Les objectifs de ce travail expérimental étaient : 1. Évaluer la place de la lactatémie capillaire comme dispositif de monitorage de l’ischémie et de la reperfusion tissulaire. 2. Comparer le suivi local du taux de lactate, au niveau du compartiment ischémié, par rapport au taux systémique du lactate lors des l’ischémie de membre, l’ischémie intestinale ainsi que durant le choc hémorragique. La mesure capillaire du taux de lactate pourrait permettre: 1. d’affirmer l’existence d’une ischémie tissulaire régionale. Le taux systémique du lactate ne permet ce diagnostic, 2. de confirmer l’efficacité d’une reperfusion au niveau d’un membre préalablement ischémique tandis que la mesure systémique des lactates ne le permet pas. L’affirmation de l’efficacité de la reperfusion et de sa constance, par une mesure aussi simple que la lactatémie capillaire compartimentale représente une avancée majeure en comparaison avec les autres méthodes existantes. La mesure capillaire du taux de lactate systémique dans une situation d’hypoperfusion par choc hémorragique n’est pas associée à augmentation du taux de lactate intra-musculaire. / Our objectives for this experimental work were: 1. Assessment of capillary lactate for tissue ischemia and reperfusion monitoring. 2. Compare the local and systemic capillary lactate time course during compartmental ischemia insults like limb ischemia, intestinal ischemia or during hemorrhagic shock. The capillary measurement of the lactate in IR could be interesting for: 1. Assessing a limb or intestinal tissue ischemia. On the opposite, the systemic measurement could not assess this diagnosis. 2. Assessing the efficiency of a limb reperfusion. On the opposite, the systemic measurement could not assess this diagnosis. The systemic capillary lactate measurement during haemorrhagic shock related hypo perfusion could not be associated with an increase in intra muscular lactate.

Introduction: La lésion d'ischémie - reperfusion (I/R) intestinale est associée à une mortalité élevée.Le rôle de la transmigration des neutrophiles est probablement essentiel dans le dysfonctionnement de la barrière induit par la lésion I/R et la nécrose subséquente. Le but de notre étude était d'évaluer, au niveau pré-clinique, la valeur thérapeutique potentielle du peptide P8RI (un agoniste de CD31) dans la lésion I/R de l'intestine grêle.Méthodes: I/R intestinale a été induite chez des rats Wistar par clampage de l'artère mésentérique supérieure (AMS) pendant 30 min suivi par 4 h de reperfusion. Trois groupes de rats ont été comparés:P8RI (n = 20, I/R et P8RI 2,5 mg/kg/h de reperfusion), I/R témoins positifs (n = 21, I/R et infusion de sérum physiologique) et témoins (n = 14, dissection de l'AMS sans clampage et infusion de sérum physiologique). La matrix métallopeptidase 9 (MMP-9) dans la plasma, le liquide péritonéal et l'intestin; la MPO intestinale, l'ADN libre plasmatique, les taux d'hémoglobine intraluminale e tl'épaisseur épithéliale ont été évalués comme marqueurs intermédiaires de la lésion intestinale. La détection du matériel génétique d'E.coli par PCR quantitative dans le sang a été également réalisée chez les témoins positifs et chez les rats traités par P8RI pendant la période de reperfusion. Le CD31clivé dans le plasma a été mesuré par une méthode d'ELISA maison. Résultats: La grade histologique de l'intestin grêle chez les animaux traités par P8RI est supérieur àcelui des témoins positifs d'I/R (p < 0,05). P8RI protège l'intestin grêle contre la destruction épithéliale induite par lésion I/R (p < 0,01). Il y a une corrélation négative significative entre l'abrasion épithéliale et le score de Chiu de classement histologique de la lésion I/R mésentérique (r = -0,7245, p < 0.001).P8RI protège l'intestin grêle de la MPO in situ, de la libération de la MMP-9 (p < 0,05) et des complications hémorragiques digestives causées par lésion I/R (p < 0,01). Les taux plasmatiques et péritonéaux accrus de MMP-9, induits par I/R, sont significativement réduits par P8RI (p < 0,05 et p <0,01, respectivement). L'ADN d'E.coli circulant est significativement plus élevé chez les rats de témoins positifs que dans le groupe P8RI (p < 0,05). L'ADN libre plasmatique pendant la reperfusion chez les rats de témoins positifs augmente significativement plus que celle des rats du groupe P8RI (p< 0,05). P8RI n'a aucun effet sur le compte neutrophilaire sanguin, mais induit une diminution significative de CD31 clivé dans le plasma pendant l'I/R mésentérique (p < 0,01). Les corrélations entre l'abrasion épithéliale et l'ADN libre, MMP-9, CD31 clivé plasmatiques, les taux de MMP-9 et MPO intestinale suggèrent que le mécanisme protecteur de P8RI implique l'inhibition de l'activation neutrophilaire, y compris le clivage de CD31. Conclusions: Cette étude suggère que le traitement par le peptide P8RI, un agoniste de CD31, réduit de la façon préventive, la lésion I/R de l'intestin grêle chez les rats. / Background: Intestinal ischemia/reperfusion (I/R) injury is associated with a high mortality. The roleof transmigration of PMNs is probably essential in I/R-induced intestinal barrier dysfunction andsubsequent necrosis. The aim of this study was to evaluate, at a preclinical level, the potentialtherapeutic value of P8RI peptide (a CD31 agonist), in small bowel I/R injury.Methods: Intestinal I/R was induced in Wistar rats by superior mesenteric artery (SMA) clamping for30 min followed by 4 h of reperfusion. Three groups of rats were compared: P8RI (n=20, I/R and P8RI2.5mg/kg/h infusion), I/R positive controls (n=21, I/R and normal saline infusion), and sham operatednegative controls (n=14, SMA dissection with no clamping and normal saline infusion). Plasma,peritoneal fluid and intestinal matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), intestinal MPO, plasma cf-DNA,intraluminal hemoglobin levels and epithelial thickness were all evaluated as intermediate markers ofintestinal injury. Detection of E.coli genetic material by quantitative PCR in blood was also performedin I/R controls and P8RI-treated rats during the reperfusion period. Plasma cleaved CD31 wasmeasured by homemade ELISA.Results: The small bowel histologic grade in P8RI-treated animals was higher than in I/R controls (p <0.05). P8RI protected against epithelial destruction induced by I/R injury (p < 0.01). There was asignificant negative correlation between epithelial abrasion and Chiu's score of histologic grading ofmesenteric I/R injury (r = -0.7245, p < 0.001). P8RI protected the small bowel from in situ MPO andMMP-9 release (p < 0.05) and digestive bleeding complications due to I/R injury (p < 0.01). Theincreased plasma and peritoneal MMP-9 levels induced by I/R were significantly reduced by P8RI (p <0.05 and p < 0.01, respectively). Plasma cf-DNA during reperfusion in I/R controls increasedsignificantly more than in the P8RI group (p < 0.05). E.coli DNA was significantly higher in I/Rcontrols than in the P8RI group (p < 0.05). P8RI had no effect on blood neutrophil counts but induceda significant diminution of cleaved CD31 in plasma during mesenteric I/R (p < 0.01). Correlationsbetween epithelial abrasion and plasma cf-DNA, MMP-9, cleaved CD31, intestinal MMP-9 and MPOlevels suggest that the protective mechanism of P8RI might involve the inhibition of neutrophilactivation, including CD31 cleavage.Conclusions: This study suggests that a treatment by P8RI peptide, a CD31 agonist, reduces smallbowel I/R injury in rats

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Göteborgs universitet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

La maladie cardiovasculaire la plus courante dans les pays industrialisés est la maladie coronarienne responsable d’une ischémie du tissu cardiaque pouvant conduire à l’infarctus du myocarde. Bien que les améliorations de la prise en charge aient considérablement réduit les délais de la reperfusion (seul remède à l’ischémie), l’ischémie/reperfusion (I/R) entraîne des dommages cellulaires et tissulaires ainsi qu’une diminution des capacités fonctionnelles du coeur. Il existe néanmoins des systèmes de cardioprotection endogènes (comme le préconditionnement (préC) ou le postconditionnement (postC)) que l’on peut activer via l’administration de substances pharmacologiques. L’élastine, une protéine fibreuse de la matrice extracellulaire, est responsable de l’élasticité de certains de nos tissus (poumons, peau, <). Des peptides issus de la dégradation de l’élastine (PE) exercent un effet cardioprotecteur envers l’I/R en activant la voie de survie cellulaire RISK. Dans des fibroblastes dermiques, la transduction du signal induit par les peptides d’élastine est médiée de façon précoce par un second messager : le lactosylcéramide (LacCer). Cette étude constitue une première approche des effets du LacCer dans la cardioprotection envers l’I/R. Nous avons montré que le LacCer est un médiateur précoce du signal cardioprotecteur induit par les PE et qu’il protège le coeur des dommages liés à l’I/R dans un modèle de coeur isolé et perfusé en postC. Lors du vieillissement, de nombreuses modifications physiologiques sont à l’origine d’une perte d’efficacité des mécanismes de cardioprotection. Dans ce travail, nous avons également étudié les effets cardioprotecteurs des PE, du LacCer et de l’inhibition de p38MAPK (une protéine probablement impliquée dans la perte des mécanismes cardioprotecteurs liée au vieillissement) envers les dommages liés à l’I/R chez les rats âgés. Nous avons montré que les PE exercent un effet cardioprotecteur en pré+postC contre l’I/R au niveau de la survie cellulaire et au niveau de la récupération des capacités contractiles cardiaques. Le LacCer n’exerce un effet protecteur qu’au niveau de la survie cellulaire et l’inhibition de p38MAPK entraine une meilleure récupération des capacités contractiles sans améliorer la survie cellulaire. / In developed countries the most common cardiovascular disease is coronary heart disease that is responsible for myocardial ischemia and can lead to myocardial infarction. Reperfusion is the only cure for ischemia. Care improvement has dramatically reduced reperfusion delay but ischemia/reperfusion (I/R) causes a lot of cellular and tissular damages and a reduction of cardiac contractile abilities. Nevertheless cardioprotective pathways (like preconditionning (preC) and postconditionning (postC) can be pharmacologically triggered to reduce I/R injury. Elastin is a fibrous protein from extracellular matrix and is responsible for tissues elasticity in lungs, skin, < Peptides derived from elastin fragmentation (EP) exhibit cardioprotective function against I/R by triggering the RISK pathway, a cell survival pathway. In dermic fibroblasts, elastin peptides pathway is mediated by an early messenger : lactosylcéramide (LacCer). In this work we have studied cardioprotective function of LacCer against I/R injury. We show that LacCer is an early messenger of EP cardioprotective pathway and that it also exhibits a cardioprotective function against I/R in an postconditionning isolated rat heart model. During ageing dramatic physiological modifications are responsible for a loss of efficiency of cardioprotection pathways. In this work we have also studied the potential cardioprotective function of EP, LacCer and p38MAPK inhibition (a protein presumably involved in loss of efficiency of cardioprotection pathways during ageing) against I/R injury in aged rats. We have shown that EP exhibit a cardioprotective function against I/R injury in aged rats as well as young rats in a pre+postconditionning protocol. EP enhance contractile abilities recovering and cell survival. LacCer improves only cell survival and p38MAPK inhibition improves only contractile abilities recovering

published_or_final_version / Pharmacology / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Anatomy / Doctoral / Doctor of Philosophy

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Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor. Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar. Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden. / Myocardial infarction (MI) is still one of the leading causes of mortality worldwide. Minimizing infarct size, which is determined by duration of ischemia, is of paramount importance for the rescue of myocardial tissue determining myocardial infarct size and prognosis. Currently, reperfusion is a central clinical intervention to curtail myocardial ischemia. However, reperfusion itself is leading to additional damage to the heart. Therefore, investigating new strategies to minimize myocardial reperfusion injury is of international interest. The pathophysiology of myocardial reperfusion injury is complex and some of its components are still mechanistically not completely understood. The present work determines the role of CD4+ T-cells and in particular their subset of regulatory T-cells in myocardial reperfusion injury, providing approaches for new T-cell directed therapies in addition to myocardial reperfusion. Initially, an infiltration of T-cells into the myocardium was investigated after ischemia-reperfusion (I/ R). After ischemia-reperfusion, infiltrating CD4+ T-cells were identified as leading in quantity and activated and turned out to be relevant mediators of reperfusion injury influencing infarct size. CD25+Foxp3+ regulatory T (reg)-cells are a subpopulation of CD4+ T-cells with immunosuppressive features, being activated quickly and at a low threshold, thereby possibly mediating reperfusion injury. With the help of the DEREG (DEpletion of REGulatory T-cells) mouse model, regulatory T-cells were identified as involved in myocardial reperfusion injury; Treg-depleted DEREG mice were protected from reperfusion injury showing smaller infarct sizes than control mice. Additionally, transfer experiments revealed that Treg-mediated reperfusion injury needs the presence of CD25- conventional T-cells (Tconv). That means that Tregs are a potential target identified in the present work to reduce myocardial reperfusion injury. With the help of T-cell receptor transgenic OT-II mice and MHC (major histocompatibility complex) class II knockout (KO) mice, it was shown that recognition of autoantigen plays a role in myocardial reperfusion injury. Next to MHC class II-signaling and costimulators also the molecule CD154 (CD40L) is required for full T-cell activation. An inhibitory anti-CD154 antibody significantly reduced infarct size in wildtype mice. Besides by cells of the adaptive immunity, myocardial reperfusion injury can also be intensified by neutrophils, platelets or inflammation of the endothelium. Knockout mice deficient in CD4+ T-cells revealed a better microperfusion. Mechanistically, after 24h of reperfusion, the absolute cell number of neutrophils was not altered in CD4 KO versus wildtype mice; however, in endothelial cells, the regulation of specific genes (VEGFα, TIMP-1 and Eng) was altered after I/ R. In summary, the present work shows a central role of recognition of antigen by the T-cell receptor for activation of CD4+ T cells in myocardial reperfusion injury. In the presence of CD4+Foxp3+ regulatory T-cells, myocardial reperfusion injury is enhanced. Hence, CD4+Foxp3+ regulatory T-cells might constitute a new potential target for the therapy of myocardial infarction.

abstract / Anaesthesiology / Doctoral / Doctor of Philosophy