O Atlântico Sul está entre os menos estudados dos oceanos, em relação às suas comunidades microbianas, apesar da importância ecológica e do interesse biotecnológico nos micro-organismos marinhos. Este potencial biotecnológico inclui a produção de enzimas como as lípases de endoglicanases, que podem ser utilizadas na produção de biocombustíveis, no processamento têxtil e na suplementação de detergentes. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o isolamento, identificação filogenética e avaliação das atividades lipolíticas e endoglucanolíticas de bactérias cultivadas de sedimentos do leste do Oceano Atlântico Sul, e de águas da região da Elevação do Rio Grande. Para isto, oito amostras de sedimento e dezesseis de água foram coletadas em novembro de 2009 e novembro de 2011, para as referidas regiões do Oceano Atlântico Sul. Os micro-organismos foram cultivados e identificados pela análise de sequências de genes de RNA ribossômico 16S. Posteriormente, as atividades lipolíticas e endoglucanolíticas foram determinadas em ensaios em placas com diferentes substratos tais como Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 para a atividade lipolítica, e carboximetilcelulose para a atividade endoglucanolítica. No total 212 linhagens foram isoladas e 138 foram identificadas filogeneticamente das duas áreas de estudo, em cinco classes diferentes e trinta gêneros, sendo as classes Gammaproteobacteria e Bacilli as mais freqüentes, assim como os gêneros Halomonas e Bacillus. Os sedimentos apresentaram maior diversidade em nível de espécie, enquanto que nas amostras pelágicas a diversidade foi maior em nível de gênero e classe. Dezoito linhagens isoladas parecem pertencer a espécies ainda não descritas de bactérias. As 212 linhagens foram testadas quanto às atividades enzimáticas. Mais que metade destes organismos apresentou algum tipo de atividade lipolítica, enquanto que a atividade endoglucanolítica foi restrita a dez linhagens. O método de isolamento direto em meio sólido contendo lipídeos foi o mais apropriado para a prospecção de bactérias lipolíticas. Os resultados deste trabalho atestam a necessidade de estudos sobre a microbiota marinha cultivável, bem como seu potencial para a obtenção de enzimas com uso industrial. / The South Atlantic is among the less studied oceans concerning its microbial communities, despite the ecological importance and the biotechnological interest related to marine microorganisms. In this context, the present work aimed the isolation, phylogenetic identification and evaluation of the lipolytic and endoglucanolytic activities of bacteria from sediments of the Eastern South Atlantic and waters from the Rio Grande Rise Region. For this, eight sediment samples and sixteen water samples were collected in two cruises conducted on November/2009 and November/2011 to the specified areas. Microorganisms were cultivated and identified by 16S rRNA sequences analysis. Lipolytic and endoglucanolytic activities were evaluated on plate assays with different substrates (Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 for lypotytic activity, and carboximethilcellulose for endoglucanolytic activity). 138 bacteria were phylogenetically identified from the two studied areas in five different classes and thirty genera. The classe Gammaproteobacteria and Bacilli and the genera Halomonas and Bacillus were the most frequent identified. Higher species-level diversity was detected in sediments, but a higher genus- and class-level diversity was present on waters samples. Eighteen strains seem to belong to no yet described bacterial species. Two hundred and twelve strains were tested for the enzymatic activities. More than a half of the bacteria showed some kind of lipolysis, while the endoglucanolytic activity was restricted to ten strains. The direct isolation in solid media containg a lipidic substrate was the best method to prospect lipolytic bacteria. The results of this work attest the necessity of studies on the cultivable marine microbiota, as well as their potential for the prospection of industrially relevant enzymes.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:11:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Núbia.pdf: 1884331 bytes, checksum: e96549974d078d915f616503d56a69ff (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:12:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Núbia.pdf: 1884331 bytes, checksum: e96549974d078d915f616503d56a69ff (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T16:12:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Núbia.pdf: 1884331 bytes, checksum: e96549974d078d915f616503d56a69ff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T16:12:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Núbia.pdf: 1884331 bytes, checksum: e96549974d078d915f616503d56a69ff (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / A esquistossomose é uma das mais importantes doenças parasitárias sendo endêmica em 76 países. No Brasil, esta representa um dos mais sérios problemas de saúde pública, persistindo devido às precárias condições de vida nas quais a população está inserida. O Schistosoma mansoni é a única espécie descrita no Brasil responsável por causar a esquistossomose. Este parasito é um metazoário digenético com várias características únicas em sua morfologia, fisiologia e ciclo de vida. Diante disto, é provável uma complexa regulação da expressão gênica em S. mansoni favorecendo mudanças morfológicas e bioquímicas atendendo as suas necessidades fisiológicas e de adaptação aos diversos ambientes. Assim, o mecanismo de regulação pós-transcricional, Spliced leader (SL) trans-splicing, existente no parasito, pode ser importante para viabilizar tais adaptações. Este mecanismo é apenas parcialmente compreendido sendo um amplo campo para pesquisa, auxiliando no desenvolvimento de possíveis ferramentas para o controle da esquistossomose. O SL trans-splicing ocorre através da adição de uma sequência identificada como Spliced leader, que é doada da extremidade 5’ de um RNA pequeno, para alguns pré-mRNAs receptores, formando o éxon 5’ terminal dos mRNAs maduros. Neste trabalho, foi realizado a identificação de transcritos processados por SL trans-splicing na fase de esporocisto do ciclo de vida do S. mansoni através da construção de biblioteca de cDNA enriquecida neste mecanismo. Assim, por meio de um estudo pioneiro de transcriptômica envolvendo a fase de esporocisto, foram construídas bibliotecas do tipo fragmento e utilizado um sequenciador de segunda geração para identificação de 1.191 transcritos processados por SL trans-splicing nesta fase. Neste trabalho foi observado que 10% dos transcritos expressos na fase de esporocisto são processados por SL trans-splicing se comparado à 5ª versão do proteoma predito de S. mansoni e 15%, se comparado com os 6.677 genes expressos identificados no transcriptoma da fase de esporocisto. Ainda, a partir da classificação dos transcritos em categorias funcionais e identificação de vias metabólicas, foi observado que o mecanismo de SL trans-splicing não está articularmente enriquecido, caracterizando-se como um mecanismo ubíquo. Em conjunto, estes dados enriquecem os estudos de transcriptômica do parasito S. mansoni. Compreender as reais funções deste mecanismo pode auxiliar no desenvolvimento futuro de uma ferramenta de intervenção terapêutica para o controle da esquistossomose mansônica / Schistosomiasis is a major parasitic disease, which is endemic in 76 countries. In Brazil, this is one of the most serious public health problem persisting due to the precarious living conditions in which the population is inserted. Schistosoma mansoni is the only specie described in Brazil responsible for causing schistosomiasis. This parasite is a digenetic metazoan with several unique features in its morphology, physiology and life cycle. Therefore, it is plausible a complex regulation of gene expression in S. mansoni, allowing morphological and biochemical changes that attend their physiological needs and to adapt to different environments. Therefore, the mechanism of post-transcriptional regulation, Spliced leader (SL) trans-splicing, existent in the parasite, may be important to enable these adaptations. This mechanism is only partial understood and thus a wide field for research towards the development of tools for schistosomiasis control. The SL trans-splicing occurs by the addition of a sequence identified as Spliced leader which is donated from the 5 ' end of a small RNA to receptor pre-mRNAs, forming the exon 5' end of mature mRNAs. Here, we carried out the identification of transcripts processed by SL trans-splicing in sporocyst of S. mansoni by constructing cDNA libraries enriched. Thus, by means of a pioneer study of transcriptomics involving the sporocyst stage, fragment libraries were constructed and used next-generation sequencing to identify 1.191 transcripts processed by SL trans-splicing in this stage. In this work, we found that 10% of transcripts expressed in the sporocyst stage are processed by SL trans-splicing when compared to the 5th version of the predicted proteome of S. mansoni and 15%, when compared to the 6,677 expressed genes identified in the transcriptome of the sporocyst stage. After the classification of transcripts in functional categories and identification of metabolic pathways we observed that the SL trans-splicing mechanism does not seem to be particularly enriched, being characterized as an ubiquitous mechanism. Together, our data improve knowledge acquired on transcriptomics studies of the parasite S. mansoni. Understanding the real function of this mechanism can assist in the future development of a therapeutic intervention tool for schistosomiasis control.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-30T12:31:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-30T12:31:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-30T12:31:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_WanderdeJesusJeremias.pdf: 10066652 bytes, checksum: ebdb6e40220315595222399b0ea10c0c (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Dentre as formas evolutivas do Schistosoma mansoni, o esquistossômulo é uma das mais estudadas para desenvolvimento de novos fármacos e sistemas diagnósticos. Embora a transformação in vitro seja vantajosa, é importante discutir as limitações do uso de resultados obtidos a partir de parasitos cultivados in vitro em relação aos obtidos no processo natural de infecção. No presente trabalho, esquistossômulos obtidos in vivo e in vitro foram comparados em relação a capacidade de captar sondas fluorescentes, específicas para estruturas internas celulares ou membranas superficiais do parasito. As sondas empregadas para membranas e estruturas internas mostraram marcação similar entre parasitos obtidos in vitro, por transformação mecânica (Mec) e por penetração em pele (Pel). No entanto, diferenças foram observadas quando estes parasitos foram comparados a outros obtidos in vivo pelo método de Clegg (Clegg et al, 1965), sendo detectado um aumento da permeabilidade de membranas. Os dados sugerem que nos esquistossômulos cultivados in vivo o metabolismo é mais ativo nas células superficiais e que durante sua permanência por até 72 horas na pele há um extenso turnover da superfície do parasito, envolvendo moléculas internas e um aumento da liberação de imunógenos. A aumentada permeabilidade pode permitir ainda a captação de moléculas, capazes de estimular o crescimento do parasito. Além disso, bibliotecas de esquistossômulos Mec cultivados em soro portal (SPO3h e SPO12h) e soro periférico de hamster (SPE3h, SPE12h) foram comparadas utilizando sequenciamento de nova geração (NGS) e análise da expressão de genes específicos. Após o sequenciamento e análise dos genes expressos uma alta similaridade entre as réplicas foi encontrada. Comparando as amostras SPO3h versus SPO12h 58 transcritos se mostraram diferencialmente expressos. De acordo com as anotações de termos de ontologia gênica (GO) os genes diferencialmente expressos após 12 horas de contato com o soro portal de hamster, estão ligados a processos importantes ao desenvolvimento até vermes adultos. Assim, este estudo viabilizou um maior entendimento de mecanismos de controle sobre a internalização de moléculas pelo parasito no estádio larvário intravascular, bem como da regulação de sua expressão de genes quando o mesmo se encontra no sistema porta hepático do hospedeiro, onde as formas adultas são essenciais para desenvolvimento da doença. / Among the different forms of the Schistosoma mansoni, the schistosomulum is widely explored in a broad range of survey, aiming to the development of new drugs and diagnostic methods. In spite of the advantages inherent to in vitro transformation, it is important to discuss the limitations in take the results achieved from parasites cultured in vitro as representative of those obtained from the natural infection. In present work, schistosomula obtained in vivo and in vitro were compared in their ability to capture fluorescent probes for specific internal structures or surface membranes. The probes showed similar staining in parasite obtained by both methods, mechanical transformation (Mec) and by active skin penetration (Pel). However, differences were observed when those parasites were compared to other obtained in vivo, through the Clegg’s method (Clegg et al., 1965). The membrane permeability was shown to be increased. The data suggest that in schistosomula obtained in vivo and kept inside the skin for a period of time up to 72 hours the metabolism is more active in cells of the surface and, further there is a huge turnover in the surface of the parasite, involving internal molecules and increasing in immunogens release. The increased permeability can also allow it to capture molecules, capable of stimulate the parasite growing. Furthermore, replicates of cDNA libraries obtained from mechanical schistosomula cultured in presence of serum from portal blood (SPO3h, SPO12h) and serum from peripheral blood (SPE3h, SPE12h) of hamster were also compared by using next generation sequencing (NGS) and gene expression analysis of specific genes. After sequencing and statistical analysis of gene expression, it was observed a high similarity among the libraries. When comparing the samples from SPO3h versus SPO12h libraries, 58 genes were found differentially expressed. According to the annotation data of the gene ontology (GO), the differentially expressed genes in schistosomula, after 12 hours of the contact with serum from hamster portal blood, are related to processes important to its development to adult worm. Thereby, this work improved the knowledge of mechanisms evolved in internalization of molecules by the parasite of the intravascular stage, as well as highlighted the regulation of the gene expression when it is within portal venous system of the host, where adult forms are essential for the disease development.

O Atlântico Sul está entre os menos estudados dos oceanos, em relação às suas comunidades microbianas, apesar da importância ecológica e do interesse biotecnológico nos micro-organismos marinhos. Este potencial biotecnológico inclui a produção de enzimas como as lípases de endoglicanases, que podem ser utilizadas na produção de biocombustíveis, no processamento têxtil e na suplementação de detergentes. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o isolamento, identificação filogenética e avaliação das atividades lipolíticas e endoglucanolíticas de bactérias cultivadas de sedimentos do leste do Oceano Atlântico Sul, e de águas da região da Elevação do Rio Grande. Para isto, oito amostras de sedimento e dezesseis de água foram coletadas em novembro de 2009 e novembro de 2011, para as referidas regiões do Oceano Atlântico Sul. Os micro-organismos foram cultivados e identificados pela análise de sequências de genes de RNA ribossômico 16S. Posteriormente, as atividades lipolíticas e endoglucanolíticas foram determinadas em ensaios em placas com diferentes substratos tais como Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 para a atividade lipolítica, e carboximetilcelulose para a atividade endoglucanolítica. No total 212 linhagens foram isoladas e 138 foram identificadas filogeneticamente das duas áreas de estudo, em cinco classes diferentes e trinta gêneros, sendo as classes Gammaproteobacteria e Bacilli as mais freqüentes, assim como os gêneros Halomonas e Bacillus. Os sedimentos apresentaram maior diversidade em nível de espécie, enquanto que nas amostras pelágicas a diversidade foi maior em nível de gênero e classe. Dezoito linhagens isoladas parecem pertencer a espécies ainda não descritas de bactérias. As 212 linhagens foram testadas quanto às atividades enzimáticas. Mais que metade destes organismos apresentou algum tipo de atividade lipolítica, enquanto que a atividade endoglucanolítica foi restrita a dez linhagens. O método de isolamento direto em meio sólido contendo lipídeos foi o mais apropriado para a prospecção de bactérias lipolíticas. Os resultados deste trabalho atestam a necessidade de estudos sobre a microbiota marinha cultivável, bem como seu potencial para a obtenção de enzimas com uso industrial. / The South Atlantic is among the less studied oceans concerning its microbial communities, despite the ecological importance and the biotechnological interest related to marine microorganisms. In this context, the present work aimed the isolation, phylogenetic identification and evaluation of the lipolytic and endoglucanolytic activities of bacteria from sediments of the Eastern South Atlantic and waters from the Rio Grande Rise Region. For this, eight sediment samples and sixteen water samples were collected in two cruises conducted on November/2009 and November/2011 to the specified areas. Microorganisms were cultivated and identified by 16S rRNA sequences analysis. Lipolytic and endoglucanolytic activities were evaluated on plate assays with different substrates (Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 for lypotytic activity, and carboximethilcellulose for endoglucanolytic activity). 138 bacteria were phylogenetically identified from the two studied areas in five different classes and thirty genera. The classe Gammaproteobacteria and Bacilli and the genera Halomonas and Bacillus were the most frequent identified. Higher species-level diversity was detected in sediments, but a higher genus- and class-level diversity was present on waters samples. Eighteen strains seem to belong to no yet described bacterial species. Two hundred and twelve strains were tested for the enzymatic activities. More than a half of the bacteria showed some kind of lipolysis, while the endoglucanolytic activity was restricted to ten strains. The direct isolation in solid media containg a lipidic substrate was the best method to prospect lipolytic bacteria. The results of this work attest the necessity of studies on the cultivable marine microbiota, as well as their potential for the prospection of industrially relevant enzymes.

O Atlântico Sul está entre os menos estudados dos oceanos, em relação às suas comunidades microbianas, apesar da importância ecológica e do interesse biotecnológico nos micro-organismos marinhos. Este potencial biotecnológico inclui a produção de enzimas como as lípases de endoglicanases, que podem ser utilizadas na produção de biocombustíveis, no processamento têxtil e na suplementação de detergentes. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o isolamento, identificação filogenética e avaliação das atividades lipolíticas e endoglucanolíticas de bactérias cultivadas de sedimentos do leste do Oceano Atlântico Sul, e de águas da região da Elevação do Rio Grande. Para isto, oito amostras de sedimento e dezesseis de água foram coletadas em novembro de 2009 e novembro de 2011, para as referidas regiões do Oceano Atlântico Sul. Os micro-organismos foram cultivados e identificados pela análise de sequências de genes de RNA ribossômico 16S. Posteriormente, as atividades lipolíticas e endoglucanolíticas foram determinadas em ensaios em placas com diferentes substratos tais como Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 para a atividade lipolítica, e carboximetilcelulose para a atividade endoglucanolítica. No total 212 linhagens foram isoladas e 138 foram identificadas filogeneticamente das duas áreas de estudo, em cinco classes diferentes e trinta gêneros, sendo as classes Gammaproteobacteria e Bacilli as mais freqüentes, assim como os gêneros Halomonas e Bacillus. Os sedimentos apresentaram maior diversidade em nível de espécie, enquanto que nas amostras pelágicas a diversidade foi maior em nível de gênero e classe. Dezoito linhagens isoladas parecem pertencer a espécies ainda não descritas de bactérias. As 212 linhagens foram testadas quanto às atividades enzimáticas. Mais que metade destes organismos apresentou algum tipo de atividade lipolítica, enquanto que a atividade endoglucanolítica foi restrita a dez linhagens. O método de isolamento direto em meio sólido contendo lipídeos foi o mais apropriado para a prospecção de bactérias lipolíticas. Os resultados deste trabalho atestam a necessidade de estudos sobre a microbiota marinha cultivável, bem como seu potencial para a obtenção de enzimas com uso industrial. / The South Atlantic is among the less studied oceans concerning its microbial communities, despite the ecological importance and the biotechnological interest related to marine microorganisms. In this context, the present work aimed the isolation, phylogenetic identification and evaluation of the lipolytic and endoglucanolytic activities of bacteria from sediments of the Eastern South Atlantic and waters from the Rio Grande Rise Region. For this, eight sediment samples and sixteen water samples were collected in two cruises conducted on November/2009 and November/2011 to the specified areas. Microorganisms were cultivated and identified by 16S rRNA sequences analysis. Lipolytic and endoglucanolytic activities were evaluated on plate assays with different substrates (Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 for lypotytic activity, and carboximethilcellulose for endoglucanolytic activity). 138 bacteria were phylogenetically identified from the two studied areas in five different classes and thirty genera. The classe Gammaproteobacteria and Bacilli and the genera Halomonas and Bacillus were the most frequent identified. Higher species-level diversity was detected in sediments, but a higher genus- and class-level diversity was present on waters samples. Eighteen strains seem to belong to no yet described bacterial species. Two hundred and twelve strains were tested for the enzymatic activities. More than a half of the bacteria showed some kind of lipolysis, while the endoglucanolytic activity was restricted to ten strains. The direct isolation in solid media containg a lipidic substrate was the best method to prospect lipolytic bacteria. The results of this work attest the necessity of studies on the cultivable marine microbiota, as well as their potential for the prospection of industrially relevant enzymes.

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença genética cardíaca primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal, com prevalência estimada em 1:500. Atualmente já foram descobertos 20 genes associados à doença, mas os genes mais frequentemente relacionados são o da Cadeia Pesada da ?-miosina (MYH7), Proteína C de Ligação da Miosina (MYBPC3) e Troponina T (TNNT2). O diagnóstico molecular dos pacientes é importante e custo-efetivo do ponto de vista de saúde pública, além de recomendado pela Sociedade Europeia de Cardiologia. Entretanto, o custo inicial do exame é muito alto, de forma que estudos tentam reduzir esse custo. Uma das propostas descritas utilizou o RNA extraído de leucócitos para sequenciamento com sucesso para o gene MYBPC3. Este trabalho tem como objetivo testar a metodologia de sequenciamento de RNA em larga escala e testar a aplicabilidade da mesma para os genes MYH7 e TNNT2, estimar as principais mutações envolvidas nos pacientes do estudo e estabelecer correlações entre os diferentes genótipos avaliados e os fenótipos dos grupos familiares portadores da doença. Métodos: Os sujeitos incluídos no estudo são portadores de cardiomiopatia hipertrófica nos quais foi feita uma coleta de sangue para extração de DNA e RNA. Foi utilizada nested PCR para amplificação do cDNA e PCR convencional para amplificação de DNA e posterior sequenciamento em sequenciador automático. As análises estatísticas dos dados clínicos foram realizadas utilizando-se ANOVA para comparação de médias e teste exato de Fisher para comparação de frequências. Resultados: O sequenciamento de RNA se mostrou problemático, com baixa taxa de amplificação, falsos positivos e possíveis falsos negativos, de forma que optou-se por utilizar o sequenciamento de DNA para identificação das alterações. Dos 268 pacientes estudados foi identificada uma mutação em 131 deles (48,8%). Das mutações encontradas, 78 (59,5%) estavam no gene MYH7, 50 (38,2%) no gene MYBPC3 e 3 (2,3%) no gene TNNT2. Foram identificadas 69 mutações diferentes, 24 delas ainda não descritas. Pacientes com mutação identificada possuíam em média idade de diagnóstico e idade atual menores, maior frequência cardíaca média e maior frequência de pacientes com taquicardia ventricular não sustentada quando comparados ao grupo sem mutação identificada. Pacientes com mutação no gene MYH7 possuíam maior tamanho de átrio esquerdo, maior frequência de fibrilação atrial e maior frequência de histórico familiar da doença do que pacientes com mutação em MYBPC3. Conclusões: A técnica sequenciamento de RNA extraído de leucócitos não é adequada para uma rotina de rastreamento em larga escala para CH devido à alta frequência de falsos positivos, possibilidade de falsos negativos e baixa taxa de amplificação, mas o sequenciamento de DNA, embora trabalhoso, se mostrou muito sensível para a análise. A identificação de uma mutação específica ainda não pode ser usada para prognóstico de gravidade da CH, mas as comparações de genótipo e fenótipo mostraram algumas relações interessantes que devem ser melhor avaliadas nos pacientes. Este é o primeiro trabalho a caracterizar a epidemiologia molecular da CH em pacientes brasileiros para os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HC) is a primary genetic cardiac disease characterized by left ventricular hypertrophy without dilation, usually asymmetric and predominantly septal, with an estimated prevalence of 1:500. There are 20 genes associated to the HC, but the ones more often related to the disease are ?-myosin heavy chain (MYH7), myosin binding protein C (MYBPC3) and troponin T (TNNT2). The molecular diagnosis of patients is important and cost-effective from the standpoint of public health, and recommended by the European Society of Cardiology. However, the initial cost of the exam is very high, so several studies are attempting to reduce it. One of the proposals described used the RNA extracted from leukocytes for sequencing successfully to the MYBPC3 gene. The present study aims to test the methodology for large-scale sequencing and test it\'s applicability to the MYH7 and TNNT2 genes, to estimate the main mutations involved in the studied patients and establish correlations between their genotypes and phenotypes. Methods: The subjects included in the study were patients previously diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy in whom a blood sample was collected to DNA and RNA extraction. It was used nested PCR for cDNA amplification and conventional PCR for DNA amplification for posterior sequencing on an automatic sequencer. Statistical analyzes of clinical data were performed using ANOVA to compare means and Fisher\'s exact test for frequencies comparison. Results: The RNA sequencing was problematic with low rate of amplification, false positives and possible false negatives, so was used DNA sequencing to identify the mutations. Of the 268 patients studied a mutation was identified in 131 of them (48.8%). Among the mutations found, 78 (59.5%) were in the MYH7 gene, 50 (38.2%) in the MYBPC3 gene and three (2.3%) in the TNNT2 gene. We have identified 69 different mutations, 24 of them not yet described. Patients with an identified mutation had an average smaller age of diagnosis and current age, higher average cardiac frequency and higher frequency of patients with nonsustained ventricular tachycardia compared to those without an identified mutation. Patients with mutations in the MYH7 gene had larger left atrium size, higher frequency of atrial fibrillation and higher frequency of family history of the disease than patients with a mutation in the MYBPC3 gene. Conclusions: The technique of sequencing RNA extracted from leucocytes is not suitable for large scale routine screening for CH due to the high frequency of false positives, possibility of false negatives and low rate of amplification, but the DNA sequencing, though laborious, was very sensitive to the analysis. Identification of a specific mutation cannot yet be used for prognosis of the disease\'s severity, but comparisons of genotype and phenotype have shown some interesting relationships that should be further evaluated. The presente study is the first one to characterize the molecular epidemiology of hypertrophic cardiomyopathy in Brazilian patients for those three more important genes mentioned above

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença genética cardíaca primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal, com prevalência estimada em 1:500. Atualmente já foram descobertos 20 genes associados à doença, mas os genes mais frequentemente relacionados são o da Cadeia Pesada da ?-miosina (MYH7), Proteína C de Ligação da Miosina (MYBPC3) e Troponina T (TNNT2). O diagnóstico molecular dos pacientes é importante e custo-efetivo do ponto de vista de saúde pública, além de recomendado pela Sociedade Europeia de Cardiologia. Entretanto, o custo inicial do exame é muito alto, de forma que estudos tentam reduzir esse custo. Uma das propostas descritas utilizou o RNA extraído de leucócitos para sequenciamento com sucesso para o gene MYBPC3. Este trabalho tem como objetivo testar a metodologia de sequenciamento de RNA em larga escala e testar a aplicabilidade da mesma para os genes MYH7 e TNNT2, estimar as principais mutações envolvidas nos pacientes do estudo e estabelecer correlações entre os diferentes genótipos avaliados e os fenótipos dos grupos familiares portadores da doença. Métodos: Os sujeitos incluídos no estudo são portadores de cardiomiopatia hipertrófica nos quais foi feita uma coleta de sangue para extração de DNA e RNA. Foi utilizada nested PCR para amplificação do cDNA e PCR convencional para amplificação de DNA e posterior sequenciamento em sequenciador automático. As análises estatísticas dos dados clínicos foram realizadas utilizando-se ANOVA para comparação de médias e teste exato de Fisher para comparação de frequências. Resultados: O sequenciamento de RNA se mostrou problemático, com baixa taxa de amplificação, falsos positivos e possíveis falsos negativos, de forma que optou-se por utilizar o sequenciamento de DNA para identificação das alterações. Dos 268 pacientes estudados foi identificada uma mutação em 131 deles (48,8%). Das mutações encontradas, 78 (59,5%) estavam no gene MYH7, 50 (38,2%) no gene MYBPC3 e 3 (2,3%) no gene TNNT2. Foram identificadas 69 mutações diferentes, 24 delas ainda não descritas. Pacientes com mutação identificada possuíam em média idade de diagnóstico e idade atual menores, maior frequência cardíaca média e maior frequência de pacientes com taquicardia ventricular não sustentada quando comparados ao grupo sem mutação identificada. Pacientes com mutação no gene MYH7 possuíam maior tamanho de átrio esquerdo, maior frequência de fibrilação atrial e maior frequência de histórico familiar da doença do que pacientes com mutação em MYBPC3. Conclusões: A técnica sequenciamento de RNA extraído de leucócitos não é adequada para uma rotina de rastreamento em larga escala para CH devido à alta frequência de falsos positivos, possibilidade de falsos negativos e baixa taxa de amplificação, mas o sequenciamento de DNA, embora trabalhoso, se mostrou muito sensível para a análise. A identificação de uma mutação específica ainda não pode ser usada para prognóstico de gravidade da CH, mas as comparações de genótipo e fenótipo mostraram algumas relações interessantes que devem ser melhor avaliadas nos pacientes. Este é o primeiro trabalho a caracterizar a epidemiologia molecular da CH em pacientes brasileiros para os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HC) is a primary genetic cardiac disease characterized by left ventricular hypertrophy without dilation, usually asymmetric and predominantly septal, with an estimated prevalence of 1:500. There are 20 genes associated to the HC, but the ones more often related to the disease are ?-myosin heavy chain (MYH7), myosin binding protein C (MYBPC3) and troponin T (TNNT2). The molecular diagnosis of patients is important and cost-effective from the standpoint of public health, and recommended by the European Society of Cardiology. However, the initial cost of the exam is very high, so several studies are attempting to reduce it. One of the proposals described used the RNA extracted from leukocytes for sequencing successfully to the MYBPC3 gene. The present study aims to test the methodology for large-scale sequencing and test it\'s applicability to the MYH7 and TNNT2 genes, to estimate the main mutations involved in the studied patients and establish correlations between their genotypes and phenotypes. Methods: The subjects included in the study were patients previously diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy in whom a blood sample was collected to DNA and RNA extraction. It was used nested PCR for cDNA amplification and conventional PCR for DNA amplification for posterior sequencing on an automatic sequencer. Statistical analyzes of clinical data were performed using ANOVA to compare means and Fisher\'s exact test for frequencies comparison. Results: The RNA sequencing was problematic with low rate of amplification, false positives and possible false negatives, so was used DNA sequencing to identify the mutations. Of the 268 patients studied a mutation was identified in 131 of them (48.8%). Among the mutations found, 78 (59.5%) were in the MYH7 gene, 50 (38.2%) in the MYBPC3 gene and three (2.3%) in the TNNT2 gene. We have identified 69 different mutations, 24 of them not yet described. Patients with an identified mutation had an average smaller age of diagnosis and current age, higher average cardiac frequency and higher frequency of patients with nonsustained ventricular tachycardia compared to those without an identified mutation. Patients with mutations in the MYH7 gene had larger left atrium size, higher frequency of atrial fibrillation and higher frequency of family history of the disease than patients with a mutation in the MYBPC3 gene. Conclusions: The technique of sequencing RNA extracted from leucocytes is not suitable for large scale routine screening for CH due to the high frequency of false positives, possibility of false negatives and low rate of amplification, but the DNA sequencing, though laborious, was very sensitive to the analysis. Identification of a specific mutation cannot yet be used for prognosis of the disease\'s severity, but comparisons of genotype and phenotype have shown some interesting relationships that should be further evaluated. The presente study is the first one to characterize the molecular epidemiology of hypertrophic cardiomyopathy in Brazilian patients for those three more important genes mentioned above