Les métastases osseuses sont des complications de nombreux cancers tels que le cancer du poumon, du sein et de la prostate. Chez la femme, 70% des patientes présentant un cancer du sein avancé développent des métastases principalement ostéolytiques. Ce type de métastases est associé à une destruction importante de l'os causant chez les patientes des douleurs osseuses et des fractures pathologiques. Les traitements actuellement dispensés tels que les bisphosphonates et le denosumab ne sont pas curatifs mais seulement palliatifs, il est donc indispensable d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la progression métastatique afin d'améliorer le pronostic et d'imaginer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, une analyse transcriptomique comparative a montré que les gènes codant les récepteurs de guidage axonal ROBO1 et ROBO4 étaient surexprimés dans une sous-population de cellules de cancer du sein MDA-MB-231 qui métastasent spécifiquement à l'os (nommée B02). De manière intéressante, une expression élevée de ROBO4 dans les tumeurs primaires de patientes atteintes d'un cancer du sein corrèle avec un mauvais pronostic et un risque accru de rechute à l'os. Chez la souris, une réduction de 50% de la charge tumorale a été observée lorsque les cellules B02 déplétées en ROBO4 ont été inoculées dans la glande mammaire de souris ; et le ciblage des cellules parentales B02 avec un anticorps anti-ROBO4 avant l'injection intra-tibiale diminue l'incidence de la formation de colonies de cellules tumorales. In vitro, la co-culture des cellules B02 avec des cellules ostéoblastiques murines MC3T3-E1 a entraîné une augmentation de la production de SLIT2, le ligand naturel des récepteurs ROBO, par les cellules MC3T3-E1. De plus, le traitement avec un anticorps anti-ROBO4 réduit considérablement l'adhésion des cellules B02 sur les cellules MC3T3-E1. Par ailleurs, la surexpression de ROBO4 dans d'autres modèles cellulaires de cancer du sein a conduit à mettre en évidence la présence d'une glycoforme de ROBO4. L'étude des deux isoformes de ROBO4 (glycosylée et non glycosylée) a révélé le caractère agressif de la forme non glycosylée comparée à la forme glycosylée / Bone metastasis is a complication of many cancers such as lung, breast and prostate. In women, 70% of patients with advanced breast cancer predominantly develop osteolytic metastases. This type of metastasis is associated with significant bone destruction in patients causing bone pain and pathological fractures. The current treatments, such as bisphosphonates and denosumab, are not curative but only palliative, so it is essential to identify new factors involved in the metastatic progression to improve prognosis and to devise new therapeutic approaches. In this context, a comparative transcriptomic analysis demonstrated that axon guidance ROBO1 and ROBO4 receptors were overexpressed in a subpopulation of MDA-MB-231 breast cancer cells that only metastasize to bone (referred to as B02). Interestingly, high ROBO4 expression in primary tumors from patients with breast cancer correlated with poor prognosis and increased risk of relapse to bone. In mice, a 50% reduction in tumor burden was observed when ROBO4-depleted B02 cells were inoculated in the mammary fat pad of mice; and targeting of parental B02 cells with an anti-ROBO4 antibody before intra-tibia inoculation decreased the incidence of tumor cell colony formation. In vitro, the co-culture of B02 cells with murine MC3T3-E1 osteoblastic cells increased SLIT2 production, the primary ligand of ROBO receptors, by MC3T3 cells. Further, the treatment with an anti-ROBO4 antibody dramatically reduced B02 cell adhesion to MC3T3-E1 cells. Moreover, over-expression of ROBO4 in other models of breast cancer led to the discovery of a glycoform of ROBO4. The study of the two ROBO4 isoforms (glycosylated and non-glycosylated) revealed the aggressive nature of the non-glycosylated form compared to the glycosylated form. These results provide strong evidence that the axon guidance receptor ROBO4 is involved in bone metastasis formation and that the use of an antibody directed against the non-glycosylated form of this receptor could lead to the development of innovative therapies to prevent metastasis formation in the bone marrow

Les métastases osseuses sont des complications fréquentes de nombreux cancers tels que le cancer du poumon, de la prostate et du sein. Chez la femme, 70% des patientes présentant un cancer du sein avancé développent des métastases qualifiées d’ostéolytiques. Le développement de ce type de métastases entraine la destruction massive de l’os causant chez les patientes des fractures pathologiques. Les traitements actuellement dispensés en clinique tels que les bisphosphonates et le dénosumab (anti-RANKL) ne sont pas curatifs mais seulement palliatifs. Pour cette raison, notre laboratoire s’intéresse particulièrement aux évènements moléculaires et cellulaires précoces aboutissant à l’émergence de métastases osseuses. Les récepteurs Roundabout (ROBO) ont été initialement décrits comme des régulateurs cruciaux de la migration neuronale et vasculaire lors du développement. ROBO4 est le dernier récepteur décrit et diverge des autres récepteurs ROBO, notamment par son expression spécifique et limitée aux cellules endothéliales et hématopoïétiques. Toutefois, lors d’une analyse transcriptomique comparative le récepteur ROBO4 a été retrouvé surexprimé dans la lignée tumorale ostéotropique MDA-B02. Les récentes expériences, réalisées par notre équipe, visant à inhiber l’activité du récepteur ROBO4, nous ont permis de considérer le récepteur ROBO4 comme un médiateur de l’ancrage à l’os des cellules tumorales MDA-B02. En effet, L’utilisation d’un anticorps anti-ROBO4 réduit considérablement l'adhérence des cellules MDA-B02 sur les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 in vitro et l’ancrage à l’os in vivo. La surexpression de ROBO4 dans un modèle cellulaire de cancer du sein murin nous a conduit à mettre en évidence la présence de deux formes de la protéine ROBO4 aux propriétés antagonistes : (i) une forme glycosylée détectée exclusivement dans les cellules endothéliales et (ii) une forme non glycosylée, issue d’un transcrit alternatif et présente en forte quantité dans les cellules tumorales MDA-B02. L’identification d’un variant protéique du récepteur ROBO4 aux propriétés fonctionnelles et structurales différentes nous a permis d’envisager de nouvelles pistes dans le décryptage des fonctions de ROBO4 dans le processus tumoral et pourrait conduire à la mise au point de thérapies innovantes pour empêcher la formation de métastases dans la moelle osseuse / Bone metastases are frequent complications of many cancers such as lung, prostate and breast cancer. In women, 70% of patients with advanced breast cancer develop metastases known as osteolytic. The development of this type of metastasis leads to the mass destruction of bone causing pathological fractures in patients. Current clinical treatments such as bisphosphonates and denosumab (anti-RANKL) only slow the progression of the disease. For this reason, our laboratory is particularly interested in early molecular and cellular events leading to the emergence of bone metastases. Roundabout receptors (ROBO) were initially described as crucial regulators of neuronal and vascular migration during development. ROBO4 is the last receptor described and diverges from other ROBO receptors, in particular by its specific expression and limited to endothelial and hematopoietic cells. However, in a comparative transcriptomic analysis, the ROBO4 receptor was found to be overexpressed in the MDA-B02 osteotropic tumor line. Recent experiments carried out by our team, aiming at inhibiting the activity of the ROBO4 receptor, allowed us to consider the ROBO4 receptor as a mediator of MDA-B02 tumor cells anchorage to the bone. Indeed, the use of an anti-ROBO4 antibody considerably reduces the adhesion of the MDA-B02 cells to the MC3T3-E1 osteoblastic cells in vitro and the anchoring to the bone in vivo. Overexpression of ROBO4 in a murine breast cancer cell model led us to demonstrate the presence of two forms of the ROBO4 protein with antagonistic properties: (i) a glycosylated form detected exclusively in endothelial cells and (ii) one unglycosylated form derived from an alternative transcript and present in high amounts in MDA-B02 tumor cells. The identification of a protein variant of the ROBO4 receptor with different functional and structural properties has allowed us to consider new opportunities in decoding the functions of ROBO4 in the tumor process and could lead to the development of innovative therapies to prevent the formation of metastases in the bone marrow

Les taux de guérison du cancer du sein sont en progression constante, toutefois l’apparition de métastases osseuses contribue à la morbidité et à la mortalité des femmes à un stade avancé et les traitements actuels ne sont que palliatifs. Afin de prévenir les métastases osseuses, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent les événements cellulaires précédant l'apparition de lésions squelettiques. Dans ce but, une analyse transcriptomique comparative a été réalisée entre une lignée de cellules de cancer du sein humaines MDA-MB-231 qui dissémine dans plusieurs organes sans site préférentiel, et une sous-population ostéotropique, les cellules B02, qui métastasent uniquement dans les os. Par comparaison à la lignée MDA-MB-231, les cellules B02 surexpriment Roundabout 4 (ROBO4), codant un récepteur cellulaire membranaire, appartenant à la famille des récepteurs de guidage axonal Roundabout. Physiologiquement, ROBO4 est impliqué dans l'angiogenèse, l'intégrité des vaisseaux sanguins et la migration des cellules souches hématopoïétiques dans la niche ostéoblastique. Afin de déterminer si ROBO4 peut, également, jouer un rôle de médiateur dans la localisation des cellules tumorales au sein de la moelle osseuse, nous avons invalidé ROBO4 dans les cellules B02 en utilisant une stratégie CRISPR / Cas9. In vivo, l'injection orthotopique de cellules B02 KO ROBO4 a entraîné la formation de tumeurs plus petites par rapport à celles formées par les cellules B02. De même, dans les os, on observe une forte diminution de la croissance tumorale et de l’étendue de l’ostéolyse. Des protocoles à court-terme de formation de micro-métastases ont également montré un rôle de ROBO4 dans les étapes précoces de la colonisation osseuse, probablement en agissant sur l'ancrage et/ou la survie des cellules tumorales. De plus, la colonisation d’une niche ostéoblastique humanisée implantée en sous-cutanée chez des souris NOD / SCID, par les cellules B02 KO ROBO4 a également été nettement réduite en comparaison aux cellules B02. Par conséquent, ROBO4 intervient dans la dissémination osseuse précoce de cellules cancéreuses du sein et dans la formation tumorale. In vitro, l’interaction des cellules B02 KO ROBO4 avec les cellules résidentes de la moelle osseuse est réduite par rapport à celle observée avec les cellules parentales B02. Les co-cultures de cellules B02 ou B02 KO ROBO4 en suspension avec les cellules de la moelle osseuse, conduisent à la formation de mammosphères hétérotypiques. Cependant, leurs tailles sont considérablement réduites suite à l'inhibition de ROBO4. Des résultats similaires sont observés lors de la culture homotypique de cellules B02 ou B02 KO ROBO4. On observe également une importante réduction de l’agrégation cellulaire lorsque ROBO4 est inhibée, suggérant un rôle de ROBO4 dans l’interaction cellulaire. De plus, les cellules B02 KO ROBO4 sont plus petites et plus isolées que les cellules B02 parentales, comme le montre l'analyse du cytosquelette d'actine. Ces résultats nous permettent d’émettre l’hypothèse que ROBO4 est une molécule d’adhérence jouant un rôle important dans la cohésion des cellules tumorales et dans l’interaction des cellules cancéreuses avec les cellules du microenvironnement osseux. De façon intéressante, l’inhibition de ROBO4, par utilisation d’un anticorps anti-ROBO4, réduit également la formation de sphéroïdes et la colonisation osseuse des cellules B02. L’ensemble de ces résultats suggèrent que ROBO4 pourrait être une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de tumeur primitive du sein et des métastases osseuses / The cure rates of breast cancer are steadily increasing; however, the occurrence of bone metastases contributes to the morbidity and mortality of women at an advanced stage and current treatments are only palliative. In order to prevent bone metastasis, it is vital to increase our understanding of the molecular mechanisms that control cellular events preceding the development of overt skeletal lesions. A comparative transcriptional analysis was performed between human MDA-MB-231 breast cancer cells that spread to several organs in animals, and a sub-population of the MDA-MB-231 cell line (B02) that metastasis only to bones. Compared to MDA-MB-231, B02 cells overexpress Roundabout 4 (ROBO4), encoding a cell surface receptor belonging to the Roundabout family of axonal guidance receptors. ROBO4 is involved in angiogenesis, blood vessel integrity and homing of hematopoietic stem cells in the osteoblastic niche. To determine whether ROBO4 could also mediate the homing of tumour cells in the bone marrow, we invalidate ROBO4 in B02 cells using a CRISPR/Cas9 strategy (KO ROBO4 B02). In vivo, orthotopic injection of KO ROBO4 B02 cells leads to smaller primary tumours compared to the ones formed by B02 control cell line. Moreover, in bone, ROBO4 invalidation induces a strong decrease of tumour growth, osteolysis occurrence and micrometastasis formation. Short-term protocols show the involvement of ROBO4 in the early-step of bone colonisation, probably by acting in tumour cell anchorage and/or survival. Furthermore, compared to B02 cells, the homing of KO ROBO4 B02 cells in a humanized osteoblastic niche implanted subcutaneously in NOD/SCID mice is also markedly reduced. Therefore, ROBO4 is involved in the early bone marrow dissemination of breast cancer cells and in tumor formation. According to this result, in vitro, the interaction of KO ROBO4 B02 cells with bone marrow resident cells is decreased, compared to what is observe with parental B02 cells. After the co-culture of B02 or KO ROBO4 cells in suspension with bone marrow resident cells, they both form heterotypic mammospheres. However, their size is substantially reduced in the absence of ROBO4. Similar findings were observed in homotypic culture of B02 or KO ROBO4 cells. An important decrease of tumor cell aggregation is also observed when ROBO4 is inhibited, suggesting a role of ROBO4 in cell interaction. Moreover, KO ROBO4 B02 cells are smaller and more isolated than parental B02 cells, as shown in actin cytoskeletal analysis. Altogether, these results provide strong evidence that ROBO4 is an adherent molecule which plays a crucial role in tumour cell cohesion and in the interaction of cancer cells with bone cells component. Interestingly, ROBO4 inhibition, using an anti-ROBO4 antibody, also reduces spheroid formation and bone colonization of B02 cells. Taken together, these results suggest ROBO4 as a new potential therapeutic target to treat primary breast tumours and bone metastasis