae* et avec laquelle le médicament flucytosine interagit, est à l'étude dans ce projet. Pour mieux comprendre les bases moléculaires de la résistance aux antifongiques en lien avec Fcy1, le principal objectif de ce projet est de caractériser structurellement et fonctionnellement cette désaminase de cytosine de type sauvage et certains mutants de celle-ci. Des orthologues de type sauvage ainsi qu'un mutant de cette protéine, retrouvés chez plusieurs mycètes pathogènes, sont aussi à l'étude dans ce projet de recherche. Tout d'abord, les structures de Fcy1 et ses orthologues chez *Aspergillus niger*, *Candida albicans*, *Candida glabrata* et *Cryptococcus neoformans* ont été résolues. Certaines de ces structures ont permis d'observer les enzymes dans des conformations ouvertes, permettant l'entrée du substrat au site actif. En effet, certaines structures permettent l'observation du segment en C-terminal de ces protéines qui se replie et se place de façon à médier l'entrée au site actif de celles-ci. La structure d'un mutant inactif de Fcy1 a aussi été résolue, montrant comment le remplacement d'un résidu méthionine par un résidu tryptophane force l'enzyme à rester dans une conformation ouverte, cessant ainsi l'activité de celle-ci. De plus, des collègues du laboratoire Landry, qui ont étudié l'expression et l'activité de Fcy1 et de plusieurs mutants, *in-vivo* chez *S. cerevisiae*, ont rapporté que la coexpression de mutants inactifs de cette enzyme menait à la restauration de l'activité enzymatique. Une hypothèse suggérant la formation d'hétérodimères de mutants inactifs de Fcy1, qui rétablissent l'activité de la protéine une fois assemblés, a été mise à l'épreuve par la résolution de la structure d'un de ces hétérodimères constitué de mutants différents de Fcy1. Des mesures d'activité catalytique des protéines à l'étude ont aussi été faites, avec la cytosine et la 5-Fluorocytosine comme substrats, pour mesurer les paramètres de cinétique enzymatique de celles-ci. Aussi, des mesures de température de fusion (T$_\textup{m}$) ont été prises pour les protéines afin d'évaluer leur stabilité. Éventuellement, ce projet permettra de mieux comprendre comment la résistance à la 5-Fluorocytosine se présente lorsque Fcy1, ou un de ses orthologues est impliqué dans ce phénomène via des mutations. Ainsi, ce projet pavera la voie pour davantage de recherches qui visent à mieux comprendre cette problématique chez des pathogènes fongiques émergents, qui possèdent un orthologue de Fcy1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / La résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes représente un obstacle majeur dans notre bataille contre les maladies infectieuses. La cause principale est la production par les bactéries de β-lactamases, des enzymes capables de cliver les antibiotiques à noyau β-lactame. TEM-1 est la β-lactamase la plus fréquemment en cause et elle est la source prédominante de résistance aux pénicillines et céphalosporines. Bien que cette protéine soit très étudiée, certaines subtilités de son mécanisme d’action demeurent incomprises. Cette thèse présente les résultats obtenus de sa caractérisation par RMN. Nous avons effectué l’attribution des déplacements chimiques des résonances des atomes de cette protéine qui compte 263 résidus (28,9 kDa). Comme l’analyse de la dynamique interne des enzymes est essentielle à la compréhension des processus impliqués dans leurs mécanismes d’action, nous avons étudié les propriétés dynamiques de TEM-1. Les données expérimentales enregistrées (R1, R2 et NOE {¹H}-15N) nous ont permis de calculer les paramètres caractérisant les mouvements internes de la protéine. Nos résultats mettent en évidence l’extrême rigidité de TEM-1 sur l’échelle de temps des picosecondes-nanosecondes. Par ailleurs, nous avons observé la présence de mouvements lents (μs-ms) affectant la relaxation de résidus présents dans la boucle Ω ainsi que dans le site actif. La détermination de la structure de TEM-1 en solution nous a fourni d’autres indices de la présence de ces mouvements qui sont probablement impliqués dans la catalyse. Comme il a été proposé que la Tyr105 ait un rôle à jouer dans la reconnaissance et la fixation des substrats chez TEM-1, nous avons étudié les effets de différentes mutations de ce résidu par RMN. Nos résultats indiquent que l’environnement ainsi que les mouvements de plusieurs autres résidus ont été altérés suite à ces mutations. Comme certains de ces résidus sont éloignés du site actif, nous croyons que des mouvements concertés entre les résidus situés à proximité et ceux éloignés du site actif puissent jouer un rôle important pour la fonction de TEM-1. Ces travaux apportent de toutes nouvelles données sur TEM-1 et possiblement sur les autres β-lactamases de classe A, contribuant ainsi significativement à l’amélioration des connaissances dans le domaine de la résistance aux antibiotiques. / Antibiotic resistance in pathogenic bacteria represents a major obstruction in our struggle against infectious diseases. The main cause of this resistance is the production by bacteria of enzymes called β-lactamases which possess the ability to hydrolyse the amide bond of β lactam antibiotics. TEM-1 β-lactamase is the most frequently implicated and is the major source of resistance to penicillins and cephalosporins. Although being extensively studied, subtleties in the mechanism of action of this protein remain misunderstood. This thesis presents the results obtained from TEM-1 characterisation by NMR. We carried out resonance assignment for this 263 residues protein (28.9 kDa). As the analysis of internal dynamics of enzymes is essential for the understanding of processes implicated in their mechanism of action, we studied the dynamic properties of TEM-1. Experimental data (R1, R2, and {¹H}-15N-NOE) allowed us to characterize internal motions. Our results highlight the extreme rigidity of TEM-1 on the picosecond to nanosecond timescale. In addition, we observed the presence of slow motions (μs-ms) affecting the relaxation of residues located in the Ω-loop and in the vicinity of the active site. Elucidation of TEM-1’s 3-D structure in solution provided us with additional evidences of the presence of these movements which may be involved in catalysis. As it was proposed that Tyr105 could play a role in substrate recognition and binding in TEM-1, we studied the effects of several mutations at this position. Our results indicate that the environment as well as motions of several other residues were affected by these changes. As some of these residues are far from the active site, we believe that concerted motions between residues located in the vicinity and those further from the active site can play an important functional role in TEM-1. This work brings new data on TEM-1 and possibly on other class A β-lactamases, thus contributing significantly to the improvement of knowledge in the domain of antibiotic resistance.

Le projet de maîtrise consistait à développer une base de données (BD) sur la résistance bactérienne aux antibiotiques et de l’utiliser dans les analyses bio-informatiques de deux projets de génomiques. La BD MERGEM (« Mobile Elements and Resistance Genes Enhanced for Metagenomics ») mettait l’emphase sur la bonne nomenclature des gènes et la fiabilité de l’annotation de leurs séquences, qui s’avère un réel problème dans les BD publiques en biologie. La BD MERGEM mit aussi de l’avant l’utilisation de technologies du Web sémantique et de développementWeb pour enrichir et publier son contenu. De plus, un pipeline bio-informatique d’annotations fonctionnelles fut réalisé dans le but de correctement identifier les éléments de MERGEM et leur contexte génomique dans deux projets de séquençages importants : 264 métagénomes du microbiote intestinale et 390 génomes de Pseudomonas aeruginosa. Les résultats démontrent l’utilité de développer des BD spécialisées en génomique. / The current Master’s project consist of the development of a database (DB) on bacterial antibiotic resistance and its use in bioinformatic analyses for two major genomic projects. The DB is called MERGEM (Mobile Elements and Resistance Genes Enhanced for Metagenomics) and puts a particular emphasis on a good genes nomenclature and the reliability of the annotation of their sequences, which is a real problem in biological public databases. The MERGEM database also adopts technologies of the SemanticWeb and utilizesWeb development to enrich and publish its content. Furthermore, a bioinformatic annotation pipeline was developed in order to correctly identify MERGEMs’ genes and their contexts in two important sequencing projects : one with 264 metagenomes from the human gut microbiome and another one consisting of 390 Pseudomonas aeruginosa genomes. The results of this project proves the usefulness of specialized databases in genomic studies.

En considérant la problématique grandissante des résistances bactériennes, cette étude avait pour but d’évaluer l’utilisation des antibiotiques et des tests diagnostiques microbiens en thérapie parodontale afin de vérifier si les pratiques cliniques actuelles des parodontistes canadiens concordent avec la littérature disponible. La collecte de données a été effectuée par l’entremise d'un questionnaire électronique acheminé par courriel et rempli de façon anonyme. Parmi les 322 parodontistes contactés, 64 ont participé à cette étude. Un taux de participation de 19,88 % a alors été atteint. Les résultats obtenus ont révélé que 59,38 % des parodontistes canadiens utilisent les antibiotiques locaux. Toutefois, les participants rapportent y avoir recours rarement et principalement pour la prise en charge de la parodontite réfractaire (39,47 %) et la parodontite chronique sévère localisée (21,05 %). D’ailleurs, la minocycline est l’antibiotique local le plus fréquemment utilisé. Pour ce qui est de l’antibiothérapie systémique, la majorité des parodontistes canadiens ont démontré des pratiques cliniques similaires pour les différentes conditions parodontales évaluées, et ce, autant pour les fréquences d’utilisation que les choix d’antibiotiques. La combinaison d’amoxicilline et de métronidazole est l’antibiothérapie systémique sélectionnée le plus fréquemment pour différentes conditions parodontales. Finalement, 82,81 % des participants n’utilisent jamais les tests diagnostiques microbiens dans leur pratique et cette non-utilisation a été justifiée par l’absence d’avantages associés à leur utilisation. En conclusion, une certaine similarité entre les habitudes de pratique a été dénotée pour l’antibiothérapie et les tests diagnostiques. Ainsi, en ce qui a trait à l’utilisation globale de l’antibiothérapie, les parodontistes canadiens respectent les évidences scientifiques actuelles. Pour ce qui est des tests diagnostiques, l’absence de littérature démontrant clairement les bénéfices cliniques d’avoir recours à ce type de test en thérapie parodontale a été reflétée par la faible utilisation de ceux-ci rapportée dans ce projet. / Considering the emerging problem of bacterial resistance, this study was designed to evaluate the use of antibiotics and microbial diagnostic tests in periodontal therapy to determine whether the current clinical practices of Canadian periodontists are consistent with available literature. The data were collected through an electronic questionnaire sent by email and completed anonymously. There are 64 of the 322 periodontists contacted who participated in this study. A participation rate of 19.88 % was then obtained. The results show that 59.38 % of periodontists practicing in Canada use local antibiotics. However, participants mentioned using it rarely and mainly for the management of refractory periodontitis (39.47 %) and localized severe chronic periodontitis (21.05 %). Moreover, minocycline is the most frequently used local antibiotic. For systemic antibiotic therapy, the majority of Canadian periodontists demonstrated similar clinical practices. In fact, similarities were observed for frequency of use and antibiotic choice in various periodontal conditions evaluated. The combination of amoxicillin and metronidazole is the most frequently selected systemic antibiotic therapy for different periodontal conditions. Finally, 82.81 % of participants never use microbial diagnostic tests in their practice and this non-use was justified by the lack of benefits associated with these tests. In conclusion, a certain similarity between the practice habits was denoted for antibiotic therapy and diagnostic tests. Thus, the overall use of antibiotic therapy by Canadian periodontists respects current scientific evidence. The low use of diagnostic tests reported in this project reflects the lack of literature clearly supporting the clinical benefits of using these tests in periodontal therapy.

La leucémie lymphoblastique aigüe à lymphocyte T (T-ALL) est un cancer découlant de la transformation des progéniteurs lymphoïdes T. La chimiothérapie reste le traitement privilégié pour cette pathologie, mais le taux de récidive dû au développement de la chimiorésistance demeure important. Le site principal de développement des cellules T-ALL est la moelle osseuse, où le collagène représente la protéine de la matrice extracellulaire la plus abondante. Le collagène, via ses récepteurs, notamment les intégrines, est un acteur majeur dans la progression tumorale, et ses interactions avec les cellules cancéreuses sont associées à la chimiorésistance dans divers types de cancer. Notre laboratoire a précédemment démontré que le collagène favorise la chimiorésistance des cellules T-ALL via l'intégrine α2β1. Récemment, un autre récepteur du collagène, le récepteur à domaine discoïdine 1 (DDR1), a été décrit comme pouvant jouer un rôle dans plusieurs cancers. Cependant, son rôle dans la chimiorésistance des T-ALL n'a pas encore été étudié. Dans ce projet de maîtrise, nous avons étudié la contribution de DDR1 in vitro dans la chimiorésistance des cellules T-ALL induite suite à leur adhésion sur des matrices de collagène. Nous avons pu démontrer que DDR1 est exprimé sur les cellules T-ALL et que son inhibition permet de sensibiliser les cellules T-ALL à l'apoptose induite par la chimiothérapie. L'inhibition de DDR1 réduisait l'adhésion des cellules T-ALL au Matrigel et au collagène, mais pas à la fibronectine, montrant son action spécifique pour ces ligands. Ces résultats suggèrent que DDR1 participe à la chimiorésistance des T-ALL en partie en favorisant l'adhésion des cellules T-ALL au collagène, et pourrait donc représenter une cible thérapeutique intéressante pour le développement de thérapies combinatoires afin de réduire la chimiorésistance dans ce type de leucémie.

Le parasite Leishmania est un protozoaire de l’ordre des Kinetoplastidae et de la famille des Trypanosomatidae, responsable de maladies appelées leishmanioses. En tant qu’eucaryote unicellulaire, Leishmania possède de nombreux mécanismes d’adaptation aux stress environnementaux. En effet, plusieurs mécanismes de résistance peuvent être développés par le parasite pour répondre au stress et sont basés sur la modulation du génome, comme l’amplification génique ou l’introduction de mutations. De fait, l’étude de l’intégrité génomique et des mécanismes sous-jacents l’acquisition de la résistance sont des éléments clés de la compréhension du fonctionnement de ce parasite. L’amplification génique est rendue possible par la présence de nombreuses séquences répétées distribuées à travers le génome de Leishmania et qui permettent la formation d’amplicons circulaires et linéaires contenant des gènes essentiels à l’acquisition de la résistance. Les mécanismes sous-jacents la formation des amplicons restent encore à élucider mais les protéines de réparation de l’ADN semblent jouer un rôle majeur dans l’amplification génique. Dans le laboratoire, il a été démontré que l’amplification circulaire reposait essentiellement sur la protéine de réparation de l’ADN RAD51. Cependant, les acteurs impliqués dans la formation d’amplicon linéaire restaient inconnus. Les travaux de cette thèse ont permis de caractériser les fonctions de la protéine MRE11 chez Leishmania, protéine majeur de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue, et qui possède une activité de liaison à l’ADN ainsi qu’une activité nucléase. MRE11 semble impliquée dans l’amplification linéaire puisque son inactivation conduit à une diminution du nombre d’amplicons linéaires dans la cellule. De plus, inhiber l’activité nucléase de MRE11 conduit à une augmentation de l’amplification circulaire, suggérant ainsi un rôle prépondérant de cette activité nucléase dans la formation d’amplicons. Cette étude a également permis d’étudier l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans le maintien de l’intégrité du génome. / Nous avons pu établir un lien entre MRE11 et RAD50, deux protéines agissant au sein d’un même complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1), et l’instabilité génomique. En effet, l’inactivation de MRE11 et RAD50 a conduit à des réarrangements chromosomiques qui semblent être survenus par micro-homologie. Ces travaux ont donc permis de mettre en lumière qu’en l’absence des protéines majeures de la recombinaison homologue, un mécanisme de réparation par micro-homologie indépendant de MRE11 se met en place dans la cellule. De plus, l’inactivation du gène RAD50 dans une souche sauvage s’est révélée impossible alors qu’elle l’était dans une souche préalablement inactivée pour MRE11, suggérant une certaine hiérarchie dans le complexe MRN. Cette thèse présente également l’étude de l’acquisition de mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine qui conduit à la résistance des parasites à cette drogue. La technologie de séquençage à profondeur élevée (« deep-sequencing ») nous a permis de séquencer ce gène à différents stades intermédiaires de la résistance, afin de déterminer la fréquence d’acquisition et la stabilité de ces mutations. Nous avons pu observer que les mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine ne sont pas présentes dans les premiers stades de la résistance mais acquises à des concentrations plus élevées. L’analyse du gène a également démontré un plus grand nombre de mutations au fur et à mesure que la pression de sélection s’intensifie ainsi qu’une certaine stabilité des mutations après retrait de la pression de drogue, laissant entrevoir un maintien de la résistance. Ces résultats mettent en évidence l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans la stabilité génomique chez Leishmania, mais surtout un rôle dans l’amplification extra-chromosomique liée à la résistance. L’utilisation des nouvelles technologies de séquençage nous a également permis d’étudier la dynamique d’acquisition de mutations ponctuelles impliquées dans la résistance.

*Aeromonas salmonicida* sous-espèce *salmonicida*, agent étiologique de la furonculose, impacte négativement les piscicultures chaque année au Québec. Dans les dernières années, une hausse de résistance aux antibiotiques chez cette bactérie a été remarquée. De la résistance contre la tétracycline chez les poissons est fréquemment observée, bien que cet antibiotique ne soit que peu utilisé par l'industrie aquacole. C'est toutefois le cas de l'industrie porcine, où la tétracycline est abondamment utilisée. En s'intéressant à l'environnement autour des piscicultures, ce présent projet établit l'hypothèse qu'il est envisageable d'observer des liens reliant la furonculose, les gènes de résistance aux antibiotiques chez *A. salmonicida* sous-espèce *salmonicida* et la contribution potentielle de l'environnement. À l'aide de méthodes de séquençage génomique et de bio-informatique, de nouveaux plasmides ont été caractérisés. Les plasmides, pAsa-2358, pAsa-2900 et pAsa-2900b, font maintenant partie du répertoire de plasmides de résistance retrouvés au Québec chez la sous-espèce *salmonicida*. Des échantillons provenant de piscicultures et de leur environnement limitrophe ont été récoltés et testés par biologie moléculaire dans le but de détecter les plasmides connus au Québec pour cette bactérie incluant les trois nouveaux plasmides. Un portrait global des plasmides retrouvés a été dressé, confirmant la présence potentielle de la bactérie sans éclosion active de furonculose. Effectivement, plusieurs plasmides problématiques de la sous-espèce, soit pSN254b et ceux de la famille des pRAS3 ont été détectés. Plus particulièrement, pSN254b confère une résistance à plusieurs antibiotiques, donnant une résistance à tous les antibiotiques autorisés au Canada pour traiter la furonculose. Sachant qu'ils sont détectés autant dans les sédiments que dans l'eau, il est possible d'envisager qu'à ces moments, une grande concentration de cet ADN était disponible dans l'environnement. Cette étude permet un premier pas vers l'analyse environnementale des milieux piscicoles au Québec. / *Aeromonas salmonicida* subspecies *salmonicida*, etiological agent of furunculosis, negatively impacts the fish farming industry every year in the province of Quebec. In the last years, a dramatic increase in the presence of antibiotic resistance genes within the bacterial strains of interest was observed. Tetracycline resistance in fish farms in Quebec is frequently observed, even though this antibiotic is rarely used against furunculosis in the industry. Moreover, it is quite overused in the swine industry. Looking more closely at the surrounding environments of fish farms, the present study establishes the hypothesis that it is possible to potentially establish links in between furunculosis, resistance genes in *A. salmonicida* subspecies *salmonicida* and the potential contribution of the environment. Working with genomic sequencing and bioinformatics, new plasmids were characterized. Plasmids pAsa-2358, pAsa-2900 and pAsa-2900b are now part of the list of known resistance-bearing plasmids in the province of Quebec for the subspecies *salmonicida*. Environmental samples were also collected and tested by molecular biology in the goal of detecting known plasmids found in Quebec in this bacterium, including the three new plasmids mentioned. A global portrait of plasmids found in them is discussed, confirming the potential presence of *Aeromonas salmonicida* subspecies *salmonicida* in the fishponds without active outbreaks of furunculosis. Problematic plasmids from the subspecies, pSN254b and those from the pRAS3 family were detected. More specifically, pSN254b confers resistance to multiple antibiotics, providing resistance to all antibiotics authorized for treatment in Canada. Knowing that these plasmids were detected both in sediment and water samples, it is possible to think that this DNA was available at a high concentration in the environment at this time. This study allows the debuts of the analysis of the environment of fish farms in Quebec.

L'introduction délibérée dans l'air de microorganismes pathogènes représente une menace. Parmi les armes bactériologiques les plus craintes, on retrouve les spores de Bacillus anthracis. La possibilité de faire face à des souches de B. anthracis, porteuses de résistances aux antibiotiques, est bien réelle. Le but du projet est de développer une méthode rapide de détection des résistances aux antibiotiques pour les spores de Bacillus sp. Cette méthode doit pouvoir être utilisée avec un système de détection permettant une analyse cellule par cellule. Les techniques de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) et de PCR in situ sont appropriées dans cette situation. Présentement, le seul protocole de perméabilisation des spores de Bacillus sp. pour la détection in situ nécessite trois jours. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient de (i) développer un protocole de perméabilisation rapide des spores permettant de faire du FISH et (ii) développer des méthodes in situ afin de détecter des séquences de gènes de résistance aux antibiotiques d'origines plasmidique et chromosomique. Deux approches ont été utilisées pour perméabiliser les spores soit la germination rapide et la perméabilisation directe. Ensuite, les techniques d'amplification enzymatique du signal FISH et de PCR in situ ont été mises au point pour les spores. Des souches simulantes nonpathogènes de B. anthracis, soit B. aetropheus et B. cereus ATCC 14579 ont été utilisées comme modèle pour les expériences. La germination rapide des spores permet une détection par FISH en moins de deux heures comparativement à la perméabilisation directe des spores qui permet une détection en moins d'une heure. Les techniques d'amplification enzymatique du signal FISH et le PCR in situ ont permis la détection du gène de résistance au chloramphénicole présent sur le plasmide à haute copie pC 194. Le PCR in situ a permis la détection du gène de résistance à l'érythromycine porté par le plasmide à faible copie pMTL ainsi que d'une mutation, d'origine chromosomique, responsable de la résistance à la rifampicine. Cette thèse démontre qu'il est possible de détecter, directement dans la spore de Bacillus sp., des gènes de résistance aux antibiotiques, même s'ils sont présents en faible nombre de copies.

La structure des ADN polymérases (pol) du cytomégalovirus humain (CMV) et du virus herpès simplex 1 (VHS-1), appartenant tous deux à la famille des Herpesviridae, est associée à la forme d'une main droite comportant entre autres les domaines de la paume, du pouce et des doigts. L'ADN pol adopte différentes conformations (ouverte et fermée) impliquant un mouvement du domaine des doigts dans le but de faciliter l'interaction entre le nucléotide et l'ADN en cours d'élongation. Il a été montré que l'antiviral foscarnet (FOS) qui cible l'ADN pol du CMV et du VHS-1 se lierait à l'enzyme quand elle est dans sa conformation fermée et que des mutations dans le domaine des doigts conférant la résistance à cet antiviral favoriseraient une conformation plus ouverte de l'enzyme pour laquelle le FOS a une affinité plus faible. Nous avons voulu analyser si cette hypothèse s'appliquait également à des mutations qui sont localisées dans des régions du domaine NH₂-terminal et de la paume qui interagissent avec le domaine des doigts lors des changements de conformation de l'enzyme au cours de la réaction de polymérisation. Notre hypothèse est que des mutations localisées dans l'hélice K (domaine NH₂-terminal) et la région II (domaine de la paume) qui participent aux changements de conformation de l'enzyme pourraient favoriser une conformation plus ouverte des ADN pol virales, et par conséquent, réduire la sensibilité des virus au FOS. Nous avons donc sélectionné des substitutions théoriques en utilisant une stratégie basée sur l'alignement des séquences en acides aminés des ADN pol du CMV et du VHS-1 (sensibles au FOS) avec celles des bactériophages RB69 et T4 (résistantes au FOS). Nous avons tenté de générer les virus recombinants CMV et VHS-1 possédant les différentes substitutions théoriques sélectionnées. Cependant, l'introduction de certaines substitutions [Q578P, R581T, L587F (hélice K), P712Y, F718L (région II) pour le CMV et Q617P, R620T, L626F (hélice K), F718L (région II) pour le VHS-1] étaient délétères pour les ADN pol, ce qui empêchait les virus recombinants de se répliquer en culture cellulaire. Parmi les substitutions sélectionnées dans l'hélice K, la substitution I619K confère une résistance du VHS-1 au FOS. Au sein de l'hélice K, nous avons également caractérisé la substitution théorique Q579I qui conférait une hypersensibilité du CMV au FOS. Nous avons caractérisé cette substitution en la comparant à la mutation K805Q localisée dans l'hélice P (domaine des doigts) déjà connue pour induire une hypersensibilité du CMV au FOS. Dans la région II, les substitutions V715S et A719T confèrent une résistance des deux virus au FOS. La substitution Q697P du CMV confère une résistance du CMV au FOS mais pas pour le VHS-1. Les profils de sensibilité des virus recombinants au FOS ont également été confirmés par des tests enzymatiques dans lesquels nous avons déterminé l'inhibition de l'activité des ADN pol recombinantes mutées par cet antiviral. Nous avons également constaté une diminution des capacités réplicatives des CMV et VHS-1 recombinants possédant ces substitutions par rapport à celle des virus sauvages correspondants. Des analyses tri-dimensionnelles ont été réalisées et ont suggéré que les substitutions conférant une résistance au FOS seraient associées à une déstabilisation de la conformation fermée des ADN pol et favoriseraient une conformation plus ouverte pour laquelle l'antiviral a une plus faible affinité. D'autre part, les modélisations tri-dimensionnelles des protéines possédant les substitutions conférant une hypersensibilité au FOS ont montré que les ADN pol favorisaient une conformation plus fermée pour laquelle le FOS a une plus grande affinité. La caractérisation de la substitution théorique V715S du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCVᴿ et FOSᴿ/ACVᴿ, respectivement) a été comparée aux substitutions V715G du VHS-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCV[exposant S] et FOS[exposant S]/ACVᴿ, respectivement), déjà décrites dans la littérature. Brièvement, nous avons montré que l'introduction de ces différentes substitutions induisaient des changements au niveau de l'environnement hydrophobe de la valine à la position 715 influençant ainsi les phénotypes de sensibilité aux antiviraux observés. L'ensemble de ces résultats nous ont permis d'appuyer notre hypothèse selon laquelle les mutations localisées dans l'hélice K et la région II peuvent influencer la sensibilité des virus au FOS en modifiant la structure de la protéine et en interférant avec les changements de conformation de l'enzyme. / The structure of the human cytomegalovirus (HCMV) and herpes simplex virus 1 (HSV-1) DNA polymerase (pol), belonging to the Herpesviridae family, is associated to a right hand with palm, thumb and fingers domains. The viral DNA pol adopts different conformations (open and closed) that implies a move of the fingers domain to facilitate the interaction between the nucleotide and the elongating DNA. It has been shown that the antiviral foscarnet (FOS) which targets the HCMV and HSV-1 DNA pol binds to the enzyme in its closed conformation and mutations confering resistance to this antiviral and localised in the fingers domain would favor a more open conformation of the enzyme for which FOS has a lower affinity. The aim of this thesis was to analyse whether this hypothesis could be extended to mutations localised in the NH₂-terminal and the palm domains which interact with the fingers domain during the conformational changes of the enzyme during the polymerization process. Our hypothesis is that mutations localized in the helix K (NH₂-terminal domain) and region II (palm domain) that participate in the conformational changes of the enzyme could favor a more open conformation of the viral DNA pol, and thus, decrease the susceptibility of viruses to FOS. We selected theoretical substitutions using a strategy based on amino acid sequences alignement of the DNA pol of HCMV and HSV-1 (susceptible to FOS) with those of RB69 and T4 bacteriophages (naturally resistants to this antiviral). We tried to generate recombinant HCMV and HSV-1 containing the different theoretical substitutions that we selected. However, the introduction of some theoretical substitutions [Q578P, R581T, L587F (helix K), P712Y, F718L (region II) for HCMV and Q617P, R620T, L626F (helix K), F718L (region II) for HSV-1] was so detrimental for the DNA pol that recombinant viruses were not able to grow in cell culture. Among the substitutions selected in the helix K, the substitution I619K confers resistance of HSV-1 to FOS. In the helix K, we also characterized the theoretical Q579I substitution that confers hypersusceptibility of HCMV to FOS. We compared this substitution with the K805Q substitution located in the helix P (fingers domain), already known to induce hypersusceptibility of HCMV to FOS. In region II, substitutions V715S and A719T confer resistance of both viruses to FOS whereas the Q697P substitution was associated with resistance of HCMV to FOS but not for HSV-1. The susceptibility profiles of recombinant viruses to FOS were confirmed by enzymatic assays that allowed us to determine the inhibition of the recombinant mutated DNA pol activity by this antiviral compound. We observed a decrease of the replicative capacities of recombinant HCMV and HSV-1 harboring these mutations compared to their wild-type counterparts. Tri-dimensional modeling was also performed to better understand the impact of these substitutions on the DNA pol of HCMV and HSV-1. On the one hand, substitutions confering resistance to FOS were associated to a destabilization of the closed conformation of the DNA pol and would favor a more open conformation for which the antiviral has a lower affinity. On the other hand, substitutions associated to a hypersusceptibility profile would favor a more closed conformation of the DNA pol for which FOS has a higher affinity. The characterization of the theoretical substitution V715S of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCVᴿ and FOSᴿ/ACVᴿ, respectively) was compared to the substitutions V715G of HSV-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCV[superscript S] and FOS[superscript S]/ACVᴿ, respectively), already described in the literature and that were, thus, associated with different antiviral susceptibility phenotypes compared to those of V715S. Briefly, we showed that the introduction of these different substitutions could induce varying changes of the hydrophobic environment of the valine at position 715 influencing the antiviral susceptibility profile. Altogether, these results support our hypothesis that substitutions in helix K and region II could influence the susceptibility of HCMV and HSV-1 to FOS by modifiying the protein structure and impacting the correct conformational changes of the enzyme.