Gene expression is the conduit by which genetic information is connected into cellular phenotypes. Recently, it was shown that gene expression in mammalian cells is governed, at least in part, by the expression of short double stranded RNA (dsRNA). This mode of gene regulation is influenced by a large group of dsRNA binding proteins that could either stabilize or trigger the degradation of dsRNA. Indeed, double stranded RNA (dsRNA) specific ribonucleases (RNases) play an important role in regulating gene expression. In most eukaryotes, members of the dsRNA specific RNase III family trigger RNA degradation and initiate cellular immune response. Disruption of human . RNase III (Dicer) deregulates fetal gene expression and promotes the development of cancer. However, very little is known about the housekeeping function of eukaryotic RNase III and the mechanism by which they distinguish between exogenous and endogenous cellular RNA species. This thesis elucidates how dsRNAs are selected for cleavage and demonstrates their contribution to RNA metabolism in yeast as model eukaryote. Initially, the reactivity determinants of yeast RNase III (Rnt1p) were identified in vitro and used to study the global impact of Rnt1p on the processing of non-coding RNA. The results indicate that Rnt1p is required for the processing of all small nucleolar RNAs (snoRNAs) involved in rRNA methylation and identify a new role of Rnt1p in the processing of intronic snoRNAs. It was shown that Rnt1p cleavage helps to coordinate the expression of some ribosomal protein genes hosting intronic snoRNAs. Direct snoRNA processing from the pre-mRNA blocks the expression of the host gene, while delayed snoRNA processing from the excised intron allows the expression of both genes. In this way, the cell can carefully calibrate the amount of snoRNA and ribosomal proteins required for ribosome biogenesis. In addition, a global analysis of snoRNA processing identified new forms of Rnt1p cleavage signals that do not exhibit a conserved sequence motif but instead use a new RNA fold to recruit the enzyme to the cleavage site. This finding led to the conclusion that Rnt1p may use a wide combination of structural motifs to identify its substrates and thus increases the theoretical number of potential degradation targets in vivo . To evaluate this possibility, a new search for snoRNA independent Rnt1p cleavage targets was performed. Interestingly, many Rnt1p cleavage signals were identified in intergenic regions devoid of known RNA transcripts. In vivo , it was shown that Rnt1p induce the termination of non-polyadenylated transcripts and functions as a surveillance mechanism for transcription read-through. This finding directly links Rnt1p to the transcription machinery and provides a new mechanism for polyadenylation independent transcription termination. Together the work described in this thesis presents an example of how eukaryotic RNase III may identify its substrates and present a case study where transcription, RNA processing and stability are linked.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il est connu chez la levure Saccharomyces cerevisiae que la dégradation nucléaire est surtout impliquée dans les mécanismes de surveillance de la qualité des ARNs. Parmi les ribonucléases nucléaires, il existe l'endoribonucléase Rnt1p qui possède plusieurs fonctions notamment dans la maturation de l'ARN ribosomal. Cependant, sa délétion causait des défauts dans la progression du cycle cellulaire ainsi qu'une sensibilité à la température. Ces défauts ont été associés à deux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire HSL1 et SW14. L'analyse des niveaux d'ARNm de ces deux gènes a montré que ces derniers étaient surexprimés en absence de RNT1 et que l'ajout de Rnt1p recombinant à des extraits d'ARNm provenant d'une souche rntl [delta] provoquait une diminution de l'ARNm mature. Le rôle de Rnt1p dans la régulation de ces deux gènes a également été confirmé par des expériences analysant les niveaux des protéines encodées par ces gènes. La protéine Hsl1p étant impliquée dans le contrôle de la morphogénèse et donc du cycle cellulaire, et étant donné que la localisation de Rnt1p est également dépendante de celui ci, nous avons voulu examiner la possibilité que Rnt1p régule Hsl1p de façon dépendante du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons examiné l'impact de la délétion de Rnt1p sur l'expression de Hsl1p dans les différentes phases du cycle cellulaire. Par ailleurs, puisque Hsl1p possède deux fonctions à la fois dans le contrôle de la morphogénèse mais aussi dans la réponse au stress des parois, nous avons décidé d'étudier sa distribution dans le cycle cellulaire mais aussi l'impact de la régulation posttranscriptonnelle sur l'expression et la localisation de son ARNm dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons testé l'impact de trois délétions de ribonucléases nucléaires (Rnt1p et Rrp6p) et cytoplasmique (Xrnlp) afin de comprendre quel niveau de régulation était le plus important dans l'expression de l'ARNm Hsll. Nous avons utilisé pour cela une technique très sensible appelée FISH (fluorescent in situ hybridization) qui permet de détecter des ARNm individuels au sein de la cellule et d'en calculer le nombre dans chaque phase du cycle et dans chaque compartiment cellulaire (noyau et cytoplasme). Nos résultats ont montré que Rnt1p jouait un rôle très important dans l'expression et la localisation cycle cellulaire-dépendante de l'ARNm Hsll avec un impact marqué au niveau de la phase G2/M, alors que les autres délétions n'avaient pas d'effet sur l'expression cyclique de l'ARNm Hsl1.

Les endoribonucléases III sont conservées chez tous les eucaryotes. Ils jouent un rôle important dans le cycle de vie des acides ribonucléiques (ARN) que ce soit au niveau de leur maturation, leur régulation ou leur dégradation. Cependant, seul un petit nombre d'ARN ciblés par les ribonucléases (RNases) III sont connus et les motifs reconnus par l'enzyme sont encore mal caractérisés. Actuellement, la découverte de nouvelles cibles repose principalement sur la validation in vitro de gènes individuels. Il est important d'avoir une vue d'ensemble des cibles des RNases III pour comprendre le rôle de la dégradation spécifique des ARN dans le métabolisme cellulaire. Ainsi, cette thèse a comme objectif de développer des approches haut débit pour permettre une identification plus rapide des cibles tout en minimisant l'utilisation des ressources expérimentales. Elle présente l'utilisation combinée d'approches bio-informatiques, d'étude génétique de l'expression et de traitement in vitro dans le but d'avoir un portrait global des cibles de l'endoribonucléase III. Elle a aussi comme but d'identifier les motifs d'ARN non codants qui guident la reconnaissance par l'endoribonucléase III. Les principaux accomplissements de cette recherche sont : le développement de nouveaux algorithmes de prédiction des cibles de la RNase III, la détection de deux nouvelles classes de transcrits dont l'expression est dépendante de la RNase III, l'identification de quelques centaines de nouvelles cibles de la RNase III, la production d'un catalogue plus complet des motifs coupés par la RNase III et l'identification de nouvelles catégories de motifs coupées par la RNase III. Le tout procure un portrait global de l'impact de la RNase III sur le transcriptome et le cycle de vie des ARN. De plus, ce travail montre comment une approche intégrée incluant la recherche in silico, in vivo et in vitro permet de mieux comprendre le rôle d'un enzyme dans la cellule et comment chaque approche peut pallier les déficiences des autres approches et fournir globalement des résultats plus complets.

Résumé : Chez toutes les cellules, une modulation précise de l’expression des gènes est essentielle afin de réguler adéquatement leur métabolisme et de s’adapter aux changements environnementaux. En effet, c’est l’expression des gènes, plutôt que la séquence d’ADN, qui détermine en grande partie la diversité et la complexité des organismes. Celle-ci dépend principalement des changements dans les niveaux d’ARNs cellulaires résultant de la modification de l’équilibre entre leurs taux relatifs de synthèse et de dégradation. Alors que la régulation transcriptionnelle a été largement étudiée par le passé, des études récentes révèlent que la stabilité de l’ARN joue aussi un rôle important dans le modelage du transcriptome. Toutefois, les mécanismes qui assurent la dégradation précise et sélective des ARNs sont globalement mal compris. Au cours de cette thèse, j’ai utilisé la ribonucléase III de levure Saccharomyces cerevisiae (Rnt1p) comme modèle pour étudier comment des transcrits spécifiques sont ciblés pour la dégradation et évaluer sa contribution à la régulation de l’expression génique. Les résultats indiquent que Rnt1p régule l’expression des gènes en utilisant une spécificité élargie pour des structures tige-boucles d’ARN. En effet, un nouveau motif structurel de Rnt1p permet la discrimination des tige-boucles ayant une séquence spécifique tout en bloquant la liaison à des hélices génériques d’ARN double-brin. D’un autre côté, l’identification des signaux de dégradation de Rnt1p à l’échelle du transcriptome a permis de révéler plus de 384 transcrits clivés par Rnt1p, dont la majorité sont des ARN messagers. En outre, l’impact de la délétion de RNT1 sur l’expression de ces gènes est influencé par les conditions de culture des cellules, ce qui suggère que Rnt1p est un important régulateur conditionnel de l’expression génique. Somme toute, les résultats présentés dans cette thèse démontrent comment des ARNs sont spécifiquement choisis pour la dégradation et soulignent l’importance de la dégradation nucléaire dans la régulation de l’expression génique en réponse à des changements environnementaux. // Abstract : Precise modulation of gene expression is essential for any cell in order to regulate its metabolism and adapt to environmental changes. In fact, it is gene expression, rather than DNA sequence alone, which mostly explains the functional diversity and complexity between the different cell types. As such, gene expression mainly results from changes in the levels of cellular RNAs which are, in turn, dependent on the equilibrium between their relative rates of synthesis and degradation. While transcriptional control has been largely studied in the past, recent publications reveal that changes in RNA stability also play an important role in shaping the transcriptome. Unfortunately though, the mechanisms ensuring precise and selective RNA degradation remains poorly understood. In this thesis, I have used the yeast Saccharomyces cerevisiae ribonuclease III (Rnt1p) as a model to study how specific transcripts are targeted for degradation and evaluate its contribution to the regulation of gene expression. The results indicate that Rnt1p regulates gene expression using a broad specificity for structured RNA stem loops. Indeed, a new structural motif of Rnt1p permits discrimination of hairpins with specific sequence while blocking the binding of the generic RNA duplexes recognized by other members of the RNase III family. This highly specific mode of substrate recognition was found to be easily modulated by a flexible network of protein RNA interactions. On the other hand, transcriptome-wide identification of Rnt1p degradation signals uncovered more than 384 transcripts, including 291 mRNAs. Interestingly, the impact of RNT1 deletion on mRNA expression is modulated by changes in the growth conditions of the cell, indicating that Rnt1p is an important regulator of conditional gene expression. Overall, the results presented in this thesis demonstrate how specific RNAs are selected for degradation and highlight the importance of nuclear RNA decay for fine tuning gene expression in response to changes in growth conditions.