Sequence-function relationship is a fundamental question for many branches of modern biomedical research. It connects the primary sequence of proteins to the function of proteins and fitness of organisms, holding answers for critical questions such as functional consequences of mutations identified in whole genome sequencing and adaptive potential of fast evolving pathogenic viruses and microbes. Many different approaches have been developed to delineate the genotype-phenotype map for different proteins, but are generally limited by their throughput or precision. To systematically quantify the fitness of large numbers of mutations, I modified a novel high throughput mutational scanning approach (EMPIRIC) to investigate the fitness landscape of mutations in important regions of essential proteins from the yeast or RNA viruses. Using EMPIRIC, I analyzed the interplay of the expression level and sequence of Hsp90 on the yeast growth and revealed latent effect of mutations at reduced expression levels of Hsp90. I also examined the functional constraint on the receptor binding site of the Env of Human Immunodeficiency Virus (HIV) and uncovered enhanced receptor binding capacity as a common pathway for adaptation of HIV to laboratory conditions. Moreover, I explored the adaptive potential of neuraminidase (NA) of influenza A virus to a NA inhibitor, oseltamivir, and identified novel oseltamivir resistance mutations with distinct molecular mechanisms. In summary, I applied a high throughput functional genomics approach to map the sequence-function relationship in various systems and examined the evolutionary constraints and adaptive potential of essential proteins ranging from molecular chaperones to drug-targetable viral proteins.

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome